專利名稱：抗凍蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗凍蛋白質(zhì)、作為其活性部分的多肽、包含所述抗凍蛋白質(zhì)或多肽的組合物、食品、生物體樣品保護劑和化妝品、以及與所述抗凍蛋白質(zhì)或多肽特異性反應(yīng)的抗體。
背景技術(shù)：
抗凍蛋白質(zhì)是亦稱作不凍蛋白質(zhì)或AFP(抗凍蛋白質(zhì)(antifreeze protein))的物質(zhì)。常規(guī)的抗凍蛋白質(zhì)顯示出抑制冰結(jié)晶化和控制冰結(jié)晶形狀等的效果，并伴有熱滯活性。在此，熱滯是指在蛋白質(zhì)水溶液中，即使在平衡融點以下的溫度、冰也不能生長的溫度范圍，如果將冰在水溶液中開始生長的溫度定義為凝固點，則熱滯作為平衡融點和凝固點之間的差被測出。 抗凍蛋白質(zhì)是吸附在冰結(jié)晶表面上發(fā)揮上述作用的物質(zhì)，用于在生物體中保護自身免受細胞凍結(jié)。這種抗凍蛋白質(zhì)已經(jīng)在例如魚類、昆蟲、植物、菌類、微生物等中被發(fā)現(xiàn)(專利文獻廣2，非專利文獻廣4)。然而，至今為止報道的抗凍蛋白質(zhì)在魚類、昆蟲、植物、菌類、細菌等生物體內(nèi)僅微量存在，提取效率非常差，即使大量存在，也存在著生物體本身難以捕獲和培養(yǎng)的問題，因此難以通過工業(yè)生產(chǎn)并作為食品用途而使用。因此，作為提供在一整年內(nèi)穩(wěn)定且廉價的具有抗凍活性的抗凍蛋白質(zhì)的方法，提出用水等對低溫保存的蘿卜苗進行提取的方法(專利文獻3)。但是，用專利文獻3中公開的方法得到的抗凍蛋白質(zhì)，未必具有足夠的抗凍活性。現(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻I :日本特開2004-24237號公報專利文獻2 日本特開2004-275008號公報專利文獻3 :日本特開2007-153834號公報非專利文獻非專利文獻I :生物物理，第43卷，第3號，第13(Tl35頁(2003年)非專利文獻2 :Plant Physiology (Plant Physiology),第 119 卷，第 1361 1369 頁(1999 年)非專利文獻3 Biochem. J. (Biochemcal. Journal)，第 340 卷，第 385 391 頁(1999年)非專利文獻4 :Can. J. Microbiol. (Canadian Journal of Microbiology),第 144卷，第6頁(1998年)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題
本發(fā)明的目的在于提供具有優(yōu)異的抗凍活性的抗凍蛋白質(zhì)，其可在工業(yè)水平高效且廉價地進行生產(chǎn)，安全且適于實用。此外，本發(fā)明的目的在于提供作為所述抗凍蛋白質(zhì)的活性部分的多肽、包含所述抗凍蛋白質(zhì)或多肽的組合物、食品、生物體樣品保護劑和化妝品、以及與所述抗凍蛋白質(zhì)或多肽特異性反應(yīng)的抗體。解決問題的方法本發(fā)明人等為了解決上述問題進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了具有非常高的抗凍活性的、來源于植物的蛋白質(zhì)，由此完成本發(fā)明。本發(fā)明涉及的第一抗凍蛋白質(zhì)來源于植物，并且包含下述(1Γ(4)中的任意蛋白質(zhì)中的至少一種，(I)具有序列號I的氨基酸序列、并且通過SDS-PAGE測定的分子量為19，000±200Da 的蛋白質(zhì)， (2)具有序列號2的氨基酸序列、并且通過SDS-PAGE測定的分子量為22，000±250Da 的蛋白質(zhì)，(3)通過SDS-PAGE測定的分子量為59，000±600Da、其N末端接受了修飾的蛋白質(zhì)，(4)上述(1) (3)中的任意蛋白質(zhì)的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或多個氨基酸、并且具有抗凍活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明涉及的第二抗凍蛋白質(zhì)，其為植物種子蛋白質(zhì)。本發(fā)明涉及的多肽為將上述的本發(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)解離所得到的物質(zhì)，并且具有抗凍活性。本發(fā)明涉及的抗體與上述的本發(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)和/或上述的本發(fā)明涉及的多肽特異性反應(yīng)。并且，本發(fā)明涉及的組合物、食品、生物體樣品保護劑和化妝品包含上述的本發(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)和/或上述本發(fā)明涉及的多肽。本發(fā)明涉及的抗凍方法包含如下工序?qū)⑸鲜龅谋景l(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)和/或上述的本發(fā)明涉及的多肽添加至溶液中。本發(fā)明涉及的上述本發(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)和/或上述本發(fā)明涉及的多肽用于抑制冰結(jié)晶化的用途。
具體實施例方式以下，對本發(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)進行說明。需要說明的是，在本申請中，本發(fā)明涉及的第一抗凍蛋白質(zhì)和第二抗凍蛋白質(zhì)有時均被稱作本發(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)。本發(fā)明涉及的第一抗凍蛋白質(zhì)來源于植物，并且包含下述(1Γ(4)中的任意蛋白質(zhì)中的至少一種，(I)具有序列號I的氨基酸序列、并且通過SDS-PAGE測定的分子量為19，000±200Da 的蛋白質(zhì)，(2)具有序列號2的氨基酸序列、并且通過SDS-PAGE測定的分子量為22，000±250Da 的蛋白質(zhì)，(3)通過SDS-PAGE測定的分子量為59，000±600Da、其N末端接受了修飾的蛋白質(zhì)，(4)上述(1Γ(3)中的任意蛋白質(zhì)的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或多個氨基酸、并且具有抗凍活性的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，抗凍蛋白質(zhì)廣義上是指具有阻礙冰結(jié)晶生長的功能的蛋白質(zhì)。只要是通過冰結(jié)晶結(jié)構(gòu)的觀察、測定抑制冰結(jié)晶生長的特性等公知的任意方法，表現(xiàn)出抗凍活性的抗凍蛋白質(zhì)，則包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。以下，對本發(fā)明涉及的第一抗凍蛋白質(zhì)的性狀進行詳細地說明。所述抗凍蛋白質(zhì)包含用 SDS-PAGE 測量分子量為 19，000±200Da、22, 000±250Da、或 59，000±600Da 的蛋白質(zhì)中的至少一種。分子量為19，000±200Da的蛋白質(zhì)具有與序列號I的氨基酸序列實質(zhì)相同的氨基酸序列，分子量為22，000±250Da的蛋白質(zhì)具有與序列號2的氨基酸序列實質(zhì)相同的氨基酸序列，分子量為59，000 土 600Da的蛋白質(zhì)接受了某些N末端修飾。在此，氨基酸序列實質(zhì)相同是指氨基酸序列的至少80%以上，優(yōu)選90%以上，進一步優(yōu)選95%以上，進一步優(yōu)選 98%以上，最優(yōu)選100%重復(fù)。另外，本發(fā)明涉及的第一抗凍蛋白質(zhì)也可包含上述任意蛋白質(zhì)的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或多個氨基酸、并且具有抗凍活性的蛋白質(zhì)。在上述氨基酸序列中，作為缺失、取代或添加的氨基酸數(shù)，優(yōu)選I以上且3以下，進一步優(yōu)選I或2，特別優(yōu)選I。只要包含上述氨基酸序列，蛋白質(zhì)可以為由單一亞基構(gòu)成的單體，由多個亞基構(gòu)成的復(fù)合物，或包含復(fù)合物一部分的物質(zhì)。在此，亞基是指例如在二硫蘇糖醇等還原劑的存在下，用SDS-PAGE對蛋白質(zhì)進行分析時，以各個低分子帶的形式被確認(rèn)，是由蛋白質(zhì)解離得到的多肽。本發(fā)明中的具有抗凍活性是指在該蛋白質(zhì)溶液中，通過阻礙冰結(jié)晶化而控制冰結(jié)晶形狀，從而具有抑制冰結(jié)晶生長或粗大化的活性。更具體而言，本發(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)通過結(jié)合到冰結(jié)晶的結(jié)晶面上而抑制冰結(jié)晶的生長。這時，與不存在本發(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)的情況相比，冰結(jié)晶的形狀可能會有變化。另外，該結(jié)合通過阻礙自由水進一步結(jié)合在冰結(jié)晶上，從而抑制冰的結(jié)晶化。本發(fā)明涉及的第一抗凍蛋白質(zhì)，在pH8. O的條件下，作為通過使用了陰離子交換樹脂的色譜法的吸附級分而獲得。另外，在丙酮濃度30體積％以下，適當(dāng)?shù)爻恋?。在此作為陰離子交換體并無特別限定，例如，可列舉DEAE(二乙氨基乙基)和Q(季銨離子)等。此夕卜，丙酮沉淀的上限濃度優(yōu)選為80體積％以下，進一步優(yōu)選60體積％以下，非常優(yōu)選40體積％以下，最優(yōu)選30體積％以下。本發(fā)明涉及的第一抗凍蛋白質(zhì)，可從植物中獲得。作為植物并無特別限定，例如，可列舉屬于十字花科、傘形科、百合科和菊科的植物。屬于十字花科的植物可列舉白菜、蘿卜、西蘭花、青梗菜(子>寸^)、油菜、蕪菁、甜菜、野澤菜(野沢菜)、廣島菜(広島菜)、水菜和芥菜等。屬于傘形科的植物可列舉胡蘿卜等，屬于百合科的植物可列舉蔥等，屬于菊科的植物可以列舉茼蒿(Garland chrysanthemum春菊)等。也可以適當(dāng)使用上述植物的類似品種和改良品種。本發(fā)明的冰結(jié)晶化抑制物質(zhì)并無特別限定，例如可從蘿卜種子中適當(dāng)獲得。作為蘿卜種類并無特別限定，例如可例示蘿卜、藍花子(〃 K〕>)、野蘿卜(V夕M - >)。另外，如果使用上述植物的芽，特別是使用作為蘿卜芽的蘿卜苗，則可高效率地獲得本發(fā)明涉及的第一抗凍蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，“類似品種”是指例如，科的類似品種為即便是屬于相同屬的植物，在學(xué)術(shù)分類中也稱作相近屬的品種，具體植物的類似品種為即便是屬于相同科的植物，在學(xué)術(shù)分類中也稱作相近科的品種。另外，“改良品種”是指通過人工選擇、雜交、突變、基因重組等改良的植物。植物的形態(tài)并無特別限定，可以是種子和植物體整體，例如，可以是種子、芽、葉、葉柄等的一部分。本發(fā)明涉及的第一抗凍蛋白質(zhì)，可以直接從植物中提取出，或通過低溫馴化等方法誘導(dǎo)植物中的第一抗凍蛋白質(zhì)后，再進行提取。作為低溫馴化的溫度，并無特別限定，優(yōu)選0°C以上且20°C以下。另外作為低溫馴化的時間，并無特別限定，優(yōu)選實施3天以上。
本發(fā)明涉及的第一抗凍蛋白質(zhì)，可容易地提取、純化、回收。作為所述提取方法，并無特別限定，例如，可通過使用了水或有機溶劑的公知的提取方法而獲得。提取本發(fā)明涉及的第一抗凍蛋白質(zhì)的溶劑并無特別限定，可將選自水、親水性有機溶劑、超臨界二氧化碳、亞臨界水等中的I種以上的溶劑適當(dāng)?shù)亟M合使用。作為親水性有機溶劑，例如，可列舉甲醇和乙醇等，優(yōu)選可以用于食品加工的溶齊U，例示乙醇等。上述溶劑中優(yōu)選水、乙醇。此外，也可以將水和有機溶劑混合使用。在使用水的情況下，優(yōu)選使用經(jīng)加溫的水，特別是熱水，在使用有機溶劑的情況下，優(yōu)選使用經(jīng)加溫的有機溶劑。經(jīng)加溫的水或有機溶劑的溫度并無特別限定。例如優(yōu)選0°C以上、進一步優(yōu)選200C以上，此外，優(yōu)選160°C以下，進一步優(yōu)選120°C以下。此外，作為水性溶劑，可列舉醋酸鈉等各種緩沖液、乙醇與水的混合溶劑等，但不限于此。可以根據(jù)待提取的植物體的種類和量而適當(dāng)?shù)剡x擇提取溶劑的種類和量。作為純化方法，并無特別限定，例如可適當(dāng)?shù)亟M合使用反滲透、超濾、微濾等。膜分離的分級分子量，并無特別限定。在從膜不透過物中回收目標(biāo)物的情況下，分級分子量的下限優(yōu)選為5，000以上、進一步優(yōu)選8，000以上、非常優(yōu)選10，000以上、最優(yōu)選15,000以上，上限可在不超過19,000的范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)厥褂谩Ｍㄟ^膜分離法，小分子量的成分選擇性地透過膜，其結(jié)果，實現(xiàn)溶液中大分子量的成分的純化、濃縮，但實際上，由于溶液中的溶質(zhì)向膜表面附近聚集(濃差極化)以及向膜表面和微孔內(nèi)吸附等，該透過性能會隨時間而降低。在高分子側(cè)回收本發(fā)明涉及的第一抗凍蛋白質(zhì)的情況下，由于使用的膜的分級分子量低于5，000，溶液中雜質(zhì)成分的去除不充分，此外膜容易產(chǎn)生堵塞，因此不優(yōu)選。此外，若分級分子量超過19，000，則對于分子量約19kDa的所述抗凍蛋白質(zhì)而言，實際上難以純化、回收。也可以根據(jù)需要將本發(fā)明涉及的第一抗凍蛋白質(zhì)進一步純化。例如，可通過將傾析、過濾、離心分離等適當(dāng)組合來除去雜質(zhì)成分。此外,可通過例如鹽析、使用有機溶劑沉淀、親和層析色譜法、離子交換柱色譜法、凝膠過濾等純化，通過適當(dāng)組合透析和超濾等來進行濃縮。本發(fā)明涉及的第二抗凍蛋白質(zhì)為植物種子蛋白質(zhì)。對于本發(fā)明涉及的第二抗凍蛋白質(zhì)，只要具有抗凍活性即可，包含顯示或不顯示熱滯活性的物質(zhì)。但是，作為本發(fā)明涉及的第二抗凍蛋白質(zhì)，從可不改變冷凍溫度而抑制冰結(jié)晶的大小的方面來看，優(yōu)選相對于抗凍活性的熱滯活性非常小，或不顯示熱滯活性的物質(zhì)。本發(fā)明中，種子蛋白質(zhì)是指包含在種子中的蛋白質(zhì)的總稱，種子貯藏蛋白質(zhì)意指例如白蛋白和球蛋白等作為植物發(fā)芽所必要的能源在種子中蓄積的蛋白質(zhì)。這種種子貯藏蛋白質(zhì)可以從植物種子中獲得。此外，也可從種子以外的芽或幼苗等中獲得。作為本發(fā)明涉及的第二抗凍蛋白質(zhì)，具體而言，可列舉具有下述(1Γ(5)中任一 種的氨基酸序列的物質(zhì)。(I)序列號3的氨基酸序列(2)序列號4的氨基酸序列(3)序列號5的氨基酸序列(4)序列號6的氨基酸序列(5)上述(1) (4)氨基酸序列中缺失、取代或添加了 I個以上且5個以下的氨基酸、并且具有抗凍活性的氨基酸序列。上述氨基酸序列(5)中，作為缺失、取代或添加的氨基酸數(shù)，優(yōu)選I以上且3以下，進一步優(yōu)選I或2,特別優(yōu)選I。 本發(fā)明中具有抗凍活性的含義如上所述。只要包含上述氨基酸序列，蛋白質(zhì)可以為由單一亞基形成的單體，由多個亞基形成的復(fù)合物，或包含復(fù)合物的一部分的物質(zhì)。在此，亞基是指例如在二硫蘇糖醇等還原劑的存在下，用SDS-PAGE對蛋白質(zhì)進行分析時，以各個低分子帶的形式被確認(rèn)，是由蛋白質(zhì)解離得到的多肽。作為復(fù)合物的一部分，可列舉例如，9000± IOODa和4000±500Da的亞基，只要具有抗凍活性，并無特別限定。此外，作為本發(fā)明涉及的第二抗凍蛋白質(zhì)，優(yōu)選具有以下性能的物質(zhì)。·相對于抗凍活性，熱滯活性非常弱，或不顯示熱滯活性 在pH8. O的條件下，作為通過使用了陰離子交換樹脂的色譜法的非吸附級分而
獲得·可在丙酮濃度40體積％以上且80體積以下范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)爻恋怼⒎蛛x。作為陰離子交換樹脂，并無特別限定，可以列舉例如，DEAE(二乙氨基乙基)和Q(季銨離子)等。此外，丙酮沉淀的下限濃度優(yōu)選為O體積％以上，進一步優(yōu)選20體積％以上，最優(yōu)選40體積％以上。上限濃度優(yōu)選100體積％以下，更優(yōu)選80體積％以下，最優(yōu)選60體積％以下。本發(fā)明涉及的第二抗凍蛋白質(zhì)，可以直接從植物中提取出，或通過低溫馴化等方法誘導(dǎo)植物中的抗凍蛋白質(zhì)后進行提取。作為原料植物，盡管可列舉與制造第一抗凍蛋白質(zhì)中使用的原料相同，但是在制造第二抗凍蛋白質(zhì)的情況下，優(yōu)選使用植物種子、芽、幼苗。作為低溫馴化的溫度，并無特別限定，優(yōu)選下限溫度為0°C以上，并優(yōu)選上限溫度為20°C以下。另外，作為低溫馴化的時間，并無特別限定，優(yōu)選實施3天以上。
本發(fā)明涉及的第二抗凍蛋白質(zhì)，可容易地提取、純化、回收。其具體的條件等可與第一抗凍蛋白質(zhì)的制造條件相同。但是，通過膜分離對本發(fā)明涉及的第二抗凍蛋白質(zhì)進行純化的情況下，膜分離的分級分子量，并無特別限定。在從膜不透過物中回收目標(biāo)物的情況下，分級分子量的下限優(yōu)選為250以上、更優(yōu)選500以上、進一步優(yōu)選1，000以上、最優(yōu)選2，000以上，此外，在上限不超過4，000的范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)厥褂?。在高分子?cè)回收本發(fā)明涉及的第二抗凍蛋白質(zhì)的情況下，由于使用的膜的分級分子量低于250，溶液中雜質(zhì)成分的去除不充分，此外膜容易產(chǎn)生堵塞，因此不優(yōu)選。此外，若分級分子量超過4，000，則對于分子量約4kDa的所述抗凍蛋白質(zhì)而言，存在著實際上難以純化、回收的情況。上文中說明的本發(fā)明涉及的第一和第二抗凍蛋白質(zhì)，可根據(jù)需要，進一步將其固化為粉末狀或顆粒狀等任意形態(tài)。固化的方法并無特別限定，可以列舉例如按照噴霧干 燥或冷凍干燥等常規(guī)方法對上述提取物進行粉末化的方法，將提取物吸附并擔(dān)載于賦形劑上，進而固化為粉末或顆粒狀的方法等。上述操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，可以根據(jù)用途適當(dāng)?shù)剡x擇使用。在由于水發(fā)生冰結(jié)晶化而產(chǎn)生妨礙的各領(lǐng)域中，可以使用本發(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)，達到抑制妨礙的目的。例如，可以在食品領(lǐng)域、機械領(lǐng)域、土木領(lǐng)域、化妝品領(lǐng)域、使用生物樣品的醫(yī)療領(lǐng)域等使用。在食品領(lǐng)域中，通過抑制食品中含有的水的冰結(jié)晶化，可以防止該食品口味的劣化等。例如，防止淀粉老化，可以抑制食品的口味與品質(zhì)等的劣化，所述劣化是由于食品中的水發(fā)生冰結(jié)晶化，物理地壓迫蛋白質(zhì)和油脂成分等，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化，從而導(dǎo)致的口味與品質(zhì)等的劣化。在機械領(lǐng)域、土木領(lǐng)域中，可以將其用作機械的可動部分、道路、地面等的防凍劑。在化妝品領(lǐng)域中，可以將其用作防止化妝品品質(zhì)劣化等的添加劑。例如，在將含有油脂成分的化妝品冷凍時，該化妝品中含有的水發(fā)生冰結(jié)晶化，物理地壓迫該油脂成分，從而破壞其結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致品質(zhì)及使用感發(fā)生劣化。如果使用本發(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)，通過防止水的冰結(jié)晶化，可以保持油脂成分的結(jié)構(gòu)，從而可以抑制品質(zhì)的劣化等。在醫(yī)療領(lǐng)域中，可以將其用作冷凍保存生物樣品時的保護劑。例如，將細胞、血液、器官等組織等的生物樣品放入現(xiàn)有已知的保存液中冷凍保存時，保存液中的水分凍結(jié)產(chǎn)生冰結(jié)晶，有時該冰結(jié)晶會對生物樣品造成損傷。然而，如果添加本發(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)，則可以抑制冰結(jié)晶的產(chǎn)生和生長，因此可以保護生物體樣品不受冰結(jié)晶所造成的損傷。本發(fā)明的抗凍蛋白質(zhì)的形態(tài)根據(jù)用途各異，可以是直接使用、溶液、濃縮液、懸浮液、冷凍干燥物、粉末、顆粒、片劑等。此外，本發(fā)明涉及的抗體為與上述抗凍蛋白質(zhì)和/或上述多肽特異性反應(yīng)的物質(zhì)，可用于測試在植物中有無該抗凍蛋白質(zhì)和多肽，或從蛋白質(zhì)混合物中確定該抗凍蛋白質(zhì)和多肽。本發(fā)明涉及的抗體可根據(jù)常用方法制備。例如，通過使用上述抗凍蛋白質(zhì)和多肽使小鼠和大鼠等免疫，并通過將產(chǎn)生該抗體的細胞、脾細胞和骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤細胞。將該雜交瘤細胞克隆，并篩選產(chǎn)生與上述抗凍蛋白質(zhì)和多肽特異性反應(yīng)的抗體的克隆。培養(yǎng)該克隆，并可將分泌的單克隆抗體純化。接著，對本發(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)的活性測定方法和蛋白質(zhì)含量的測定方法進行說明。本發(fā)明抗凍蛋白質(zhì)的抗凍活性的測定方法，可以根據(jù)植物的種類等進行適當(dāng)選擇。例如，可通過冰結(jié)晶結(jié)構(gòu)的觀察、抗凍活性的測定等公知的方法來進行，用任意方法確認(rèn)到抗凍活性提高的情況，均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。抗凍活性的測定，可以按照下述方法進行例如，將含有30 八％蔗糖的植物提取物溶液冷卻至_40°C后，再升溫至_6°C，測定通過顯微鏡觀察的冰結(jié)晶的平均面積。抗凍活性越強，則該冰結(jié)晶的平均面積變得越小，因此，以該數(shù)值作為指標(biāo)，可以定量地評價植物提取物的抗凍活性。與對照相比，只要添加了抗凍蛋白質(zhì)時冰結(jié)晶的形成得到輕微抑制，則判斷具有抗凍活性。本發(fā)明提取物的蛋白質(zhì)含量的測定方法，并無特別限定，可以按照例如Lowry法或二辛可寧酸(Bicinchoninic acid) (BCA)法、Bradford 法(Coomassie 法)等公知的方法進行。作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，并無特別限定，優(yōu)選使用例如牛血清白蛋白(BSA)。 本發(fā)明的抗凍蛋白質(zhì)例如可從作為食品的蘿卜苗等各種植物中容易地獲得。為此，本發(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)對生物體的安全性非常高。此外，本發(fā)明涉及的抗凍蛋白質(zhì)大量地包含在植物種子和芽等中，因此可廉價并且大量地提供。進一步地，通過在食品中添加本發(fā)明的抗凍蛋白質(zhì)，可幫助維持冷凍食品的品質(zhì)。此外，本發(fā)明的抗凍蛋白質(zhì)和含有該蛋白質(zhì)的組合物，可有效地用作器官和細胞、血液和血小板等血液成分冷凍保存中的生物體樣品保護劑、和具有皮膚保護作用的化妝品等。實施例以下通過示出實施例，對本發(fā)明的實施方式做以更加詳細的說明。當(dāng)然，本發(fā)明并不限定于下述實施例，詳細內(nèi)容可以有各種不同的形態(tài)。進一步地，本發(fā)明并不限定于上述的實施形態(tài)，可以在權(quán)利要求中所示范圍內(nèi)有各種不同的變更，將各種公開的技術(shù)手段進行適宜組合得到的實施形態(tài)也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，本說明書中所記載的所有的專利文獻和非專利文獻，可以援引在本說明書中作為參考。制造例1-1提取將300mg蘿卜苗提取物干燥粉末溶解在60ml的Tris-HCl (5mM, pH8. O)中，作為粗
提取液。制造例1-2離心分離將由制造例1-1獲得的60ml的粗提取液放入300ml燒杯中，用水浴(EYELA公司制造)在50°C加熱處理30分鐘后，進行離心分離15分鐘(10，OOOXg)?；厥针x心分離后
的上清液。制造例1-3丙酮分級在56ml由制造例1_2獲得的離心分離后的上清液中，每次少量地滴加冷卻至_30°C的丙酮，持續(xù)添加至終濃度為30體積％。進行離心分離15分鐘(10，000 X g)，回收沉淀物。將所得沉淀物冷凍干燥，并溶解于6mlTris-HCl (5mM, pH8. O)中。制造例1-4離子交換柱色譜法用50ml Tris-HCl (10mM,pH8. O)稀釋由制造例1-3獲得的濃縮液。將50ml該溶液施加于用相同緩沖液平衡了的DEAE柱(I. 6 X 10cm, GE healthcare公司制造),用O O. 5M的NaCl梯度在流速5ml/分鐘的條件下洗脫，并回收吸附的級分。制造例1-5凝膠過濾柱色譜法將制造例1-4得到的52ml DEAE非吸附活性級分的溶劑置換為2mlTris_HCl (5mM，pH8. O)。將該溶液施加于凝膠過濾柱(Superde X 200, GEhealthcare公司制造),并在流速I. 3ml/分鐘的條件下洗脫。其結(jié)果，獲得可在25kDa附近觀察到峰的蛋白質(zhì)。試驗例1-1蛋白質(zhì)濃度和抗凍活性的測定測定制造例1-廣1-4的各溶液的蛋白質(zhì)濃度和抗凍活性。(I)蛋白質(zhì)濃度的測定根據(jù)BCA法進行。
(2)抗凍活性的測定在制造例1-廣1-4的各溶液中，以30w/v%的比例加入蔗糖。在具有配備了冷卻調(diào)節(jié)功能的載物臺的顯微鏡下，將該溶液冷卻至_40°C后再升溫至_6°C，保持_6°C的狀態(tài)，測定通過顯微鏡觀察30分鐘的冰結(jié)晶的平均面積。同樣地測定30w/v%的蔗糖溶液作為對照。結(jié)果示于表I中。需要說明的是，表中的值是將對照的冰結(jié)晶面積作為I. O時的相對面積來表示的，該冰結(jié)晶的平均面積越小，表示抗凍活性越強。[表I]
__制造例1-1 制造例1-2 制造例1-3 制造例1-4 n ^
冰結(jié)晶平均面積 O ^ 0.53 0.21 1.0L0115」------
蛋白質(zhì)濃度
GU OU LI 1.3 - _(mg/ml)__^_I_I_^_根據(jù)表I可知，與制造例1-1的相同活性相比，制造例1-4的單位蛋白質(zhì)的活性上升，抗凍蛋白質(zhì)被濃縮。試驗例1-2通過SDS-PAGE測量分子量使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠(12. 5%凝膠，ATTO公司制造)，對制造例1_4的DEAE柱色譜活性級分于20mA下電泳90分鐘。將電泳后的凝膠用銀染色，使蛋白質(zhì)帶可視化。從凝膠染色的結(jié)果，可確定包含約19kDa、約22kDa和約59kDa的蛋白質(zhì)。試驗例1-3氨基酸序列的確定將20 μ I的包含50 μ g由試驗例1_2獲得的純化苗抗凍蛋白質(zhì)的溶液與20 μ I樣品緩沖液(ΑΤΤ0公司制造，EzApply)(體積比1:1)混合，在99°C進行熱處理3分鐘。將樣品施加在15%聚丙烯酰胺凝膠(ΑΤΤ0公司制造，e-PAGEL)中，并在20mA下進行SDS-PAGE90分鐘。通過半干法(semidry)將SDS-PAGE后的凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore公司制造，ImmobilonPSQ)，進行CBB染色。將染色點切出，通過埃德曼法(Edman法)確定N末端氨基酸序列(島津制作所制造，蛋白質(zhì)測序儀PPSQ-33A)。所得序列如下。序列號1(約 19kDa) Gly-Phe-Glu-Ser-Thr-Lys-Cys-Met-Cys-Thr序列號2(約 22kDa) Met-Ala-Lys-Glu-Ala-Gln-Lys-Cys-Gln-Cys另一方面，未得到約59kDa的蛋白質(zhì)的序列。認(rèn)為其原因在于該蛋白質(zhì)的N末端受到某些修飾。
制造例2-1從蘿卜苗中提取抗凍蛋白質(zhì)將200g市售蘿卜苗在50°C用水提取2小時，并通過冷凍干燥得到干燥粉末。將220mg所得提取物溶解在40ml Tris-HCl (5mM, pH8. O)中，作為粗提取液。制造例2-2熱處理用恒溫槽(EYE LA公司)對40ml制造例2_1獲得的粗提取液、于50°C熱處理30分鐘后，進行離心分離15分鐘(10，OOOXg)?；厥针x心分離后的上清液。制造例2-3丙酮分級在31ml制造例2_2獲得的離心分離后的上清液中，每次少量地滴加冷卻至_30°C的丙酮，持續(xù)添加至終濃度為40體積％。進行離心分離15分鐘(10，OOOXg)，回收上清液。向該上清液中進一步滴加冷卻至_30°C的丙酮，持續(xù)添加至終濃度為80體積％。進行離心分離15分鐘(10，OOOXg)，回收沉淀物。將所得沉淀物干燥，并溶解于12ml Tris-HCl (5mM,ρΗ8· O)中。制造例2-4離子交換柱色譜法用Tris-HCl (5mM,pH8. O)將制造例2_3獲得的溶液稀釋至50ml，并施加于用相同緩沖液平衡了的DEAE柱(I. 6 X 10cm, GE healthcare公司制造)，在流速5ml/分鐘的條件下，流過相同的緩沖液，洗脫非吸附級分并回收。制造例2-5凝膠過濾柱色譜法將制造例2-4得到的52ml DEAE非吸附活性級分的溶劑置換為2mlTris_HCl (5mM,pH8. O)。用該溶液施加于凝膠過濾柱(SuperdeX 200,GEhealthcare公司制造),并在流速I. 3ml/分鐘的條件下洗脫。其結(jié)果，獲得可在25kDa附近觀察到峰的蛋白質(zhì)。試驗例2-1蛋白質(zhì)濃度、抗凍活性和熱滯活性的測定對于制造例2-f 2-5的各溶液，測定其蛋白質(zhì)濃度、抗凍活性和熱滯活性。(I)蛋白質(zhì)濃度的測定根據(jù)BCA法進行。(2)抗凍活性的測定在制造例2-廣2-5的各溶液中，以30w/v%的比例加入蔗糖。在具有配備了冷卻調(diào)節(jié)功能的載物臺的顯微鏡下，將該溶液冷卻至_40°C后再升溫至_6°C，保持_6°C的狀態(tài)，測定通過顯微鏡觀察30分鐘的冰結(jié)晶的平均面積。同樣地測定30w/v%的蔗糖溶液作為對照。結(jié)果示于表2中。需要說明的是，表中的值是將對照的冰結(jié)晶面積作為1.0時的相對面積來表示的，該冰結(jié)晶的平均面積越小，表示抗凍活性越強。(3)熱值活性的測定使用可控制低溫的相位差顯微鏡，將玻璃皿保持在-20°C，并在其上放置I μ I樣品，通過以100°c /分鐘的速度使溫度降低至-40°C而形成冰結(jié)晶。以100°C /分鐘的速度將形成的冰結(jié)晶加溫至_5°C，由此以5°C /分鐘的速度使冰結(jié)晶溶解，成為單晶。然后以rc /分鐘的速度降溫，測定成為單晶的冰結(jié)晶開始生長的時間，根據(jù)下式算出熱滯。熱滯(V ) =60-1 (V /秒)X測定時間(秒)[表2]
權(quán)利要求
1.抗凍蛋白質(zhì)，其來源于植物，并且包含下述(1Γ(4)中的任意蛋白質(zhì)中的至少一種， (1)具有序列號I的氨基酸序列、并且通過SDS-PAGE測定的分子量為19，000±200Da的蛋白質(zhì)， (2)具有序列號2的氨基酸序列、并且通過SDS-PAGE測定的分子量為22，000±250Da的蛋白質(zhì)， (3)通過SDS-PAGE測定的分子量為59，000±600Da、其N末端接受了修飾的蛋白質(zhì)， (4)上述(1) (3)中的任意蛋白質(zhì)的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或多個氨基酸、并且具有抗凍活性的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求I所述的抗凍蛋白質(zhì)，其中，所述植物為選自屬于十字花科、傘形科、百合科和菊科植物中的一種以上的植物，或其類似品種或改良品種。
3.權(quán)利要求2所述的抗凍蛋白質(zhì)，其中，所述屬于十字花科的植物為選自白菜、蘿卜、西蘭花、青梗菜、油菜、蕪菁、甜菜、野澤菜、廣島菜、水菜和芥菜中的一種以上的植物，或其類似品種或改良品種。
4.權(quán)利要求3所述的抗凍蛋白質(zhì),其中，所述屬于十字花科的植物為蘿卜(Raphanussativus),或其類似品種或改良品種。
5.權(quán)利要求3所述的抗凍蛋白質(zhì)，其中，所述屬于十字花科的植物為蘿卜苗。
6.權(quán)利要求Γ5中任一項所述的抗凍蛋白質(zhì)，其為在丙酮分級中、于丙酮濃度為30體積％的濃度所沉淀的級分中包含的物質(zhì)。
7.抗凍蛋白質(zhì)，其為植物種子蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求7所述的抗凍蛋白質(zhì)，其為植物種子貯藏蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求7或8所述的抗凍蛋白質(zhì)，其具有下述(1) (5)中的任意氨基酸序列， (1)序列號3的氨基酸序列 (2)序列號4的氨基酸序列 (3)序列號5的氨基酸序列 (4)序列號6的氨基酸序列 (5)上述(I廣⑷氨基酸序列中缺失、取代或添加了I個以上且5個以下的氨基酸、并且具有抗凍活性的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求7、中任一項所述的抗凍蛋白質(zhì)，其中，所述植物為選自屬于十字花科、傘形科、百合科或菊科植物中的一種以上的植物，或其類似品種或改良品種。
11.權(quán)利要求10所述的抗凍蛋白質(zhì)，其中，所述屬于十字花科的植物為選自白菜、蘿卜、西蘭花、青梗菜、油菜、蕪菁、甜菜、野澤菜、廣島菜、水菜和芥菜中的一種以上的植物，或其類似品種或改良品種。
12.權(quán)利要求11所述的抗凍蛋白質(zhì),其中,所述屬于十字花科的植物為蘿卜(Raphanussativus),或其類似品種或改良品種。
13.權(quán)利要求11所述的抗凍蛋白質(zhì)，其中，所述屬于十字花科的植物為蘿卜苗。
14.權(quán)利要求13所述的抗凍蛋白質(zhì)，其為由多個亞基構(gòu)成的物質(zhì)。
15.權(quán)利要求14所述的抗凍蛋白質(zhì)，其中，通過SDS-PAGE測量的至少一個亞基的分子量為 9000 土 IOODa 或 4000 土 50Da。
16.權(quán)利要求Γ15中任一項所述的抗凍蛋白質(zhì)，其為在pH8時、不吸附到陰離子交換柱上的物質(zhì)。
17.權(quán)利要求16所述的抗凍蛋白質(zhì)，其中，所述陰離子交換柱為DEAE柱。
18.權(quán)利要求Γ17中任一項所述的抗凍蛋白質(zhì)，其為在丙酮分級中、于丙酮濃度為40體積％以上且80體積％以下的濃度所沉淀的級分中包含的物質(zhì)。
19.多肽，其為將權(quán)利要求f18中任一項所述的抗凍蛋白質(zhì)解離所得到的物質(zhì)，并且其具有抗凍活性。
20.抗體，其與權(quán)利要求f18中任一項所述的抗凍蛋白質(zhì)和/或權(quán)利要求19所述的多肽特異性地進行反應(yīng)。
21.組合物，其包含權(quán)利要求廣18中任一項所述的抗凍蛋白質(zhì)和/或權(quán)利要求19所述的多肽。
22.食品，其包含權(quán)利要求f18中任一項所述的抗凍蛋白質(zhì)和/或權(quán)利要求19所述的多肽。
23.生物試樣保護劑，其包含權(quán)利要求f18中任一項所述的抗凍蛋白質(zhì)和/或權(quán)利要求19所述的多肽。
24.化妝品，其包含權(quán)利要求f18中任一項所述的抗凍蛋白質(zhì)和/或權(quán)利要求19所述的多肽。
25.抗凍方法，其包含如下工序?qū)?quán)利要求f18中任一項所述的抗凍蛋白質(zhì)和/或權(quán)利要求19所述的多肽添加至溶液中。
26.權(quán)利要求f18中任一項所述的抗凍蛋白質(zhì)和/或權(quán)利要求19所述的多肽用于抑制冰結(jié)晶化的用途。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供具有優(yōu)異的抗凍活性的抗凍蛋白質(zhì)，其可在工業(yè)水平高效且廉價地進行生產(chǎn)，安全并適于實用。此外，本發(fā)明的目的在于提供作為所述抗凍蛋白質(zhì)的活性部分的多肽、包含所述抗凍蛋白質(zhì)或多肽的組合物、食品、生物體樣品保護劑和化妝品、以及與所述抗凍蛋白質(zhì)或多肽特異性反應(yīng)的抗體。本發(fā)明的抗凍蛋白質(zhì)來源于植物，且具有特定的氨基酸序列，或者，其為植物種子蛋白質(zhì)。
文檔編號A23L1/30GK102869673SQ20118002174
公開日2013年1月9日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者福岡讓一, 河原秀久, 毛笠秀昭, 荒井直樹, 友野潤, 橫田真一 申請人:株式會社鐘化