專利名稱：用于改善脂肪酸含量而開發(fā)的銅綠假單孢菌菌株及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種轉基因的重組銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)及其制備方法，尤其是一種以有關脂肪酸生物合成的基因轉基因的脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌及其制備方法。
背景技術：
使用化石燃料時大量排放地球暖化氣體及廢棄物，從而為人類帶來了嚴重的環(huán)境危機。因此迫切需要開發(fā)能夠替代基于化石燃料的化學工業(yè)，亦即以盡量減少有害于人類的廢棄物的生產(chǎn)及能源消耗的生物物質作為原料的新環(huán)保生物工藝。生物乙醇、生物柴油、生物氣(biogas)、丁醇作為生物能(Bio energy)而受到人們重視，上述的生物能雖然都能作為發(fā)電或運輸用燃料使用，但因為它們在實際應用與生產(chǎn)方法上的若干缺點而使得作為新再生能源的烴(hydrocarbon)形態(tài)的化合物日益受到關注。因此，能夠以代謝產(chǎn)物的方式生成長鏈脂肪酸(long chain fatty acid)的重組菌株也日益受到人們關注。銅綠假單抱菌(Pseudomonas aeruginosa)是綠胺桿菌，1882年由Gessard在綠色的膿汁發(fā)現(xiàn)，由于形成綠色而被稱為綠膿桿菌。綠膿桿菌廣泛存在于自然界，可以從膿、咳痰、糞便、尿、膽汁、子宮分泌物、血、脊髓液等分離。銅綠假單孢菌綠膿桿菌的形態(tài)為革蘭陰性桿菌，培養(yǎng)時形成類似于莢膜的細胞外多糖粘質層。形成類似于莢膜的細胞外多糖粘質層。它是一種對自然界具有強大適應能力的微生物。該菌生長所需營養(yǎng)條件非常單純?；撔枣溓蚓?Streptococcus pyogenes)能夠引起肺炎、咽喉炎、急性腎炎、毒性休克癥候群之類的疾病。脂肪酸(fatty acid)是具有I個羧基(-C00H)的烴鏈的羧酸，表示鏈狀I價羧酸(Carboxylic acid)。由于水解脂肪時生成而使用該名稱。脂肪酸分子由烴鏈(hydrocarbonchain)構成，烴在碳的基本架 構上以側鏈鏈接氫并且在一端附著羧基。在生體內(nèi)部，脂肪酸可由脂肪酸循環(huán)(fatty acid cycle)分解或合成。該循環(huán)以2個碳為單位合成或分解脂
肪酸，因此存在于自然界的脂肪酸幾乎大部分以雙數(shù)碳數(shù)形成。
權利要求
1.一種脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 利用含有編碼化膿性鏈球菌來源的酰基(?；d體蛋白質)硫酯酶的核苷酸的表達載體進行轉基因。
2.一種脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 利用含有編碼銅綠假單孢菌的乙酰輔酶A羧酶羧基轉移酶阿爾法亞基的核苷酸與編碼化膿性鏈球菌的?；?酰基載體蛋白質)硫酯酶的核苷酸的表達載體進行轉基因。
3.一種脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 利用含有編碼銅綠假單孢菌的丙二酰-輔酶A-[酰基載體蛋白質]轉酰酶的核苷酸與編碼化膿性鏈球菌的?；?酰基載體蛋白質)硫酯酶的核苷酸的表達載體進行轉基因。
4.一種脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 利用含有編碼銅綠假單孢菌的乙酰輔酶A羧酶羧基轉移酶阿爾法亞基的核苷酸及編碼丙二酰-輔酶A-[?；d體蛋白質]轉酰酶的核苷酸，含有編碼化膿性鏈球菌的?；?酰基載體蛋白質)硫酯酶的核苷酸的表達載體進行轉基因。
5.根據(jù)權利要求1到4的任意一項所述的脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 上述表達載體是具有圖2所記載的基因地圖的大腸桿菌-綠膿桿菌穿梭載體PUCP19。
6.根據(jù)權利要求1到4的任意一項所述的脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于，編碼上述?；??；d體蛋白質硫酯酶的核苷酸具有記載為序列編號:6的鹽基順序。
7.根據(jù)權利要求2或4所述的脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 上述編碼乙酰輔酶A羧酶羧基轉移酶阿爾法亞基的核苷酸具有記載為序列編號:2的鹽基順序。
8.根據(jù)權利要求3或4所述的脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 上述編碼丙二酰-輔酶A-[酰基載體蛋白質]轉酰酶的核苷酸具有記載為序列編號:4的鹽基順序。
9.根據(jù)權利要求1到4的任意一項所述的脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 上述銅綠假單孢菌是銅綠假單孢菌PA14。
10.一種脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌的制備方法，包括下列步驟: i)把編碼化膿性鏈球菌的?；??；d體蛋白質)硫酯酶的核苷酸插入表達載體的步驟；及 ii)利用上述步驟i)的表達載體讓銅綠假單孢菌轉基因的步驟.
11.一種脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌的制備方法，包括下列步驟: i)把編碼乙酰輔酶A羧酶羧基轉移酶阿爾法亞基的核苷酸或編碼丙二酰-輔酶A-[?；d體蛋白質]轉酰酶的核苷酸中的一個或兩個全部、及編碼化膿性鏈球菌的?；??；d體蛋白質)硫酯酶的核苷酸插入表達載體的步驟；及 ii)利用上述步驟i)的表達載體讓銅綠假單孢菌轉基因的步驟。
12.一種脂肪酸生產(chǎn)方法，包括下列步驟: i)培養(yǎng)權利要求1到4的任意一項的銅綠假單孢菌后生物合成脂肪酸的步驟；及ii)獲取上述步驟i)中生物合成的脂肪酸的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種為了改善脂肪酸含量而開發(fā)的銅綠假單孢菌菌株及制備方法，更具體地，本發(fā)明涉及一種利用含有編碼銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)的乙酰輔酶A羧酶羧基轉移酶阿爾法亞基的核苷酸及/或編碼丙二酰-輔酶A-[酰基載體蛋白質]轉酰酶轉酰酶的核苷酸，及/或編碼化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的?；??；d體蛋白質)硫酯酶的核苷酸的表達載體轉基因的銅綠假單孢菌及其制備方法。本發(fā)明轉基因的銅綠假單孢菌具有較高的遺傳穩(wěn)定性而且脂質或脂肪酸含量非常高，因此適用于脂肪酸的批量生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/52GK103080297SQ201180020363
公開日2013年5月1日 申請日期2011年3月7日 優(yōu)先權日2010年4月22日
發(fā)明者李辰遠, 李善熙, 全恩英 申請人:西江大學校產(chǎn)學協(xié)力團