專(zhuān)利名稱(chēng)：微生物的檢測(cè)和計(jì)數(shù)的制作方法
微生物的檢測(cè)和計(jì)數(shù)本發(fā)明涉及檢測(cè)并計(jì)數(shù)樣品中嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)種的微生物的方法。本發(fā)明還包括適合于用于該方法的試劑盒。該方法和試劑盒能夠更快速地定量存活微生物。軍團(tuán)菌(Legionella)在濕潤(rùn)或潮濕環(huán)境，如土壤和非海洋水生環(huán)境中廣泛存在。也可以在暖水和冷水設(shè)備、空調(diào)系統(tǒng)的冷卻塔和水加濕器中發(fā)現(xiàn)它們。軍團(tuán)菌，尤其是嗜肺軍團(tuán)菌是引起急性細(xì)菌性肺炎的病原菌，所述急性細(xì)菌性肺炎一般稱(chēng)為“軍團(tuán)病”，對(duì)被感染的個(gè)體經(jīng)常是致命的。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)完成嗜肺軍團(tuán)菌的常規(guī)檢測(cè)和計(jì)數(shù)。該方法可通過(guò)使用平板計(jì)數(shù)測(cè) 定可培養(yǎng)的細(xì)菌或通過(guò)使用過(guò)濾膜方法測(cè)定小菌落來(lái)完成。這些技術(shù)通過(guò)存活細(xì)菌形成菌落或小菌落的能力來(lái)評(píng)估該存活細(xì)菌。不幸的是，此類(lèi)方法一般需要3到10天來(lái)允許形成所述菌落或小菌落。雖然水設(shè)備仍然運(yùn)行，但這段時(shí)間內(nèi)具有感染人的不可接受的危險(xiǎn)。用于檢測(cè)總的軍團(tuán)菌微生物的其他方法包括PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)。PCR使用DNA聚合酶通過(guò)體外酶復(fù)制來(lái)擴(kuò)增一段DNA。在該技術(shù)進(jìn)行的過(guò)程中，所產(chǎn)生的DNA用作引起鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的復(fù)制模板，在所述鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中DNA模板成指數(shù)擴(kuò)增。PCR使得能夠通過(guò)產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)或更多拷貝的DNA片段來(lái)擴(kuò)增單個(gè)或少數(shù)拷貝的DNA片段。通常，該方法由Diederen等，J Med Microbiol. 2007 Jan; 56 (Pt I) :94-101 描述。然而，PCR的缺點(diǎn)是樣品傾向于含有聚合反應(yīng)抑制劑，因而不能始終如一地提供定量結(jié)果。此外，該技術(shù)依賴(lài)于先前的DNA純化步驟，其可導(dǎo)致DNA損失，因此低估了所存在的軍團(tuán)菌。在一定程度上，可通過(guò)定量的實(shí)時(shí)PCR克服這些缺點(diǎn)。然而，該技術(shù)仍然不能區(qū)分存活細(xì)胞和非存活細(xì)胞。另一技術(shù)是熒光原位雜交(FISH)，其中熒光物質(zhì)標(biāo)記的寡核苷酸探針滲透到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。其中核糖體核酸(rRNA)具有探針的正確序列，稱(chēng)為靶標(biāo)，所述探針會(huì)將其自身附著到其靶標(biāo)上并且不會(huì)被任何后續(xù)洗滌步驟去除。其中固定探針的細(xì)菌然后會(huì)發(fā)射熒光信號(hào)。然后通過(guò)技術(shù)，如流式細(xì)胞術(shù)、固相細(xì)胞計(jì)量術(shù)或epifluorescent顯微鏡技術(shù)來(lái)定量該熒光信號(hào)。Dutil S 等 J Appl Microbiol. 2006 May; 100 (5) :955-63 描述了典型的 FISH技術(shù)。然而，單獨(dú)使用所述FISH技術(shù)，可檢測(cè)存活嗜肺軍團(tuán)菌的總數(shù)，但不幸的是該方法不能專(zhuān)門(mén)鑒定僅那些能夠分裂并因此產(chǎn)生菌落的嗜肺軍團(tuán)菌細(xì)菌。用于計(jì)數(shù)存活嗜肺軍團(tuán)菌的其他方法包括ChemChrome V6并由Delgado-Viscogliosi 等 Appl Environ Microbiol. 2005Jul; 71 (7) : 4086-96 進(jìn)行了描述。該方法允許定量嗜肺軍團(tuán)菌并區(qū)分存活細(xì)菌和非存活細(xì)菌。其組合了使用抗體和細(xì)菌存活標(biāo)記(ChemChrome V6)特異性檢測(cè)軍團(tuán)菌細(xì)胞與使用epifluorescent顯微鏡來(lái)計(jì)數(shù)。然而，盡管該技術(shù)可以區(qū)分存活細(xì)胞和非存活細(xì)胞，但不能夠單獨(dú)鑒定那些形成菌落的細(xì)菌。US 20070218522描述了用于檢測(cè)并定量存活軍團(tuán)菌和其他異養(yǎng)需氧菌的方法和組合物，所述方法包括使用dipslides,所述dipslides包括吸收培養(yǎng)基、促進(jìn)生長(zhǎng)和生長(zhǎng)選擇性物質(zhì)，用于快速檢測(cè)并定量軍團(tuán)菌小菌落。該技術(shù)不計(jì)數(shù)受損的細(xì)菌。EP 1329515涉及通過(guò)使氣體環(huán)境與包含丙酮酸鹽的瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸并允許微生物菌落生長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)包含過(guò)氧化氫的氣體環(huán)境中微生物存在的方法。一般認(rèn)為涉及生長(zhǎng)培養(yǎng)基(如營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板)上的菌落生長(zhǎng)的技術(shù)是更精確的。因此，平板計(jì)數(shù)方法仍然是用于獲得總存活計(jì)數(shù)的方法的優(yōu)選選擇。這一般表示將懷疑含有微生物的樣品應(yīng)用到含固體營(yíng)養(yǎng)源或生長(zhǎng)培養(yǎng)基的平板上。該技術(shù)一般稱(chēng)作平板接種?？偞婊钣?jì)數(shù)表示能夠產(chǎn)生觀察者可分辨的菌群的細(xì)菌總數(shù)。通常，這將表示在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(如營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板)的表面上的可見(jiàn)菌落。然而，環(huán)境中的微生物(如嗜肺軍團(tuán)菌)可能會(huì)遭受阻止微生物在其環(huán)境條件下生長(zhǎng)并繁殖的一種或多種脅迫。此類(lèi)受脅迫的微生物在正常培養(yǎng)條件下將根本不會(huì)分裂或形成可見(jiàn)菌落。在環(huán)境中，由于環(huán)境條件，如饑餓、存在殺生物劑、熱激和干燥，通常一定比例的微生物細(xì)胞會(huì)受到脅迫。此外，這些細(xì)胞可處于易損生理狀態(tài)下，其中由于存在大氣氧氣，平板接種微生物的技術(shù)可加重那些早已受脅迫的微生物細(xì)胞的脅迫。此外，這可導(dǎo)致受脅迫的細(xì)菌非天然死亡，導(dǎo)致低估總存活計(jì)數(shù)。 此外，利用平板接種方法低估存活嗜肺軍團(tuán)菌可能在其病原性方面變得有害。自從20世紀(jì)70年代以來(lái)，已經(jīng)報(bào)道了應(yīng)該將活性氧類(lèi)別(ROS)的清除劑用于限制平板接種方法過(guò)程中氧化脅迫的影響。Speck等，repair and enumeration ofinjured coliforms by a plating procedure, Appl Microbiol 29，549-50 (1975);Martin等 Catalase: its effect on microbial enumeration.Appl Environ Microbiol32，731-4 (1976);Brewer 等 Beneficial effects of catalase or pyruvate in amost-probabIe-number technique for the detection of Staphylococcus aureus.Appl Environ Microbiol 34,797-800 (1977);McDonald 等,Enhanced recoveryof injured Escherichia coli by compounds that degrade hydrogen peroxideor block its formation.Appl Environ Microbiol 45，360-5(1983);Marthi 等)Resuscitation effects of catalase on airborne bacteria. Appl Environ Microbiol57，2775-6(1991);Busch and Donnelly Development of a repair-enrichment brothfor resuscitation of heat-injured Listeria monocytogenes and Listeria innocua.Appl Environ Microbiol 58, 14-20(1992);和 Dukan 等,Oxidative stress defenseand deterioration of growth-arrested Escherichia coli cells.J Biol Chem274，26027-32(1999)報(bào)道了該方面。然而，在所有上述情況中，本發(fā)明的發(fā)明人相信可通過(guò)其中化合物與ROS發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的直接途徑來(lái)減少R0S。Berube 等，〃Rapid detect ion and identification of Legionel lapneumophila by membrane immunoassay^, Applied and EnvironmentalMicrobiology, 1989，55，1640-1641描述了使用單克隆抗體通過(guò)免疫印跡測(cè)定來(lái)檢測(cè)與鑒定嗜肺軍團(tuán)菌。沒(méi)有提供用于解決受損細(xì)菌的問(wèn)題的方法。Pine等(Role of keto acids and reduced-oxygen-scavenging enzymes in thegrowth of Legionella species. J Clin Microbiol 23, 33-42 (1986))的文章描述了添加酮酸和還原氧清除酶的必要性是為了優(yōu)化嗜肺軍團(tuán)菌的生長(zhǎng)，并建議在用于標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)該微生物的培養(yǎng)基中使用這些物質(zhì)。然而，酮酸和還原氧清除酶的單獨(dú)使用不足以修復(fù)待修復(fù)的受脅迫嗜肺軍團(tuán)菌細(xì)胞并允許精確的計(jì)數(shù)。當(dāng)使用用于嗜肺軍團(tuán)菌的特定生長(zhǎng)培養(yǎng)基(如緩沖炭酵母浸膏(BCYE)瓊脂培養(yǎng)基)時(shí)尤其如此。實(shí)際上，沒(méi)有得到關(guān)于優(yōu)化用于精確計(jì)數(shù)嗜肺軍團(tuán)菌的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的數(shù)據(jù)。WO 2009 121726描述了通過(guò)使微生物與至少一種修復(fù)化合物和生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸，隨后通過(guò)溫育步驟，并檢測(cè)和定量存活微生物來(lái)檢測(cè)并計(jì)數(shù)樣品中存活嗜肺軍團(tuán)菌的方法。所述修復(fù)化合物直接或間接引起對(duì)代謝的影響，以減少微生物的氧化脅迫。提示修復(fù)化合物包括丙酮酸鹽和羥基乙酸。所述方法為在比先前方法更短的時(shí)間跨度內(nèi)更精確計(jì)數(shù)存活嗜肺軍團(tuán)菌提供了極好手段。然而，期望提供用于甚至更精確且甚至更快速計(jì)數(shù)存活嗜肺軍團(tuán)菌的改良方法。此外，還期望這在更廣譜的嗜肺軍團(tuán)菌菌株上實(shí)現(xiàn)。因此根據(jù)本發(fā)明，我們提供了用于檢測(cè)并計(jì)數(shù)懷疑含有所述微生物的樣品中的存活微生物的方法 (I)使所述樣品的所述微生物與修復(fù)化合物和生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸，和(2)溫育步驟(I)的產(chǎn)物，和(3)檢測(cè)并定量所述存活微生物，其中所述微生物是嗜肺軍團(tuán)菌種，并且其中所述修復(fù)化合物包含(a)絲氨酸；(b)蘇氨酸；(c) 10_6到10_2mM劑量的含有鈣離子的化合物；(d) 1(Γ6到1(Γ2πιΜ劑量的含有鎂離子的化合物；(e)含有鉀離子的化合物；(f)谷氨酸或其鹽，和(g)丙酮酸或其鹽。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在本方法中結(jié)合使用這些化合物作為修復(fù)化合物顯著縮短了嗜肺軍團(tuán)菌微生物的潛伏期。實(shí)際上，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這在更廣譜嗜肺軍團(tuán)菌菌株中實(shí)現(xiàn)。不受理論限制，認(rèn)為丙酮酸鹽、谷氨酸鹽和特定濃度的鈣離子和鎂離子的組合產(chǎn)生了直接或間接去除或減少氧化脅迫的有益作用，并且認(rèn)為鉀離子降低了滲透壓休克，而絲氨酸和蘇氨酸增強(qiáng)了代謝。相信修復(fù)化合物的這種特殊組合在去除或減少氧化脅迫、降低滲透壓休克并增強(qiáng)代謝中提供了協(xié)同改善，由此實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目標(biāo)。在本發(fā)明中，絲氨酸或蘇氨酸的希望劑量基于樣品體積中修復(fù)化合物的重量可以在O. 01到5%之間。希望這一般會(huì)在O. 05到2. 5%的范圍內(nèi)，例如在O. I到2%，經(jīng)常在O. 5到1%的范圍內(nèi)。根據(jù)樣品體積中修復(fù)化合物的重量，以O(shè). 01和5%的希望劑量使用谷氨酸(或其鹽)和/或丙酮酸(或其鹽)。希望這將經(jīng)常介于O. 05和2. 5%之間，例如O. I和2%，經(jīng)常在O. 5和1%的范圍內(nèi)。含鈣離子、鎂離子或鉀離子的每一種化合物可以是任何合適的鹽。期望它們是水溶性的，至少足以允許溶解所需劑量。所述鹽可以具有任何合適的抗衡離子。技術(shù)人員在任何情況下均將意識(shí)到，對(duì)微生物例如嗜肺軍團(tuán)菌而言，抗衡離子不應(yīng)該是已知的毒素。通常，所述抗衡離子將包括但不限于氯化物、硫酸鹽、硝酸鹽等。如上所指，當(dāng)所述化合物含有鈣離子時(shí)，它應(yīng)該以10_6到10_2mM的劑量使用，優(yōu)選會(huì)在1(Γ5到l(T3mM的范圍內(nèi)，更優(yōu)選5xl(T4到5xl(T3，尤其在1(Γ4左右。如上所指，對(duì)于含鎂離子的化合物，劑量應(yīng)為10_6到10_2mM，優(yōu)選會(huì)在10_5到10_3mM的范圍內(nèi)，更優(yōu)選5xl0_4到5xl(T3mM，尤其在ΙΟΛιΜ左右。期望含有鉀離子的修復(fù)化合物應(yīng)該以I到例如KT1到l(T3mM，更優(yōu)選δχΚΓ1到5xlO_2mM，尤其是10_2mM左右的劑量使用。所述修復(fù)化合物結(jié)合使用，這表示它們可同時(shí)或順序使用。順序表示基本上一個(gè)接一個(gè)地加入每一種化合物。同時(shí)表示在同一時(shí)間向樣品中加入兩種或多種修復(fù)化合物。也期望將兩種或多種修復(fù)化合物組合成制劑，并從而否定了修復(fù)化合物的單獨(dú)添加。我們相信，修復(fù)化合物丙酮酸鹽、谷氨酸鹽、所含鈣和鎂以降低微生物的氧化脅迫的方式直接或間接作用于微生物的代謝。這樣，我們相信，丙酮酸鹽、谷氨酸鹽、含鈣離子和鎂離子的修復(fù)化合物內(nèi)源性地作用于微生物。
氧化脅迫表示ROS (內(nèi)源基因產(chǎn)生或外源基因內(nèi)收)的濃度與微生物容易地解毒活性中間體或有效地修復(fù)所得損傷的能力之間的不平衡。對(duì)微生物正常代謝過(guò)程的這種破壞可引起毒性作用，這是由于自由基和氧化劑(如過(guò)氧化物)的形成可導(dǎo)致對(duì)微生物細(xì)胞的組分，例如DNA、蛋白質(zhì)或脂類(lèi)的損傷。引起對(duì)微生物代謝的作用表示引起對(duì)微生物細(xì)胞內(nèi)的自然固有化學(xué)過(guò)程的改變。對(duì)內(nèi)源性的參考表示改變?cè)谖⑸锛?xì)胞內(nèi)發(fā)生以減少氧化脅迫。這例如可以是微生物內(nèi)代謝過(guò)程的改變。其也可以包括去除微生物細(xì)胞內(nèi)的R0S。此外，相信丙酮酸鹽、谷氨酸鹽、鈣離子和鎂離子可直接或間接抑制ROS的形成和/或降解所述R0S。對(duì)ROS發(fā)揮間接作用的這種化合物可通過(guò)干擾微生物的代謝來(lái)完成該過(guò)程。認(rèn)為修復(fù)化合物的這種組合例如可在有氧呼吸過(guò)程中間接內(nèi)源性地減少R0S。鉀離子化合物幫助減少滲透壓休克。滲透壓休克表示細(xì)胞周?chē)沫h(huán)境和細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境之間溶質(zhì)濃度的失衡。該失衡引起了水通過(guò)細(xì)胞膜移動(dòng)的快速改變，并引起細(xì)胞損傷。受損的細(xì)胞或改變的細(xì)胞對(duì)滲透脅迫敏感得多并且由于該類(lèi)型的脅迫會(huì)喪失活力。相信絲氨酸和蘇氨酸修飾微生物的代謝。這表示絲氨酸和蘇氨酸參與代謝途徑，認(rèn)為所述代謝途徑直接或間接誘導(dǎo)具有受限的或降低的代謝的細(xì)胞中增強(qiáng)的代謝速率。使用這兩種分子，細(xì)胞能夠顯示改善的生長(zhǎng)。期望本發(fā)明修復(fù)化合物的前述組合協(xié)同地改善減少或去除R0S、減少滲透壓休克和改善代謝的組合。相比于之前，這對(duì)更廣譜的嗜肺軍團(tuán)菌菌株尤其如此。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本方法誘導(dǎo)修復(fù)受脅迫的嗜肺軍團(tuán)菌細(xì)胞穿過(guò)更廣譜的嗜肺軍團(tuán)菌菌株，并因此更精確地提供總存活計(jì)數(shù)。意外的是，我們還發(fā)現(xiàn)本方法還減少所需溫育時(shí)間的量。一般而言，我們發(fā)現(xiàn)所述方法可以減少溫育時(shí)間數(shù)小時(shí)，并且在一些情況下至少一天或兩天。意外的是，我們還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法可以引起干擾微生物(即除嗜肺軍團(tuán)菌以外的那些微生物)的減少。適當(dāng)?shù)厣婕笆故苊{迫的嗜肺軍團(tuán)菌微生物細(xì)胞與本發(fā)明的修復(fù)化合物組合接觸的本發(fā)明方法令人希望的抑制ROS的形成和/或減少和/或去除R0S、減少滲透壓休克并改善代謝，并且該方法傾向于誘導(dǎo)修復(fù)受脅迫的細(xì)胞。收集樣品后可直接使嗜肺軍團(tuán)菌微生物與修復(fù)化合物接觸。因此，其中收集水樣品(相信其含有微生物)的容器可能早已經(jīng)包含了所述修復(fù)化合物。或者，一旦已經(jīng)收集了含有嗜肺軍團(tuán)菌的水樣品，則為了分析目的可以利用含修復(fù)化合物的稀釋水將其稀釋。在其他備選方案中，任選地已經(jīng)被稀釋的樣品可以與含有修復(fù)化合物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸，或者可在將微生物與所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸后應(yīng)用所述修復(fù)化合物。一旦已經(jīng)收集了樣品，可以期望將其進(jìn)行儲(chǔ)藏，直至可以方便地進(jìn)行本發(fā)明的方法。期望在儲(chǔ)藏過(guò)程中摻入所有的修復(fù)化合物。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的結(jié)合的所有修復(fù)化合物應(yīng)該在稀釋步驟或樣品儲(chǔ)藏過(guò)程中與微生物接觸。 期望本發(fā)明的一種形式涉及使所述樣品與修復(fù)培養(yǎng)基，優(yōu)選非選擇性修復(fù)培養(yǎng)基(含有所述修復(fù)化合物)接觸，然后使其與生長(zhǎng)培養(yǎng)基，優(yōu)選與選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。優(yōu)選地，所述修復(fù)培養(yǎng)基是液體，并且更優(yōu)選是培養(yǎng)液。當(dāng)所述修復(fù)培養(yǎng)基是液體時(shí)，這適當(dāng)?shù)胤Q(chēng)為液體修復(fù)方法。通常在液體修復(fù)方法中，首先將樣品引入含有本發(fā)明的組合的液體培養(yǎng)基中。理想情況是，所述液體修復(fù)方法允許受脅迫的細(xì)菌在非選擇性液體培養(yǎng)基中進(jìn)行修復(fù)。優(yōu)選地，所述液體修復(fù)方法會(huì)使用培養(yǎng)液作為液體培養(yǎng)基。一般而言，然后會(huì)將含嗜肺軍團(tuán)菌微生物的液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。所述受脅迫的微生物在轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基之前已經(jīng)進(jìn)行了修復(fù)或與生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸后進(jìn)行修復(fù)。更優(yōu)選地，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基是選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基。通常，會(huì)將含有微生物的液體培養(yǎng)基平板接種到選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基平板上，如選擇性瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基平板。在備選的優(yōu)選形式中，步驟(I)包括使所述樣品與生長(zhǎng)培養(yǎng)基，優(yōu)選含有修復(fù)化合物的所述組合的非選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸，然后使其與也含有所述修復(fù)化合物的修復(fù)培養(yǎng)基接觸。優(yōu)選地，所述修復(fù)培養(yǎng)基是非選擇性修復(fù)培養(yǎng)基，更優(yōu)選是固體，并特別優(yōu)選選擇性瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基。當(dāng)所述修復(fù)培養(yǎng)基是固體時(shí)，這將被稱(chēng)為固體修復(fù)方法。通常，所述固體修復(fù)方法會(huì)涉及使樣品與含有本發(fā)明的修復(fù)化合物組合的非選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。隨后這可以與含有修復(fù)化合物或修復(fù)化合物組合的選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。在這種形式中，選擇性成分和防止ROS形成、減少或去除ROS的一種或多種化合物會(huì)擴(kuò)散到非選擇性培養(yǎng)基中。期望所述非選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以是非選擇性瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基。適當(dāng)?shù)卦谶@種形式中，可以將樣品平鋪到任何非選擇性瓊脂上，然后將含有防止ROS形成、減少或去除ROS的一種化合物或多種化合物的選擇性瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基覆蓋到所述非選擇性瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。在其他備選形式中，可將樣品應(yīng)用到早已含有修復(fù)化合物組合的選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。該選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以是選擇性瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基。可如先前所述進(jìn)行樣品的平板培養(yǎng)。在其他備選形式中，可從水中收集氣溶膠形式的樣品。通常，所述氣溶膠定位在冷卻塔或空調(diào)中。期望在根據(jù)本發(fā)明方法檢測(cè)前從所述氣溶膠中冷凝水。在備選優(yōu)選形式中，步驟(I)包括使來(lái)自氣溶膠的所述樣品與含有修復(fù)培養(yǎng)基的稀釋水，優(yōu)選含有修復(fù)化合物的所述組合的非選擇性修復(fù)培養(yǎng)基接觸，然后使其與也含有修復(fù)化合物的所述組合的生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。在本發(fā)明的所有上述形式中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基應(yīng)該適合于嗜肺軍團(tuán)菌的生長(zhǎng)。在技術(shù)人員熟知的文獻(xiàn)中記載了合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基類(lèi)型。通常，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基應(yīng)該含有活性碳和半胱氨酸。優(yōu)選選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基是選擇性瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并更優(yōu)選是緩沖炭酵母浸膏(BCYE)瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基。BCYE生長(zhǎng)培養(yǎng)基通過(guò)添加抗生素補(bǔ)充物會(huì)變得有選擇性。含有抗生素的高度期望的BCYE生長(zhǎng)培養(yǎng)基稱(chēng)為GVPC (甘氨酸、萬(wàn)古霉素、多粘菌素B、放線菌酮)。在文獻(xiàn)中記載了平板培養(yǎng)方法并為技術(shù)人員所熟知。通常，所述方法會(huì)涉及將一定量的這些水樣品應(yīng)用到已經(jīng)置于培養(yǎng)皿中的瓊脂凝膠上。這可稱(chēng)為培養(yǎng)皿方法或瓊脂平板培養(yǎng)法。瓊脂平板培養(yǎng)的目的是將等分試樣(通常是懷疑含有微生物的100 μ I水，稱(chēng)為細(xì)菌懸浮液)涂布到培養(yǎng)皿中的固體培養(yǎng)基上。玻璃珠或細(xì)胞刮棒可用于將細(xì)菌懸浮液涂布到瓊脂平板上。涂布后，大多數(shù)液體被瓊脂吸收，具有細(xì)菌的薄層保留在瓊脂表面上。通過(guò)溫育，菌落形式的細(xì)菌生長(zhǎng)在瓊脂表面上發(fā)生。所述溫育會(huì)在最適合于微生物的溫度下發(fā)生，其在文獻(xiàn)中得到了很好的記載并為技術(shù)人員所知。通常，所述溫度會(huì)在30° C到50° C之間，例如在37° C左右。
以有效降低微生物的氧化脅迫的量加入修復(fù)化合物的組合。優(yōu)選地，這會(huì)是有效減少或基本上去除微生物細(xì)胞中ROS的量。實(shí)際上，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用修復(fù)化合物的組合引起了嗜肺軍團(tuán)菌特別在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)過(guò)程中滯后期顯著縮短。液體培養(yǎng)基中滯后期的這種縮短導(dǎo)致了在瓊脂平板上獲得存活菌落所需的時(shí)間減少。也期望包括酮酸和/或還原氧清除酶與修復(fù)培養(yǎng)基和/或生長(zhǎng)培養(yǎng)基。不認(rèn)為酮酸和/或還原氧清除酶是本發(fā)明的修復(fù)化合物。然而，包括一種或兩種這些化合物與修復(fù)化合物的任何上述組合是有益的?？赏ㄟ^(guò)文獻(xiàn)中記載的任何已知技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)并定量存活微生物。通常，這表示計(jì)數(shù)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(如營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板)表面上的存活菌落。本發(fā)明的方法利于精確定量測(cè)定嗜肺軍團(tuán)菌的存在。此外，溫育時(shí)間可以顯著減少。所述方法適合于檢測(cè)來(lái)自任何選自工業(yè)冷卻水、飲用水和天然水的樣品中的嗜肺軍團(tuán)菌。本發(fā)明還包含用于更精確檢測(cè)并計(jì)數(shù)懷疑含有所述微生物的樣品中的嗜肺軍團(tuán)菌種的存活微生物的試劑盒，其包含(I)修復(fù)化合物，(2)生長(zhǎng)培養(yǎng)基，(3)溫育手段，(4)檢測(cè)并定量微生物的手段，其中所述微生物是嗜肺軍團(tuán)菌種，并且其中所述修復(fù)化合物包含(a)絲氨酸；(b)蘇氨酸；(c)含有鈣離子的化合物；(d)含有鎂離子的化合物(e)含有鉀離子的化合物。(f)谷氨酸或其鹽，和(g)丙酮酸或其鹽。
試劑盒還含有本發(fā)明第一方面所述的任何實(shí)施方案。試劑盒適合于本發(fā)明方法使用并能夠更精確地計(jì)數(shù)嗜肺軍團(tuán)菌，尤其是更廣譜的嗜肺軍團(tuán)菌菌株。以下實(shí)施例闡明了本發(fā)明。
實(shí)施例選擇化合物并測(cè)定其最佳濃度為了測(cè)定不同化合物的影響，比較2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)利用培養(yǎng)基和補(bǔ)充培養(yǎng)基未補(bǔ)充培養(yǎng)物觀察潛伏期和生長(zhǎng)速率。對(duì)了簡(jiǎn)化，通過(guò)獲得600nm處O. I的光密度所必需的時(shí)間來(lái)評(píng)估潛伏期。對(duì)于所檢測(cè)的所有化合物，通過(guò)在參照培養(yǎng)基(YEC)上獲得的和補(bǔ)充培養(yǎng)基上獲得的潛伏期之間的差異來(lái)獲得潛伏期的增加(由GT表示)。在相同條件下，生長(zhǎng)速率的 比例(表示為RVC)定義為在參照培養(yǎng)基上獲得的生長(zhǎng)速率與在補(bǔ)充培養(yǎng)基(YEC+X)上獲得的生長(zhǎng)速率之間的比例。在參照培養(yǎng)基(YEC)中，嗜肺軍團(tuán)菌菌株具有5小時(shí)到15小時(shí)之間的時(shí)間滯后，并需要大約10小時(shí)來(lái)達(dá)到O. I到O. 3的光密度(表示為0D)。當(dāng)在每一種情況下使用絲氨酸或蘇氨酸作為修復(fù)化合物時(shí)，觀察到了多種嗜肺軍團(tuán)菌菌株的潛伏期和/或生長(zhǎng)速率的提高?；诨衔锏闹亓繉?duì)樣品體積，在例如0.01到5%的劑量范圍內(nèi)觀察到了提高，最佳劑量為每升大約lg。當(dāng)使用10_6到10_2mM，尤其是10_4mM劑量的氯化鈣或氯化鎂時(shí)，觀察到了許多嗜肺軍團(tuán)菌菌株的潛伏期和/或生長(zhǎng)速率的改善。當(dāng)使用I到10_4mM，尤其是大概10_2mM劑量的氯化鉀時(shí)，觀察到了許多嗜肺軍團(tuán)菌菌株的潛伏期和/或生長(zhǎng)速率的改善。修復(fù)化合物的特別有效的組合包括組合A每升Ig丙酮酸鹽、每升Ig絲氨酸、每升Ig蘇氨酸、每升Ig谷氨酸、1(Γ4πιΜ氯化鈣、ΙΟΛιΜ氯化鎂。組合B每升I. 5g丙酮酸鹽、每升I. 5g絲氨酸、每升I. 5g蘇氨酸、每升Ig谷氨酸、1θΛιΜ氯化I丐和10_4mM氯化鎂。組合C每升2g丙酮酸鹽、每升2. 5g絲氨酸、每升Ig蘇氨酸、每升Ig谷氨酸、ΙΟΛιΜ氯化鈣、ΙΟΛιΜ氯化鎂和I. 16xl(T2mM氯化鉀。結(jié)果顯示，幾種組合尤其是對(duì)含有不同菌株的液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)有益。
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)并計(jì)數(shù)懷疑含有存活微生物的樣品中所述存活微生物的方法，包括 (1)使所述樣品的所述微生物與修復(fù)化合物和生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸，和 (2)溫育步驟(I)的產(chǎn)物，和 (3)檢測(cè)并定量所述存活微生物， 其中所述微生物是嗜肺軍團(tuán)菌種，并且其中所述修復(fù)化合物包含 (a)絲氨酸; (b)蘇氨酸; (c)10_6到10_2mM劑量的含有鈣離子的化合物； (d)10_6到10_2mM劑量的含有鎂離子的化合物； (e)含有鉀離子的化合物。
(f)谷氨酸或其鹽，和 (g)丙酮酸或其鹽。
2.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中步驟(I)包括使所述樣品與含有所述修復(fù)化合物的修復(fù)培養(yǎng)基，優(yōu)選非選擇性修復(fù)培養(yǎng)基接觸，然后使其與生長(zhǎng)培養(yǎng)基，優(yōu)選選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述修復(fù)培養(yǎng)基是液體，優(yōu)選是培養(yǎng)液。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中步驟(I)包括使所述樣品與生長(zhǎng)培養(yǎng)基，優(yōu)選非選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸，然后使其與含有所述修復(fù)化合物的修復(fù)培養(yǎng)基接觸。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述修復(fù)培養(yǎng)基是選擇性修復(fù)培養(yǎng)基，優(yōu)選固體，更優(yōu)選選擇性瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中步驟(I)包括使所述樣品與含有所述修復(fù)化合物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基是緩沖炭酵母浸膏(BCYE)或GVPC瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述修復(fù)培養(yǎng)基和/或生長(zhǎng)培養(yǎng)基包括酮酸和/或還原氧清除酶。
9.用于更精確檢測(cè)并計(jì)數(shù)懷疑含有嗜肺軍團(tuán)菌種的存活微生物的樣品中所述存活微生物的試劑盒，其包含 (1)修復(fù)化合物， (2)生長(zhǎng)培養(yǎng)基， (3)溫育手段， (4)檢測(cè)并定量所述微生物的手段， 其中所述微生物是嗜肺軍團(tuán)菌種，并且其中所述修復(fù)化合物包含 (a)絲氨酸; (b)蘇氨酸; (C)含有鈣離子的化合物； (d)含有鎂離子的化合物； (e)含有鉀離子的化合物； (f)谷氨酸或其鹽，和(g)丙酮酸或其鹽。·
全文摘要
用于檢測(cè)并計(jì)數(shù)懷疑含有所述微生物的樣品中的存活微生物的方法(1)使所述樣品的所述微生物與修復(fù)化合物和生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸，和(2)溫育步驟(1)的產(chǎn)物，和(3)檢測(cè)并計(jì)數(shù)所述存活微生物，其中所述微生物是嗜肺軍團(tuán)菌種，并且其中所述修復(fù)化合物包含(a)絲氨酸;(b)蘇氨酸;(c)10-6到10-2mM劑量的含有鈣離子的化合物;(d)10-6到10-2mM劑量的含有鎂離子的化合物;(e)含有鉀離子的化合物；(f)谷氨酸或其鹽，和(g)丙酮酸或其鹽。本發(fā)明還公開(kāi)了用于檢測(cè)并計(jì)數(shù)懷疑含有所述微生物的樣品中的嗜肺軍團(tuán)菌種的存活微生物的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK102971433SQ201180027322
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2011年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者Y·弗維, A·杜克雷, S·迪康, M·派萊姆 申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司, 科學(xué)研究國(guó)家中心