專利名稱：包含低溫大米蛋白濃縮物的食品產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含大米蛋白濃縮物的食品制品和制備該食品制品的方法。
背景技術(shù)：
大米是最主要的食品成分之一，代表著全世界一半以上的人口的主糧。例如，大米在特色食品配方中用作淀粉源，在生產(chǎn)谷氨酸一鈉、酒精和啤酒的工藝中用作碳源。另外，大米被用作乳品(參見第4，744，992號(hào)美國專利)和嬰兒食品配方的組分。大米由75-80%淀粉、8-9%蛋白質(zhì)、9-12%水分和2. 4-5%其他組分構(gòu)成。高分子量貯藏蛋白即谷蛋白占大米蛋白的80-90%。其余10-20%的蛋白質(zhì)是白蛋白、球蛋白和谷醇溶蛋白。大米的蛋白質(zhì)組分具有幾種特別理想的特性。例如，與其他植物蛋白質(zhì)相比，大米蛋白變應(yīng)原性低并富含必需氨基酸。例如，在所有食品蛋白質(zhì)當(dāng)中，大米蛋白的甲硫氨酸水平最高(>4.0%)。但是，對(duì)大米蛋白在食品和飲料配方中的功能性質(zhì)和生理作用的研究卻不夠。已報(bào)道大米蛋白具有有益的生理作用，包括降低膽固醇的作用，不過大米蛋白發(fā)揮這些作用的機(jī)制沒有完全闡明。參見例如Yang等人，(2007)Biosc1. Biotechnol. Biochem.
(《生物科學(xué)生物技術(shù)生物化學(xué)雜志》)，第71卷第694-703頁。在這個(gè)方面，大米蛋白與大豆蛋白和從大豆蛋白水解物獲得的高分子量級(jí)分具有相似的性質(zhì)。參見例如Carroll等人，(1991) J. Am. Dietetic Assoc.(《美國營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志》)，第 91 卷第 820-827 頁；Anderson 等人，(1995)New Engl. J. Med.( 《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》)，第333卷第276-282頁。大米淀粉水解物和/或高蛋白大米粉的生產(chǎn)工藝通常包括將大米粉的漿液與熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在高于75°C的溫度下蒸煮。可采用高堿性提取OpHlO. O)來分離不溶性蛋白質(zhì)。參見Shaw等人，(1992)Biosc1. Biotechnol. Biochem.(《生物科學(xué)生物技術(shù)生物化學(xué)雜志》)，第56卷第1071-1073頁；第4，990，344號(hào)美國專利。但是，使用高溫工藝(HT工藝)會(huì)使大米蛋白變性。參見Ju等人，(2001) J. Food Science (《食品科學(xué)雜志》)，第66卷第229-232頁。此外，由于大米蛋白濃縮物具有吸濕性，將HT工藝制備的大米蛋白濃縮物摻入到食品制品中的努力遭遇挫折。HT工藝生產(chǎn)的濃縮物會(huì)吸附大量的水分，導(dǎo)致包含大米濃縮物的食品具有易碎的質(zhì)構(gòu)。制備可加工的面團(tuán)(dough)可能需要加入大量的水，這會(huì)縮短貨架期。WO 2005/082155A2公開了用低溫工藝(LT工藝)生產(chǎn)高純度大米蛋白濃縮物的方法。在LT工藝中，使大米底物與兩種淀粉加工酶接觸，其中至少一種酶是顆粒淀粉水解酶(GSHE)。顆粒大米淀粉在低于變性溫度的溫度下和在大米蛋白的等電點(diǎn)pH之下或附近發(fā)生水解。如W02005/082155所示，與常規(guī)的HT工藝相比，LT工藝有利地生產(chǎn)出可溶性蛋白質(zhì)百分?jǐn)?shù)更高的大米蛋白濃縮物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過LT工藝制備的大米蛋白濃縮物。與通過HT工藝制備的大米濃縮物相比，該大米濃縮物具有有利的特性。例如，LT工藝能生產(chǎn)具有改進(jìn)的質(zhì)構(gòu)和內(nèi)聚性的大米蛋白濃縮物。這些有利性質(zhì)得出制備含有大米蛋白濃縮物的食品制品的改進(jìn)工藝。例如，與從相似數(shù)量的大豆蛋白制備的濕面團(tuán)相比，該大米蛋白濃縮物可以以含有小于約45%水分的濕面團(tuán)的形式添加到食品產(chǎn)品。這個(gè)性質(zhì)有利地給食品產(chǎn)品提供改進(jìn)的貨架期和更可口的質(zhì)構(gòu)。此外，LT工藝生產(chǎn)的大米蛋白濃縮物具有有利的生理作用它能降低膽固醇，提高乳酸脫氫酶(LDH)活性和降低血尿素氮(BUN)。含有該大米蛋白濃縮物的食品制品(例如快餐棒)因此可用作膳食補(bǔ)充物。在一個(gè)方面，提供包含通過低溫工藝生產(chǎn)的大米蛋白濃縮物的食品產(chǎn)品。該低溫工藝包括(a)用(i)具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酶和(ii)第二淀粉水解酶在72°C或低于72°C的溫度下和在3. O至6. 5的pH下水解大米底物中的大部分淀粉一段時(shí)間，該時(shí)間足以獲得增溶的淀粉級(jí)分和含有不溶性大米蛋白的殘余物級(jí)分；和

(b)將該增溶的淀粉級(jí)分與該殘余物級(jí)分分離以獲得大米蛋白濃縮物。該食品產(chǎn)品含有濕面團(tuán)形式的大米蛋白濃縮物。該食品產(chǎn)品可以是飲料、食品補(bǔ)充物或食品補(bǔ)充物的成分、功能食品或功能食品的成分、動(dòng)物飼料添加劑或動(dòng)物飼料添加劑的成分、或者適合人消費(fèi)的食品添加劑。在另一個(gè)方面，提供制備上述食品產(chǎn)品的方法。該方法可包括(a)用(i)具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酶和(ii)第二淀粉水解酶在72°C或低于72°C的溫度下和在3. O至6. 5的pH下水解大米底物中的大部分淀粉一段時(shí)間，該時(shí)間足以獲得增溶的淀粉級(jí)分和含有不溶性大米蛋白的殘余物級(jí)分；和(b)將該增溶的淀粉級(jí)分與該殘余物級(jí)分分離以獲得大米蛋白濃縮物。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有GSH活性的酶是葡糖淀粉酶，其可衍自腐質(zhì)霉屬(Humicola)、根霉屬(Rhizopus)或曲霉屬(Aspergillus)的菌株。作為另一種選擇，GSHE可以是α-淀粉酶。第二淀粉水解酶也可以是GSHE，例如衍自細(xì)菌來源的α-淀粉酶。但是，第二淀粉水解酶還可以是不屬GSHE的酶，如β_淀粉酶或普魯蘭酶。在一些實(shí)施方案中，GSHE從在木霉屬(Trichoderma)菌株或曲霉屬(Aspergillus)菌株中異源表達(dá)獲得。在上述方法中，可將大米底物調(diào)成干固體含量在10至55%之間的漿液。在一些實(shí)施方案中，上述工藝的溫度可在70°C至55°C之間。所述方法還可包括將在(b)部分中獲得的大米蛋白濃縮物用具有GSH活性的酶和淀粉水解酶在3. O至6. 5的pH下和在70°C至55°C的溫度下進(jìn)行酶促水解，以獲得包括增溶的淀粉和不溶性大米蛋白的級(jí)分；和(d)將級(jí)分進(jìn)行分離以獲得高純度大米蛋白濃縮物。上述方法還可包括純化和/或干燥該大米蛋白濃縮物。該大米蛋白濃縮物的蛋白質(zhì)含量可為至少20%,該高純度大米蛋白濃縮物的蛋白質(zhì)含量可為至少60%。附圖簡(jiǎn)述本說明書附有附圖，附圖構(gòu)成說明書的一部分并舉例說明各個(gè)實(shí)施方案。

圖1比較了用來制備濕面團(tuán)的大米和大豆蛋白濃縮物的水合作用。
具體實(shí)施例方式在低溫下制備的大米蛋白濃縮物表現(xiàn)出改進(jìn)的功能性和有利的生理好處，包括降低的膽固醇、提高的乳酸脫氫酶活性和降低的血尿素氮。大米蛋白濃縮物的使用改進(jìn)了含有該濃縮物的食品制品的配制中的加工步驟。該食品產(chǎn)品有利地顯示出延長(zhǎng)的貨架期和改進(jìn)的可口質(zhì)構(gòu)。I定義和縮寫除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。根據(jù)本具體實(shí)施方式
，適用下面的縮寫和定義。1.1.定義術(shù)語“大米”指歸類為水稻(Oryza saliva)的植物。術(shù)語“大米底物”包括大米(精米或糙米)的所有形式或部分，如全谷、碎谷、大米碎粒和大米粉。術(shù)語“淀粉”指分子式為(C6HltlO5)n (其中η可為任何數(shù)目)的復(fù)雜植物多糖碳水化合物。術(shù)語“顆粒淀粉”指未蒸煮的(生的)淀粉，其未進(jìn)行糊化。術(shù)語“糊化”指淀粉分子增溶而形成粘稠懸浮液。術(shù)語“大米蛋白濃縮物”指具有大于約10%(w/w)的大米蛋白濃縮物的大米蛋白級(jí)分?！凹s”當(dāng)修飾參數(shù)時(shí)，指通常與測(cè)量該參數(shù)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)誤差的程度。術(shù)語“高純度大米蛋白濃縮物”指具有至少約60%的大米蛋白含量的蛋白質(zhì)級(jí)分。這個(gè)術(shù)語所涵蓋的大米蛋白含量具體包括例如至少63%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、72%、75%或80%或更高。術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”可互用。術(shù)語“變性溫度”指蛋白質(zhì)`失去其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的溫度。術(shù)語“等電點(diǎn)”指蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)混合物攜帶零凈電荷時(shí)的溶液pH。術(shù)語“葡萄糖當(dāng)量”(DE)是以干重計(jì)作為D-葡萄糖計(jì)算的總還原糖的量度。非水解的顆粒淀粉的DE幾乎為零，而D-葡萄糖的DE為100。術(shù)語“總糖含量”指淀粉組合物中存在的總糖含量。術(shù)語“干固形物含量”(ds)指按干重計(jì)漿液的總固形物(%)。術(shù)語“漿液”指包含不溶物的含水混合物?！鞍倮嵌取敝副娝苤挠糜跍y(cè)量給定溫度下溶液的糖含量的比重計(jì)標(biāo)度。百利糖度標(biāo)度測(cè)量每100克糖水溶液中存在的蔗糖克數(shù)(總?cè)芙夤腆w含量)。百利糖度測(cè)量常常通過比重計(jì)或折射計(jì)進(jìn)行。術(shù)語“淀粉的水解”指加入水分子切割糖苷鍵。詞語“大部分的淀粉”意指至少80%的淀粉。術(shù)語“聚合度”(DP)指給定的糖(saccharine)中無水卩比喃葡萄糖的數(shù)目(η)。例如，單糖如葡萄糖和果糖為DPI。二糖如麥芽糖和蔗糖為DP2的例子。“DP3+”表示聚合度大于3的聚合物。術(shù)語“顆粒淀粉水解酶”和“具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酶”(統(tǒng)稱GSHE)在本文中用來指具有水解顆粒形式的淀粉的能力的葡糖淀粉酶或α-淀粉酶。更普通的術(shù)語“淀粉水解酶”指GSHE或另一種水解淀粉的酶。非葡糖淀粉酶或α-淀粉酶的淀粉水解酶包括但不限于普魯蘭酶、β-淀粉酶、纖維素酶、果膠酶和葡聚糖酶。術(shù)語“重組GSHE”、“重組表達(dá)的GSHE”和“重組產(chǎn)生的GSHE”指在宿主細(xì)胞中從異源多核苷酸產(chǎn)生的成熟GSHE蛋白序列。符號(hào)“r”可用來表示重組蛋白。例如，在里氏木霉(Trichoderma reesei)中表達(dá)的灰腐質(zhì)霉高溫變種(Humicola grisea var. thermo idea)GSHE表示為“rH-GSHE”。術(shù)語“天然GSHE”和“nGSHE”意指衍自宿主生物的GSHE，其中編碼GSHE的多核苷酸為該宿主生物的內(nèi)源多核苷酸。術(shù)語“淀粉酶”指能催化淀粉的水解的酶。術(shù)語“α-淀粉酶(EC3.2.1.1)”指能催化α-1，4-糖苷鍵的水解的酶。這些酶還曾被描述為實(shí)現(xiàn)含有1，4-D_葡萄糖單元的多糖中的1，4-D_糖苷鍵的外切水解或內(nèi)切水解的那些酶。用于描述這些酶的另一術(shù)語是糖原酶。示例性的酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶(α -1, 4-glucan4-glucanohydrase glucanohydrolase)。術(shù)語“葡糖淀粉酶”指淀粉葡糖苷酶類別的酶(EC. 3. 2. 1.3，葡糖淀粉酶，α -1, 4-D-葡聚糖葡萄糖水解酶)。這些酶是外切酶，從直鏈淀粉和支鏈淀粉分子的非還原末端釋放葡糖基殘基。這類酶還水解α-1，6和α-1，3鍵，盡管水解的速度遠(yuǎn)慢于α _1，4鍵。術(shù)語“糖基化”指蛋白質(zhì)通過碳水化合物部分的加入而發(fā)生的轉(zhuǎn)錄后修飾，其中碳水化合物進(jìn)行N連接或O連接而產(chǎn)生糖蛋白。糖蛋白的N連接的碳水化合物部分通過糖苷鍵連接到天冬酰胺殘基的P-酰胺氮。O連接的碳水化合物經(jīng)絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基基團(tuán)通過糖苷鍵連接到蛋白質(zhì)?！靶盘?hào)序列”意指結(jié)合到蛋白質(zhì)的N末端部分的氨基酸序列，其能促進(jìn)成熟形式的該蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外。成熟形式的胞外蛋白質(zhì)缺乏該信號(hào)序列，其在分泌過程中被切割?！盎颉敝竻⑴c產(chǎn)生多肽的DNA區(qū)段，包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，以及各個(gè)編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。術(shù)語“核酸”意指單鏈 或雙鏈的DNA、RNA以及它們的化學(xué)修飾物。術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互用。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，某種特定氨基酸可用超過一種密碼子來編碼，因此本發(fā)明涵蓋編碼某種特定氨基酸序列的多個(gè)多核苷酸。“載體”是指設(shè)計(jì)用來將核酸引入一種或多種細(xì)胞類型中的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌體顆粒、表達(dá)盒等等?！氨磉_(dá)載體”意指這樣的DNA構(gòu)建體，其包含DNA序列和該DNA序列有效連接的能夠?qū)崿F(xiàn)該DNA在合適宿主中表達(dá)的合適控制序列。這種控制序列可包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、任選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、編碼合適的mRNA上核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、增強(qiáng)子以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。術(shù)語“有效連接”指毗鄰關(guān)系，其中各元件處于能讓它們?cè)诠δ苌舷嚓P(guān)的布置關(guān)系。例如，如果某啟動(dòng)子控制某編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列有效連接。術(shù)語“選擇性標(biāo)記”指這樣的基因，其能夠在宿主中表達(dá)，使得易于選擇那些含有所引入的核酸或載體的宿主。選擇性標(biāo)記的例子包括但不限于抗微生物劑(例如潮霉素、博來霉素或氯霉素)或者賦予宿主細(xì)胞代謝益處(如營(yíng)養(yǎng)益處)的基因。術(shù)語“衍自”涵蓋術(shù)語“來源于”、“獲自或可獲自”和“分離自”?！八拗骶辍被颉八拗骷?xì)胞”意指對(duì)于包含編碼本發(fā)明GSHE的多核苷酸的表達(dá)載體或DNA適合的宿主。例如，“宿主細(xì)胞”可意指從絲狀真菌菌株(如木霉屬的種(Trichoderma sp.))的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞和原生質(zhì)體兩者。術(shù)語“絲狀真菌”指真菌亞門(Eumycotina)的所有絲狀形式，包括但不限于里氏木霉(T. reesei)(之前分類為長(zhǎng)梗木霉(T.1ongibrachiatum),目前也稱紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、綠色木霉(T. viride)、康氏木霉(T. koningli)、哈茨木霉(T. harzianum)、青霉菌屬的種(Penicillium sp.)、腐質(zhì)霉屬的種(Humicola sp)(包括特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)和灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea))、金孢子菌屬的種(Chrysosporium sp.)(包括C. lucknowense)、粘帚霉屬的種(Gliocladium sp.)、曲霉屬的種(Aspergillus sp.)(包括米曲霉(A. oryzee)、構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)、黑曲霉(A. niger)和泡盛曲霉(A. awamori))、鐮刀菌屬的種(Fusarium sp·)、鏈孢霉屬的種(Neurospora sp·)、肉座菌屬的種(Hypocreasp.)和裸孢殼屬的種(Emericella sp.)。術(shù)語“接觸”指將各種酶設(shè)置成與分別的大米底物充分緊密接近。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，將酶的溶液與分別的大米底物混合可實(shí)現(xiàn)接觸。術(shù)語“溫育”指將大米底物與水解酶在給定的條件下混合達(dá)確定的一段時(shí)間。術(shù)語“酶促轉(zhuǎn)化”指對(duì)大米底物進(jìn)行修飾以產(chǎn)生可溶性的水解顆粒大米淀粉，優(yōu)選產(chǎn)生葡萄糖。術(shù)語“漿液”指含有不溶性顆粒淀粉的含水混合物。有時(shí)，術(shù)語“漿液”與“懸浮液”可互用。術(shù)語“培養(yǎng)”指在液體或固體培養(yǎng)基中在合適的條件下生長(zhǎng)微生物細(xì)胞群體。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)指通常在容器或反應(yīng)器中將顆粒淀粉底物通過發(fā)酵而生物轉(zhuǎn)化成葡萄糖糖漿或其他需要的終產(chǎn)物。術(shù)語“回收的”、“離析的”和“分離的”指從至少一種與其天然結(jié)合的組分移除開來的蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸或氨基酸。這些術(shù)語還指將包含可溶性淀粉水解物的混合物與包含基本上不溶性大米蛋白的殘余物分離開來。指涉細(xì)胞的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)基因的”是指該細(xì)胞有非天然(異源)核酸序列整合到其基因組中或作為附加型質(zhì)粒存在，該附加型質(zhì)粒經(jīng)過多個(gè)傳代都得到保留。術(shù)語“表達(dá)”是指基于基因的核酸序列而產(chǎn)生多肽的過程。該過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩者。在將核酸序列插入細(xì)胞中的語境下的術(shù)語“引入”，意指“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”。該術(shù)語包括將核酸序列摻入真核或原核細(xì)胞中，在其中核酸序列可被摻入細(xì)胞的基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中、轉(zhuǎn)變成自主復(fù)制子或被瞬時(shí)表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。術(shù)語“比活性”意指一種酶單位，定義為在特定條件下每單位時(shí)間被酶制劑轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物的摩爾數(shù)。除非另有指明，否則比活性可以以單位/毫克蛋白來表示。本文所用的“酶活性”指酶對(duì)其底物的作用。術(shù)語“顆粒淀粉水解酶單位”定義為在測(cè)定條件下(例如pH4. 5下50°C，或者pH5. O下25°C )每分鐘從顆粒淀粉底物產(chǎn)生Img的葡萄糖所需的酶量。術(shù)語“食品補(bǔ)充物”指補(bǔ)給人的膳食中缺失或不被足量消費(fèi)的營(yíng)養(yǎng)物的食品。術(shù)語“功能食品”指包含能提供額外營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的添加劑的食品。術(shù)語“動(dòng)物飼料”指特別設(shè)計(jì)給非人動(dòng)物消費(fèi)的食品。術(shù)語“食品添加劑”指添加到食品以改進(jìn)其貨架期的組分。單數(shù)名詞包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文清楚表明并非如此。本文所用的術(shù)語“包含”及其同源詞以其“包括在內(nèi)”的含義使用；也就是說，與術(shù)語“包括”及其相應(yīng)的同源詞等同。12 縮寫除非另有指明 ，否則適用以下縮寫AAU α -淀粉酶單位；
ATCC 美國模式培養(yǎng)物保藏所；BUN血尿素氮；DE葡萄糖當(dāng)量；DNS3，5 二硝基水楊酸；DP聚合度；ds干固形物含量；EC酶學(xué)委員會(huì)；EDCC含有膽 固醇的實(shí)驗(yàn)膳食；GLDH谷氨酸脫氫酶；GSH顆粒淀粉水解；GSHE顆粒淀粉水解酶；⑶葡糖淀粉酶單位；HDL-C 高密度脂蛋白膽固醇；HFCS高果糖玉米糖漿；H-GA腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶；HT工藝工藝高溫工藝；LDH乳酸脫氫酶；LBLuria Bertani 肉湯；LT工藝低溫工藝；MOPS嗎啉丙磺酸；NADH還原型煙堿腺嘌呤二核苷酸；NCBI美國國家生物技術(shù)信息中心；NRRL北部地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室美國農(nóng)業(yè)研究囷種保減中心；PEG聚乙二醇；PNP-G7 對(duì)硝基苯麥芽庚糖苷；RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)；SD沙氏葡萄糖肉湯；TC總膽固醇；TG甘油三酯；YM酵母麥芽浸膏肉湯；以及Wt重量。2.生產(chǎn)大米蛋白濃縮物的低溫工藝(LT工藝)可用WO 2005/082155 A2中描述的LT工藝生產(chǎn)大米蛋白濃縮物。該方法包括將大米底物在低于大米蛋白變性溫度的溫度下和在該蛋白在該大米底物中的等電點(diǎn)PH之下或附近進(jìn)行酶促水解。獲得兩個(gè)級(jí)分(I)淀粉水解物的增溶淀粉級(jí)分和(2)含有不溶性大米蛋白的殘余物級(jí)分?？蓪⒃鋈艿矸奂?jí)分與殘余物級(jí)分分離開來，并可從殘余物級(jí)分獲得大米蛋白濃縮物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在不進(jìn)一步操作殘余物級(jí)分的情況下獲得大米蛋白濃縮物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將殘余物級(jí)分進(jìn)一步加工以提聞大米蛋白在該級(jí)分中的重量百分比。在一些實(shí)施方案中，大米蛋白濃縮物是高純度大米蛋白濃縮物。
21大米底物本發(fā)明工藝中應(yīng)用的大米底物可獲自任何已知的來源。例如,大米底物可以是大米粉或者精米底物。大米底物可含有例如約6-10%的總蛋白質(zhì)含量(NX5. 95 #代表由凱氏定氮法測(cè)定的總氮百分?jǐn)?shù)，而5. 95是大米的換算系數(shù));約70-82%碳水化合物；約9-12%水分；約O. 4-1. 5%粗脂肪；約O. 6-0. 8%灰分和約O. 2-0. 6%纖維。谷粒中存在的大米蛋白在水中具有有限的溶解度。這些蛋白質(zhì)主要是不溶性(堿溶性)谷蛋白(約80-90%);鹽溶性球蛋白(7-15%);水溶性白蛋白(9-10%);和醇溶性谷醇溶蛋白(約2-5%) ο參見Houston等人，(1970)CerealChem(《谷類化學(xué)》),第47卷第5頁；Perdon 等人，(1978)Phytochem (《植物化學(xué)》)，第 17 卷第 351 頁；Landers 等人，(1994)CerealChem (《谷類化學(xué)》)，第71卷第409-11頁。在一些實(shí)施方案中，可將大米底物粉碎至所需的顆粒大小后再分散在水中，或者可在加工過程中進(jìn)行濕磨。可在加工之前加水以形成漿液。漿液中的大米底物可包含約10至約55%ds、約20至約50%ds、約25至約45%ds、約20至約40%ds、約20至約35%ds或者約30 至 35%ds。2. 2.顆粒淀粉水解酶(GSHE)本文公開的方法中使用的淀粉水解酶中的至少一種是顆粒淀粉水解酶(GSHE)。GSHE具有葡糖淀粉酶活性或α -淀粉酶活性。參見Tosi等人，(1993)，Can. J. Microbiol.(《加拿大微生物學(xué)雜志》)，第39卷第846-55頁；Kanlayakrit等人，(1987) J. Ferment.Technol.(《發(fā)酵技術(shù)雜志》)，第65卷第379-85頁。GSHE可天然存在或者可重組產(chǎn)生。重組產(chǎn)生的GSHE可以是經(jīng)遺傳修飾的。已從真菌細(xì)胞(如腐質(zhì)霉屬的種(Humicola sp.)、曲霉屬的種(Aspergillus sp.)、毛霉屬的種(Mucor sp.)和根霉屬的種(Rhizopus sp.))回收了天然存在的GSHE。例如,在Ashikari等人，(1986) ,Agric. Biol. Chem.(《農(nóng)業(yè)生物化學(xué)》)，第50卷第957-64頁和第4`，863，864號(hào)美國專利中描述了來自米根霉(Rhizopusoryzae)的 GSHE。在 Allison 等人，(1992)，Curr. Genet.(《當(dāng)代遺傳學(xué)》)，第 21 卷第 225-29頁和 EP 171 218 中描述了灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea) GSHE。在 Hayashida 等人，(1989),Agric. Biol. Chem.(《農(nóng)業(yè)生物化學(xué)》),第53卷第923-29頁中描述了泡盛曲霉kawachi變種(Aspergillus awamori var. kawachi)GSHE。在 Shibuya 等人，(1990), Agric. Biol. Chem.(《農(nóng)業(yè)生物化學(xué)》)，第54卷第1905-14頁中描述了 Aspergillus shirousami GSHE。還可從真菌回收GSHE，所述真菌包括ATCC 16453、北部地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室(NRRL) 15219、NRRL 15220、NRRL 15221、NRRL 15222、NRRL15223、NRRL 15224 和 NRRL15225以及它們的經(jīng)遺傳改變的菌株。參見EP 171 218。在一個(gè)實(shí)施方案中，GSHE可衍自灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)的菌株,特別是灰腐質(zhì)霉高溫變種(Humicola grisea)var.thermo idea的菌株(H-GSHE)。參見第4，618，579號(hào)美國專利。在另一個(gè)實(shí)施方案中，GSHE可衍自泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的菌株,特別是泡盛曲霉kawachi變種(A. awamorivar. kawachi)的菌株(A-GSHE)。參見 Hayashida 等人，(1989) ,Agric. Biol. Chem.(《農(nóng)業(yè)生物化學(xué)》)，第53卷第923-29頁。在又一個(gè)實(shí)施方案中，GSHE酶可衍自根霉屬，如得氏根霉(R. niveus)的Koji菌株(以商品名“CU C0NC”出售)或者以商品名GLUCZYME出售的來自根霉屬的酶。221 α -淀粉酶
在一些實(shí)施方案中，使用α-淀粉酶。α-淀粉酶是具有酶學(xué)委員會(huì)(EC)編號(hào)EC 3.2.1.1的酶。在一些實(shí)施方案中，α-淀粉酶是熱穩(wěn)定的細(xì)菌α-淀粉酶。合適的α-淀粉酶包括天然存在的淀粉酶以及重組產(chǎn)生的和突變的α-淀粉酶。α-淀粉酶可衍自芽孢桿菌屬的種，如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、脂肪嗜熱芽孢桿菌(B. stearothermophiIus)、遲緩芽抱桿菌(B.1entus)、地衣芽抱桿菌(B.1icheniformis)、凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)和解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)(參見例如第5，763，385 號(hào)、第 5，824，532 號(hào)、第 5，958，739 號(hào)、第 6，008，026 號(hào)和第 6，361，809 號(hào)美國
專利。產(chǎn)生有用的淀粉酶的芽孢桿菌菌株包括具有美國模式培養(yǎng)物保藏所編號(hào)(ATCCs)39709、ATCCl 1945、ATCC 6598、ATCC 6634、ATCC 8480、ATCC 9945A 的菌株。有用的市售α -淀粉酶包括 SPEZYME AA、SPEZYME FRED、GZYME G997 (杰能科公司(Genencor)，其為丹尼斯克公司(Danisco Α/S)的分公司)、TERMAMYL 120-L、TERMAMYL LC、TERMAMYL SC 和SUPRA (諾維信公司(Novozymes))。2. 2. 2. α -淀粉酶活件α -淀粉酶單位(AAU)指按照第5，958，739號(hào)美國專利(其通過引用并入本文)中公開的方法測(cè)量的α-淀粉酶活性。一個(gè)單位的AAU指在指定條件下每分鐘水解IOmg的淀粉所需的酶量。α-淀粉酶活性的測(cè)定法使用對(duì)硝基苯麥芽庚糖苷(PNP-G7)作為底物，其非還原末端糖被化學(xué)封閉。PNP-G7可被內(nèi)切淀粉酶例如α-淀粉酶切割。切割后，α-葡糖苷酶和葡糖淀粉酶消化該底物以釋放游離的PNP分子，從而顯示黃顏色，可通過可見光分光光度法在410nm處測(cè)量。PNP釋放速率與α-淀粉酶活性成比例。比照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品計(jì)算給定樣品的AAU。2. 2. 3.葡糖淀粉酶葡糖淀粉酶(EC3. 2 .1. 3)從淀粉的非還原端相繼去除葡萄糖單元。該酶可同時(shí)水解淀粉的直鏈和支鏈糖苷鍵，即可同時(shí)水解直鏈淀粉和支鏈淀粉。葡糖淀粉酶可衍自細(xì)菌、植物和真菌。選自曲霉屬、根霉屬、腐質(zhì)霉屬和毛霉屬的真菌的葡糖淀粉酶已從包括以下的真菌菌株衍生得到黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori) >得氏根霉(Rhizopus niveus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、米黑毛霉(Mucor miehe)、灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)、Aspergillus shirousami和柔毛腐質(zhì)霉(嗜熱真菌屬)(Humicola (Thermomyces) Ianiginosa)(參見例如 Boel 等人，(1984), EMBO J (《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》)，第 3 卷第 1097-1102 頁；W0 92/00381 ；W0 00/04136 ;Chen 等人，(1996)，Prot. Eng,第 9 卷第 499-505 頁；Taylor 等人，(1978), Carbohydrate Res (《碳水化合物研究》)，第61卷第301-08頁；以及Jensen等人,(1988), Can. J. Microbiol.(《加拿大微生物學(xué)雜志》)，第34卷第218-23頁)。商業(yè)使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶例如從黑曲霉產(chǎn)生(來自杰能科公司(Genencor),其為丹尼斯克公司(Danisco Α/S)的分公司)的0PTIDEXL -400and GZYME G9904X，或者從根霉屬的種產(chǎn)生(CU. C0NC ，新日本化學(xué)株式會(huì)社(ShinNihon Chemicals) ;GLUCZYME ,日本天野製薬株式會(huì)社(Amano Pharmaceuticals))。葡糖淀粉酶可在異源宿主細(xì)胞(如木霉屬宿主)中表達(dá)。例如，如第7，303，899號(hào)美國專利中所描述，來自灰腐質(zhì)霉高溫變種(Humicola grisea var. thermo idea)的腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶(H-GA)可從木霉屬宿主重組表達(dá)。經(jīng)過典型的發(fā)酵后，可將發(fā)酵液離心以分離生物量。可采用超濾法濃縮含有所表達(dá)的葡糖淀粉酶的澄清培養(yǎng)物過濾液后再在應(yīng)用研究中使用。2.2.4.葡糖淀粉酶活性葡糖淀粉酶活性例如通過測(cè)量在pH4. 6、40°C下溫育過程中從2%(w/v)可溶性淀粉底物溶液釋放的還原糖來進(jìn)行測(cè)定。一葡糖淀粉酶單位(GU)定義為在指定的條件下每小時(shí)從可溶性淀粉以葡萄糖形式釋放一毫克還原糖所需的酶量。2.3.重纟目產(chǎn)牛的GSHEGSHE可以是重組表達(dá)的GSHE(rGSHE)。rGSHE包括從一個(gè)物種獲得并在另一異源物種中表達(dá)的天然存在的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，可通過遺傳工程修飾天然存在的蛋白質(zhì)的序列。經(jīng)改變的蛋白質(zhì)序列較之天然存在的序列可具有有利的性質(zhì)，例如提高的比活性或者熱穩(wěn)定性。rGSHE序列被修飾的程度可不同。例如，rGSHE可與來自相同物種的天然存在的 GSHE 序列具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%或99%序列同一性。rGSHE可在與獲得G SHE的菌株不同的宿主真菌菌株中表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，真菌菌株是曲霉屬的種(Aspergillus sp.)、木霉屬的種(Trichoderma sp.)、鐮刀菌屬的種(Fusarium sp.)或青霉屬的種(Penicillium sp.)的絲狀真菌菌株。真菌宿主包括構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)、泡盛曲霉(A. awamori)、米曲霉(A. oryzee)、棘抱曲霉(A. aculeatus)、黑曲霉(A. niger)、日本曲霉(A. japonicus)、里氏木霉(T. reesei)、綠色木霉(T. viride)、尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)和爺病鐮刀菌(F. solani)。黑曲霉菌株在Ward等人，(1993),Appl. Microbiol. Biotechnol.(《應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)》)，第39卷第738-43頁以及Goedegebuur等人，(2002), Curr. Gene (《當(dāng)代基因》)，第41卷第89-98頁中有公開。里氏木霉(T. reesei)的合適菌株例如包括 ATCC 1363UATCC 2692UATCC 56764,ATCC 56765、ATCC56767和NRRL 15709。在一些實(shí)施方案中，宿主菌株可以是RL-P37的衍生物，其在Sheir-Neiss 等人，(1984), Appl. Microbiol. Biotechnol.(《應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)》)，第20卷第46-53頁中公開。表達(dá)GSHE的宿主菌株可能先前已通過遺傳工程被操縱過。在一些實(shí)施方案中，可使真菌宿主的各種基因失活。這些基因可編碼纖維素分解酶，如內(nèi)切葡聚糖酶(KG)和外切纖維二糖水解酶(CBH)(例如cbhl、cbh2、egll和egl3)。第5，650，322號(hào)美國專利公開了RL-P37的衍生菌株，其在cbhl基因和cbh2基因中具有缺失。2. 4.載體和真菌轉(zhuǎn)化可通過包含有效連接到GSHE編碼序列的調(diào)節(jié)序列的載體(特別是表達(dá)載體)，將編碼GSHE的異源多核苷酸引入到真菌宿主細(xì)胞中。載體可以是任何這樣的載體，其當(dāng)被引入到真菌宿主細(xì)胞中時(shí)能整合到宿主細(xì)胞基因組中，其可在該基因組中復(fù)制。美國真菌遺傳資源中心(Fungal Genetics Stock Center)白勺菌株目錄(在互聯(lián)網(wǎng)上》www. FGSC. net〈〈)列舉了合適的載體。合適的表達(dá)載體和/或整合載體的另外的例子可在Van den Hondel等人，(1991), Moee Gene Manipulations in Fungi (《在真菌中的更多基因操縱》)，Bennett等人編輯，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，第396-428頁以及第5，874，276號(hào)美國專利中找到。示例性的載體包括 PFB6、pBR322、PUC18、pUClOO 和 pENTR/D?？蓪⒕幋aGSHE的核酸有效連接到在真菌宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的合適啟動(dòng)子中。該啟動(dòng)子可衍自編碼對(duì)于該宿主細(xì)胞而言同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。在木霉屬宿主中有用的啟動(dòng)子包括例如cbhl、cbh2、egll和egl2。在一個(gè)實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子可以是該宿主細(xì)胞的天然啟動(dòng)子。例如，當(dāng)里氏木霉(T. reesei)可為該宿主時(shí),該啟動(dòng)子可以是天然的里氏木霉啟動(dòng)子，如cbhl，其為以登錄號(hào)D86235寄存在GenBank的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下活躍的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子是該真菌宿主細(xì)胞的異源啟動(dòng)子。有用的啟動(dòng)子的其他例子包括來自泡盛曲霉(A. awamori)和黑曲霉(A. niger)葡糖淀粉酶基因的啟動(dòng)子。參見Nunberg等人，(1984) ,Mol. Cell Biol.(《分子與細(xì)胞生物學(xué)》)，第4卷第2306-15頁以及Boel等人，(1984)，EMBO J (《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》)，第3卷第1581-85頁。例外，可采用里氏木霉xinl基因和纖維二糖水解酶基因。參見EP 137 280 Al。可將GSHE編碼序列有效連接到信號(hào)序列。編碼信號(hào)序列的DNA可與待表達(dá)的GSHE基因天然相關(guān)。例如，信號(hào)序列可由灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)或泡盛曲霉(Aspergillusawamori) GSHE基因編碼。信號(hào)序列和啟動(dòng)子序列可衍自相同來源。例如，信號(hào)序列可以是有效連接到cdhl啟動(dòng)子的cdhl信號(hào)序列。表達(dá)載體通常包括終止序列。終止序列和啟動(dòng)子序列可衍自相同來源。在一些實(shí)施方案中，終止序列對(duì)于宿主細(xì)胞而言是同源的。合適的終止子序列可以是衍自木霉屬菌株(如里氏木霉)的cbhl。其他有用的真菌終止子包括來自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的終止子。參見Nunberg等人，(1984)，同上，以及Boel等人，(1984)，同上。表達(dá)載體通常包括選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記的例子包括那些賦予抗微生物抗性(例如潮霉素和腐草霉素)的標(biāo)記。也可使用營(yíng)養(yǎng)選擇性標(biāo)記，包括amdS標(biāo)記、argB標(biāo)記和pyr4標(biāo)記。在用于木霉屬的轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)中有用的標(biāo)記例如在以下文獻(xiàn)中有描述Biqtech_ct of Filamentous Fungi (《絲狀真菌的生物技術(shù)》)，F(xiàn)inkelstein等人編輯，Butterworth-Heinemann 出版社，美國麻省波士頓市，(1992),第 6 章；以及 Appued MoleculaeGenetics of Filmentous Fungi (《絲狀真菌的應(yīng)用分子遺傳學(xué)》)，Kinghorn等人編輯，BlackieAcademic and Professional 出版社，英國倫敦 Chapman and Hall (1992)。選擇性標(biāo)記可以例如是編碼乙酰胺酶的amdS基因。轉(zhuǎn)化有amdS標(biāo)記的細(xì)胞可在作為氮源的乙酰胺上生長(zhǎng)。參見Kelley等人，(1985)，EMBO J (《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》)，第4卷第475-79頁；以及Penttila等人,(1987), Gene (《基因》),第61卷第155-64頁。包含編碼GSHE的多核苷酸的表達(dá)載體，可以是能夠在給定的真菌宿主生物中自主復(fù)制或者能夠整合到宿主的DNA中的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體是質(zhì)粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含這樣的DNA序列，其中啟動(dòng)子、GSHE編碼區(qū)和終止子都來源于待表達(dá)的基因?？扇笔У舨恍枰腄NA序列(例如，編碼不想要的結(jié)構(gòu)域)，使待表達(dá)的結(jié)構(gòu)域處于其自身轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列的控制下。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以是預(yù)裝配的，含有高水平轉(zhuǎn)錄所需的序列和選擇性標(biāo)記?？蓪SHE基因或其部分的編碼區(qū)插入到這個(gè)通用表達(dá)載體中，使得它處于這個(gè)表達(dá)構(gòu)建體的啟動(dòng)子和終止子序列的轉(zhuǎn)錄控制下。例如，將表達(dá)的序列插入到強(qiáng)cbhl啟動(dòng)子的下游。用于連接包含編碼GSHE的多核苷酸的載體、啟動(dòng)子、終止子和其他序列并將它們插入到合適的載體中的方法是本領(lǐng)域公知的。連接通?？赏ㄟ^在便利的限制位點(diǎn)處進(jìn)行連接來完成。如果不存在這種位點(diǎn)，則按照常規(guī)做法使用合成的寡核苷酸接頭。
Cloning (《分子克隆》),Sambrook等人編輯,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor) (1989);以及 More Gene Manipulations in Fungi (《在真菌中的更多基因操縱》)，Bennett等人編輯，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press),美國圣地亞哥,(1991),第 70-76 頁。有已知的方法可用來獲得具有一個(gè)或多個(gè)失活基因的真菌宿主細(xì)胞。參見第5，246，853號(hào)美國專利、第5，475，101號(hào)美國專利和WO 92/06209?；蚴Щ羁赏ㄟ^以下手段完成完全或部分缺失、插入失活、或者任何其他能使基因?qū)τ谄漕A(yù)定目的而言無功能的手段(即，使得該基因被防止表達(dá)功能蛋白)。任何已被克隆的、來自木霉屬的種或其他絲狀真菌宿主的基因都可進(jìn)行缺失。例子包括cbhl、cbh2、egll和egl2。在一些實(shí)施方案中，可通過用已知的方法將待失活的所需基因的某種形式插入到質(zhì)粒中來完成基因缺失。然后可在所需基因編碼區(qū)內(nèi)部的適當(dāng)限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)處切割該缺失質(zhì)粒，并用選擇性標(biāo)記替換該基因編碼序列或其部分。來自待缺失的基因的基因座的側(cè)翼DNA序列(優(yōu)選約O. 5至2. Okb之間)保留在該標(biāo)記基因的任一側(cè)上。適當(dāng)?shù)娜笔з|(zhì)粒通常將具有存在于其中的獨(dú)特限制性酶位點(diǎn)，以使得含有該缺失基因的片段(包括側(cè)翼DNA序列)和選擇性標(biāo)記基因能夠作為單一線性塊被去除。將DNA構(gòu)建體或載體引入到宿主細(xì)胞中的技術(shù)是公知的，包括轉(zhuǎn)化、電穿孔、核微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、DEAE-糊精介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、與磷酸鈣DNA沉淀物一起溫育、用包被DNA的微粒進(jìn)行高速轟擊以及原生質(zhì)體融合等等。一般的轉(zhuǎn)化技術(shù)在MMaiLAK Cloning(《分子克隆》)，Sambrook等人編輯,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor) (1989)等其他文獻(xiàn)中有教導(dǎo)。特別地，轉(zhuǎn)化絲狀真菌的方法在Campbell等人，(1989), Curr. Genet (《當(dāng)代遺傳學(xué)》)，第16卷第53-56頁中公開。第6，022，725號(hào)美國專利；第6，268，328號(hào)美國專利；Harkki 等人，(1991)，Enzyme Microb. Technol (《酶微生物技術(shù)》)，第 13 卷第 227-233頁；Harkki 等人，(1989)，BioTechnol (《生物技術(shù)》)，第 7 卷第 596-603 頁；EP 244 234 ；以及EP 215 594中公開了在木霉屬中表達(dá)異源蛋白。還請(qǐng)參照Nevalainen等人,“TheMolecular Biology of Trichod`erma and its Application to the Expression of BothHomologous and Heterologous Genes”(“木霉屬的分子生物學(xué)及其在表達(dá)同源和異源基因中的應(yīng)用”)，載于Industeial Mykmw (《分子工業(yè)真菌學(xué)》)，Leong等人編輯，馬塞爾 德克爾公司(Marcel Dekker，Inc.)，紐約，第129-148頁，1992。有關(guān)曲霉菌株的轉(zhuǎn)化，還請(qǐng)參照Cao等人，(2000), Protein Sc1.(《蛋白質(zhì)科學(xué)》),第9卷第991-1001頁?？捎幂d體系統(tǒng)構(gòu)建遺傳上穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化株，從而編碼GSHE的核酸可穩(wěn)定整合到宿主菌株染色體中。然后可通過已知的技術(shù)純化轉(zhuǎn)化株。在一個(gè)非限制性例子中，包含amdS標(biāo)記的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株通過其較快的生長(zhǎng)速率和通過其在含有乙酰胺的固體培養(yǎng)基上形成具有光滑而不是凹凸不平的輪廓的圓形菌落而與不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株區(qū)別開來。在一些情況中，可如下進(jìn)行穩(wěn)定性的進(jìn)一步測(cè)試在固體非選擇性培養(yǎng)基(例如缺乏乙酰胺)上生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化株，從這個(gè)培養(yǎng)基收獲孢子，并測(cè)定隨后將會(huì)萌發(fā)并在含有乙酰胺的選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的這些孢子的百分?jǐn)?shù)。也可用本領(lǐng)域已知的其他方法來選擇轉(zhuǎn)化株。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化用的木霉屬的種的制備涉及到從真菌菌絲體制備原生質(zhì)體。參見Campbell等人,(1989), Curr. Genet (《當(dāng)代遺傳學(xué)》),第16卷第53-56頁。菌絲體可從萌發(fā)的營(yíng)養(yǎng)孢子獲得。在這個(gè)情況中，可用能消化細(xì)胞壁的酶處理菌絲體，從而得到原生質(zhì)體。然后可通過在懸浮介質(zhì)中存在滲透穩(wěn)定劑來保護(hù)原生質(zhì)體。合適的穩(wěn)定劑包括山梨醇、甘露糖醇、氯化鉀、硫酸鎂等。通常，這些穩(wěn)定劑在懸浮介質(zhì)中的濃度在0.8M至1. 2M之間變動(dòng)，例如1. 2M山梨醇。DNA向宿主木霉屬的種的菌株中的攝取依賴于鈣離子濃度。通常，在攝取溶液中使用約IOmM CaCl2至50禮CaCl20攝取溶液中的其他組分可包括緩沖系統(tǒng)，如TE緩沖液(IOmM Tris,pH7. 4;lmM EDTA)或者 IOmMMOPS(嗎啉丙磺酸)(pΗ6· 0)和聚乙二醇(PEG)。據(jù)認(rèn)為，聚乙二醇的作用是融化細(xì)胞膜，從而允許該介質(zhì)的內(nèi)容物被遞送到木霉屬的種的菌株的細(xì)胞質(zhì)中，并且質(zhì)粒DNA得以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。這個(gè)融化在很多情況下使質(zhì)粒DNA的多個(gè)拷貝整合到宿主染色體中。通常，將含有密度為105至107/mL、已進(jìn)行過透化處理的木霉屬的種的原生質(zhì)體或細(xì)胞的懸浮液用于轉(zhuǎn)化。將在適當(dāng)溶液(例如1. 2M山梨醇；50mM CaCl2)中100 μ L體積的這些原生質(zhì)體或細(xì)胞與所需的DNA混合。通常，可將高濃度的PEG加到攝取溶液。可將O.1至I體積的25%PEG4000 (例如0. 25體積)加到原生質(zhì)體懸浮液。也可向攝取溶液加入添加劑例如二甲基亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀等幫助轉(zhuǎn)化。對(duì)于其他真菌宿主細(xì)胞有類似的程序可使用。參見例如，第6，022，725號(hào)美國專利和第6，268，328號(hào)美國專利。然后可將混合物在大約0°C下溫育10至30分鐘的時(shí)間?？上蚧旌衔锛尤肓硗獾腜EG以進(jìn)一步增強(qiáng)所需的基因或DNA序列的攝取。通常，可按轉(zhuǎn)化混合物體積的5至15倍體積加入25%PEG4000 ;但是，更大或更小的體積也是適合的。25%PEG4000可為轉(zhuǎn)化混合物體積的約10倍。在可加入PEG后，接著可將轉(zhuǎn)化混合物在室溫下或在冰上溫育，然后再加入山梨醇和CaCl2的溶液。然后可將原生質(zhì)體懸浮液進(jìn)一步加到生長(zhǎng)培養(yǎng)基的熔化等分試樣。這個(gè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基僅允許轉(zhuǎn)化株的生長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，可使用類似的程序和方法來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在宿主細(xì)胞中異源表達(dá)其他酶，如淀粉水解酶。2. 5.細(xì)朐培養(yǎng)通常將適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞在含有生理鹽和營(yíng)養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如以下文獻(xiàn)中所描述Pourquie 等人，Biochemistey And Genetics OfCellulose Degradation (《纖維素降解的生物化學(xué)和遺傳學(xué)》)，Aubert等人編輯,學(xué)術(shù)出版社(Academic Press),第71-86頁(1988)；以及Ilmen等人，(1997), Appl. Environ. Microbiol (《應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)》)，第63卷第1298-1306頁。常見的商業(yè)制備的培養(yǎng)基包括酵母麥芽浸膏(YM)肉湯、Luria Bertani (LB)肉湯和沙氏葡萄糖肉湯(SD)肉湯。培養(yǎng)條件也是標(biāo)準(zhǔn)的。例如，可將培養(yǎng)物在搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐中在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中在大約28°C下溫育，直到達(dá)到所需的GSHE表達(dá)水平。絲狀真菌的合適培養(yǎng)條件可在科學(xué)文獻(xiàn)中得到，或者從美國模式培養(yǎng)物保藏所和美國真菌遺傳資源中心(在互聯(lián)網(wǎng)上>>http://www. FGSC. net )得到。真菌生長(zhǎng)確立后，使細(xì)胞暴露于能有效造成或允許淀粉水解酶特別是本文所定義的GSHE的表達(dá)的條件。在GSHE編碼序列處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下的情況中，向培養(yǎng)基中以能有效誘導(dǎo)GSHE表達(dá)的濃度加入誘導(dǎo)劑，例如糖、金屬鹽或抗生素。26GSHE活件的鑒定GSHE測(cè)定法可評(píng)估已轉(zhuǎn)化了編碼淀粉水解酶的異源多核苷酸的細(xì)胞系對(duì)該淀粉水解酶的表達(dá)。GSHE測(cè)定法可在蛋白質(zhì)水平、RNA水平上進(jìn)行，或者通過使用特別針對(duì)葡糖淀粉酶的活性和/或產(chǎn)生的功能生物測(cè)定法進(jìn)行。一般來講，用來分析GSHE的表達(dá)的示例性測(cè)定法包括RNA印跡法、斑點(diǎn)印跡法(DNA或RNA分析)、RT-PCR (反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng))、原位雜交、使用適當(dāng)標(biāo)記的探針和DNA印跡法。GSHE的產(chǎn)生和/或表達(dá)可在樣品中直接測(cè)量，例如通過直接測(cè)量培養(yǎng)基中的還原糖(如葡萄糖)的測(cè)定法或者通過測(cè)量葡糖淀粉酶活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生的測(cè)定法來直接測(cè)量。適合于測(cè)定GSHE活性的底物包括顆粒淀粉底物。例如，可通過任何便利的方法來測(cè)定葡萄糖濃度，例如通過使用葡萄糖試劑盒Nol5-UV (西格瑪化學(xué)有限公司(Sigma ChemicalCo.))或者諸如Technicon自動(dòng)分析儀(加拿大薩斯嘻徹溫省(Saskatchewan, Canada))的儀器來測(cè)定。合適的葡萄糖氧化酶試劑盒和葡萄糖己糖試劑盒可從實(shí)驗(yàn)儀器公司(Instrumentation Laboratory)(美國麻省列克星敦市(Lexington, MA))商購。葡糖淀粉酶活性可通過3，5 二硝基水楊酸(DNS)方法進(jìn)行測(cè)定。參見Goto等人，(1994)，Biosc1.Biotechnol. Biochem(《生物科學(xué)生物技術(shù)生物化學(xué)雜志》),第58卷第49_54頁。在一個(gè)非限制性例子中，rGSHE水解15%淀粉固形物的水懸浮液中的顆粒淀粉成為至少90重量％、95重量％和97重量％ds葡萄糖的糖溶液。另外,可通過免疫學(xué)方法來評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá),如對(duì)細(xì)胞、組織切片的免疫組織化學(xué)染色，或者例如通過蛋白質(zhì)印跡法或ELISA對(duì)組織培養(yǎng)基的免疫測(cè)定。這種免疫測(cè)定法可用來定性和定量評(píng)估GSHE的表達(dá)。這種方法的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，并且許多用于實(shí)施這種方法的試劑是可商購獲得的。GSHE可由重組木霉屬宿主表達(dá)，表達(dá)量大于I克蛋白質(zhì)每升培養(yǎng)基(g/L)。重組木霉屬宿主表達(dá)的GSHE的量可大于 2g/L、5g/L、10g/L、20g/L、25g/L、30g/L 或 50g/L 培養(yǎng)基。2. 7. GSHE活件的鈍化和/或分離一般地講，細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的淀粉水解酶(例如nGSHE或rGSHE)被分泌到培養(yǎng)基中，可例如通過從細(xì)胞培養(yǎng)基中除去不想要的組分來進(jìn)行分離。在一些情況中，GSHE可能以細(xì)胞形式產(chǎn)生，這使得需要從細(xì)胞裂解物回收。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)應(yīng)用的技術(shù)，從產(chǎn)生該酶的細(xì)胞中純化該酶。例子包括但不限于親和層析(Tilbeurgh等人，(1984),FEBS Lett雜志，第16卷第215頁)；離子交換色譜方法(Goyal等人，(1991), Biores.Technol(《生物資源技術(shù)》),第 36 卷第 37 頁；Fliess 等人，(1983) ,Eur. J. Appl. MicrobiolBiotechnol (《歐洲應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志》)，第17卷第314頁；Bhikhabhai等人，(1984), J. Appl. Biochem (《應(yīng)用生物化學(xué)雜志》),第6卷第336頁；以及Ellouz等人,(1987), Chromatography (《色譜》),第396卷第307頁),包括用具有高拆分力的材料進(jìn)行的離子交換(Medve等人，(1998), J. Chromatography (《色譜雜志》),第A808卷第153頁；疏水相互作用色譜(Tomaz等人，(1999), J. Chromatography (《色譜雜志》)，第A865卷第123頁;兩相分配(Brumbauer等人,(1999), Bioseparation (《生物分離》),第7卷第287頁)；乙醇沉淀；反相HPLC ;在二氧化硅或陽離子交換樹脂上進(jìn)行的色譜，如DEAE ;色譜聚焦；SDS-PAGE ;硫酸銨沉淀；以及凝膠過濾，例如使用Sephadex G-75。3. LT工藝備件在LT工藝中，可將優(yōu)選為漿液形式的包含大米底物的組合物與至少一種GSHE接觸或溫育，以水解顆 粒淀粉。GSHE可以在無細(xì)胞提取物中供應(yīng)(例如，從培養(yǎng)基分離的GSHE),或者在含有表達(dá)和分泌GSHE的真菌細(xì)胞的培養(yǎng)基(例如發(fā)酵液)中供應(yīng)?？稍贚T工藝中使用超過一種GSHE。當(dāng)使用兩種或更多種GHSE時(shí)，它們可以是葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的組合，或者它們可以是多種不同的葡糖淀粉酶或多種不同的α-淀粉酶。當(dāng)α-淀粉酶添加有葡糖淀粉酶時(shí)，α-淀粉酶單位(AAU)與葡糖淀粉酶單位(GU)之比可在15:1至1:15的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，該比例可在10:1至1:10、5:1至1:5、4:1至1:4、約2:1至1:4或者約2:1至1:2的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，葡糖淀粉酶將與α-淀粉酶同時(shí)加到大米底物。在其他實(shí)施方案中，可依序加入葡糖淀粉酶和α-淀粉酶。在這個(gè)情況中，GSHE可相互間相隔約I至60分鐘內(nèi)或者約I至30分鐘內(nèi)加入。淀粉水解酶可與GSHE—起使用。該淀粉水解酶可以是GSHE。當(dāng)該淀粉水解酶是GSHE之外的酶時(shí)，它以本領(lǐng)域公知的催化淀粉水解的濃度和條件使用。除了 GSHE，淀粉水解酶包括但不限于普魯蘭酶、淀粉酶、纖維素酶、果膠酶和葡聚糖。葡糖淀粉酶向包含大米底物的組合物的加入量為約O. 001至15. O⑶/g漿液干固形物之間，該漿液可調(diào)整至10-55%干固形物。在其他實(shí)施方案中，葡糖淀粉酶的加入量可為約O. 01至10. O⑶/g干固形物之間、約O. 01至5. O⑶/g干固形物之間、約O. 01至2. OGU/g干固形物之間、約O. 01至1. 5⑶/g干固形物之間、約O. 05至1. 5⑶/g干固形物之間或約
0.1至1. O⑶/g干固形物之間。取決于α -淀粉酶的比活性，α -淀粉酶向包含大米底物的組合物的加入量通常可為約O. 001至5. Okga-淀粉酶/公噸(MT)大米底物。在一些實(shí)施方案中，a -淀粉酶的加入量可為約O. 01至5. Okg/MT、約O. 05至4. Okg/MT、約O.1至2. 5kg/MT或者約O. 5至
1.5kg/MT。例如，可向一公噸的淀粉加入約O. 01至1. 5kg的GZYME G997或SPEZYME FRED(杰能科公司(Genencor),其為丹尼斯克公司(Danisco Α/S)的分公司)。在其他實(shí)施方案中，GZYME G997 或 SPEZYME FRED 的加入量可為約 O. 05 至1. Okg/MT 之間、約 O.1 至 O. 6kg/MT之間、約O. 2至O. 6kg/MT之間或者約O. 4至O. 6kg/MT之間?？蓪竺椎孜锖?水解酶的混合物在等于或低于構(gòu)成大米底物的蛋白質(zhì)的變性溫度下進(jìn)行溫育。在一些實(shí)施方案中，該溫度可為低于約72°C、70°C、68°C、65°C、63°C、60 V、58°C、55 V、50°C >45 V或40°C，但不低于10°C。在其他實(shí)施方案中，該過程可在約70°C至50°C之間的溫度下進(jìn)行。在另外的實(shí)施方案中，該過程可在約70°C至55°C之間、還有約65°C至55°C之間的溫度下進(jìn)行。該混合物可在以下范圍內(nèi)的pH下進(jìn)行溫育約pH3.0至 ρΗ6· 5、約 ρΗ3· O 至 ρΗ6· O、約 ρΗ3· O 至 ρΗ5· 5、約 ρΗ3· 5 至 ρΗ5· O、約 ρΗ3· O 至 ρΗ4· O、約ΡΗ4. 5至6. 5或者約ρΗ5. O至6. O。該混合物當(dāng)在以上指明的溫度和pH下溫育時(shí)，可溫育例如約2至100小時(shí)、約10至100小時(shí)、約5至50小時(shí)或者約10至24小時(shí)的時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，大米底物的至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的干固形物被轉(zhuǎn)化為增溶的淀粉水解物。在一些實(shí)施方案中，大米底物的干固形物被完全增溶。該過程的葡萄糖收率，以占總增溶干固形物的百分比計(jì)，為至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、95· 5%,96%,96. 5%,97%,97. 5%,98%,98. 5%、99% 或 99. 5%。在24小時(shí)時(shí)間里，大米底物的至少80%、85%和90%的顆粒淀粉可被增溶和水解。在其他實(shí)施方案中，在24小時(shí)時(shí)間里,大米底物的至少95%的顆粒淀粉可被增溶和水解。在另外其他實(shí)施方案中，在24小時(shí)時(shí)間里，大米底物的至少98%的顆粒淀粉可被增溶和水解?？蓪赜臐{液的pH降低到約3. O至4. O的pH，以終止酶對(duì)大米底物的反應(yīng)。在溫育充分的時(shí)間后，可將包含增溶的大米淀粉水解物的級(jí)分與溫育的漿液分離開來，留下包含基本上不溶性的大米蛋白濃縮物的殘余物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知完成分離的方法。一般地講，這些分離方法中的一些包括離心、常規(guī)過濾方法和膜分離過程。3.1.大米蛋白濃縮物大米底物中的大部分淀粉的水解產(chǎn)生出增溶的淀粉級(jí)分和含有不溶性大米蛋白的殘余物級(jí)分?？蓪⒃鋈艿牡矸奂?jí)分與殘余物級(jí)分分離開來，該殘余物級(jí)分稱為大米蛋白濃縮物?？蓪⒋竺椎鞍诐饪s物例如懸浮在水中并通過過濾器而將其進(jìn)一步純化。大米蛋白濃縮物中的蛋白質(zhì)的重量百分比大于10%、20%、30%、40%或50%。在一些實(shí)施方案中，大米蛋白濃縮物的蛋白質(zhì)含量在約10%至60%、約10%至50%、約20%至45%或約30%至40%的范圍內(nèi)。可通過將以上獲得的大米蛋白濃縮物與GSHE和淀粉水解酶在以上指明的溫度和PH下進(jìn)一步溫育一段時(shí)間，以水解剩余的顆粒淀粉或不溶性淀粉，來獲得高純度大米蛋白濃縮物。如前所述，獲得兩個(gè)級(jí)分增溶淀粉和不溶性大米蛋白。可將級(jí)分進(jìn)行分離以獲得高純度大米蛋白濃縮物。可通過在約55°C至60°C的溫度下降低pH，例如從ρΗ5· 5降低到ρΗ3· 0-4. O范圍內(nèi)的pH，來終止殘余物中剩余的淀粉的酶水解。然后可如上所述將可溶性大米淀粉水解物與殘余物分離開來，以獲得高純度大米蛋白濃縮物。可使用第一水解反應(yīng)中的相同淀粉水解酶，或者可使用另一不同的GSHE和淀粉水解酶的組合。高純度大米蛋白濃縮物的蛋白質(zhì)含量(ΝΧ5. 95)通常大于60%、63%、65%、68%、70%和75%。在一些實(shí)施方案中，高純度大米蛋白濃縮物將具有約65%或更高、還有約70%或更高的蛋白質(zhì)含量?？墒褂贸Ｒ?guī)和公知的技術(shù)，例如真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥，將根據(jù)該過程獲得的大米蛋白濃縮物或高純度大米蛋白濃縮物進(jìn)行干燥。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明獲得的大米蛋白濃縮物的水分含量將低于約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%和2%。在一些實(shí)施方案中，所獲得的高純度蛋白質(zhì)濃縮物將被干燥至低于6%、5%、4%、3%、還有2%的水分含量。在一些實(shí)施方案中，水分含量將`在約2%至5%之間。3.2.大米蛋白濃縮物的性質(zhì)與大豆蛋白濃縮物相比，大米蛋白濃縮物或高純度大米蛋白濃縮物中的某些氨基酸的重量百分比相對(duì)較高。例如，在根據(jù)本發(fā)明獲得的大米蛋白濃縮物中，谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、天冬氨酸或丙氨酸的量可較高。此外，與通過采用常規(guī)高溫處理的淀粉加工方法所獲得的蛋白質(zhì)級(jí)分相比，根據(jù)本文所述的方法獲得的蛋白濃縮物和高純度蛋白濃縮物具有改進(jìn)的特性。例如，與從常規(guī)的HT工藝獲得的蛋白質(zhì)相比，該蛋白濃縮物和高純度蛋白濃縮物包含在堿性pH水平下特別是在10. O的pH水平下具有更高的溶解度的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的大米蛋白濃縮物在PHlO下的蛋白質(zhì)溶解度將為至少20%、至少40%或至少50%。在另外的實(shí)施方案中，與通過HT工藝生產(chǎn)的蛋白濃縮物相比，該蛋白濃縮物和高純度蛋白濃縮物包括在酸性pH水平下特別是在2. O的pH水平下具有更高的溶解度的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，在pH2. O下的溶解度將為至少15%、至少20%、至少25%或至少30%。3.3.大米蛋白濃縮物的食品產(chǎn)品大米蛋白濃縮物可用于食品產(chǎn)品中。在這個(gè)方面，大米蛋白濃縮物可與其他食品成分、風(fēng)味增強(qiáng)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑等一起使用。首先將大米蛋白濃縮物用水或其他合適的溶劑分散以形成濕面團(tuán)，然后與食品產(chǎn)品的其他成分混合。用于這個(gè)目的的“濕面團(tuán)”是這樣的面團(tuán)，其用水或另一合適的溶劑充分分散至適于進(jìn)行切塊和/或擠出及進(jìn)一步操作。從大米濃縮物形成的濕糊狀所含的水或另一合適溶劑的量可比從大豆蛋白制備濕面團(tuán)所需的量低45重量％。在這個(gè)上下文中的“約”意指基于與測(cè)量相關(guān)的正常誤差、相對(duì)濕度等，預(yù)期在45重量％上下有一定的變動(dòng)。因此，“約”通常涵蓋比大豆蛋白濕面團(tuán)少40-50重量％的水的面團(tuán)。所謂“小于”約45%，意指相對(duì)水分含量與大豆?jié)衩鎴F(tuán)相比可例如低40%、35%、30%，前提條件是大米蛋白濕面團(tuán)仍適于進(jìn)行切塊和/或擠出及進(jìn)一步操作。大米蛋白濃縮物也可以是食品添加劑。在一個(gè)這種實(shí)施方案中，大米蛋白濃縮物作為功能食品(例如營(yíng)養(yǎng)棒或糖果)的添加劑可提供額外的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。大米蛋白濃縮物還可用作補(bǔ)充物或補(bǔ)充物的成分。例如，可將大米蛋白濃縮物添加到食品產(chǎn)品以補(bǔ)充膳食蛋白攝入。大米蛋白濃縮物的用途的非限制性例子包括牛軋?zhí)切桶粜镜某煞?，或者焦糖芯或另一相似的高粘度棒芯中的成分。大米蛋白濃縮物還可添加到預(yù)定用于人以外的動(dòng)物的動(dòng)物飼料。大米蛋白濃縮物可作為成分添加到動(dòng)物飼料，且它可構(gòu)成動(dòng)物飼料中的大部分蛋白質(zhì)來源。以下實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明的主題。本文引述的所有參考文獻(xiàn)都以引用方式將其全部?jī)?nèi)容具體并入本文。提供以下實(shí)施例是為了說明而非限制受權(quán)利要求書保護(hù)的本發(fā)明。

實(shí)施例實(shí)施例1用WO 2005/082155 A2中描述的方法產(chǎn)生LT工藝的大米蛋白濃縮物。在本實(shí)施例中，將IOkg全米在40kg水中浸泡過夜，同時(shí)進(jìn)行輕微攪動(dòng)，然后進(jìn)行粉碎(大于95%通過30目篩)以產(chǎn)生漿液。將漿液的pH調(diào)節(jié)至pH5. 5。用兩種GSHE來催化淀粉的水解來自杰能科-丹尼斯克(Genencor-Danisco)的α -淀粉酶G Zyme+ G997 (2AAU/g淀粉干固形物)
和來自腐質(zhì)霉屬的顆粒淀粉水解葡糖淀粉酶(1. OGAU/g淀粉干固形物)(參見第7，303，899號(hào)美國專利，以引用方式并入本文)。將漿液在60°C下溫育24小時(shí)。用壓濾機(jī)分離增溶的淀粉級(jí)分和含有不溶性大米蛋白的殘余物級(jí)分，以獲得濾餅形式的不溶性大米蛋白。將濾餅懸浮在水中，充分?jǐn)嚢枰曰旌暇鶆?，然后再次通過壓濾機(jī)。將來自壓濾機(jī)的大米蛋白濾餅在60°C真空爐干燥機(jī)中干燥，用于進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。LT工藝的大米蛋白濃縮物的組成在表I中示出。表I
權(quán)利要求
1.一種食品產(chǎn)品，所述食品產(chǎn)品包含通過低溫工藝生產(chǎn)的大米蛋白濃縮物，所述工藝包括 (a)用(i)具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酶和(ii)第二淀粉水解酶在72°C或低于72°C的溫度下和在3. O至6. 5的pH下水解大米底物中的大部分淀粉一段時(shí)間，該時(shí)間足以獲得增溶的淀粉級(jí)分和含有不溶性大米蛋白的殘余物級(jí)分；和 (b)將所述增溶的淀粉級(jí)分與所述殘余物級(jí)分分離以獲得所述大米蛋白濃縮物， 其中所述食品產(chǎn)品中的所述大米蛋白濃縮物為濕面團(tuán)的形式，該濕面團(tuán)與從相似數(shù)量的大豆蛋白制備的濕面團(tuán)相比含有小于約45%的水分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品產(chǎn)品，其中所述食品產(chǎn)品是食品補(bǔ)充物或食品補(bǔ)充物的成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品產(chǎn)品，其中所述食品產(chǎn)品是功能食品或功能食品的成分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品產(chǎn)品，其中所述食品產(chǎn)品是動(dòng)物飼料添加劑或動(dòng)物飼料添加劑的成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品產(chǎn)品，其中所述食品產(chǎn)品是食品添加劑。
6.一種制備包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的大米蛋白濃縮物的食品產(chǎn)品的方法，所述方法包括 (a)用(i)具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酶和(ii)第二淀粉水解酶在72°C或低于72°C的溫度下和在3. O至6. 5的pH下水解大米底物中的大部分淀粉一段時(shí)間，該時(shí)間足以獲得增溶的淀粉級(jí)分和含有不溶性大米蛋白的殘余物級(jí)分；和 (b)將所述增溶的淀粉級(jí)分與所述殘余物級(jí)分分離以獲得所述大米蛋白濃縮物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述具有GSH活性的酶是葡糖淀粉酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶衍自腐質(zhì)霉屬、根霉屬或曲霉屬的菌株。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二淀粉水解酶是α-淀粉酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述α-淀粉酶衍自細(xì)菌來源。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述具有GSH活性的酶通過在木霉屬菌株或曲霉屬菌株中的異源表達(dá)獲得。
12.根據(jù)權(quán)利要求6-11中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括純化所述大米蛋白濃縮物。
13.根據(jù)權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括干燥所述大米蛋白濃縮物。
14.根據(jù)權(quán)利要求6-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述大米蛋白濃縮物具有至少20%的蛋白質(zhì)含量。
15.根據(jù)權(quán)利要求6-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述大米底物被調(diào)成漿液并含有10至55%之間的干固體含量。
16.根據(jù)權(quán)利要求6-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溫度在70°C至55°C之間。
17.根據(jù)權(quán)利要求6-16中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括 (a)將在(b)部分中獲得的大米蛋白濃縮物用具有GSH活性的酶和淀粉水解酶在3.0至6. 5的pH下和在70°C至55°C的溫度下進(jìn)行酶促水解，以獲得包括增溶的淀粉和不溶性大米蛋白的級(jí)分；和 (b)將所述級(jí)分進(jìn)行分離以獲得高純度大米蛋白濃縮物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其還包括 (a)將(d)部分中獲得的高純度大米蛋白濃縮物進(jìn)行干燥。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法，其中(C)部分的所述淀粉水解酶是α-淀粉酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述高純度大米蛋白濃縮物具有至少60%的蛋白質(zhì)含量。
全文摘要
在低溫下制備的大米蛋白濃縮物表現(xiàn)出改進(jìn)的功能性和有利的生理好處，包括降低的膽固醇和提高的乳酸脫氫酶活性，而血尿素氮沒有提高。該大米蛋白濃縮物較之大豆蛋白濃縮物可用比較少的水制備成濕面團(tuán)。大米蛋白濃縮物的使用因而改進(jìn)了含有該濃縮物的食品制品的配制中的加工步驟。該食品產(chǎn)品有利地顯示出延長(zhǎng)的貨架期和改進(jìn)的可口質(zhì)構(gòu)。
文檔編號(hào)A23J3/34GK103068264SQ201180040723
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者G·段, K·B·雅各布森, J·K·舍蒂, Q·應(yīng), T·威爾遜 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國公司