一種大麥籽粒中冰結(jié)構(gòu)蛋白的快速特異性純化方法
【專利說(shuō)明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:本發(fā)明涉及食品工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大麥籽粒中冰結(jié)構(gòu)蛋白的快速特異性純化方法。
【背景技術(shù)】
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[0002]經(jīng)冷誘導(dǎo)后，植物體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列生理、生化和分子生物學(xué)的變化，包括低溫誘導(dǎo)蛋白、糖類、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成和分泌，膜結(jié)構(gòu)與組成改變和一些新酶的出現(xiàn)等。冰結(jié)構(gòu)蛋白(ISPs)為植物低溫誘導(dǎo)蛋白中的一種，具有熱滯活性、調(diào)節(jié)原生質(zhì)體過(guò)冷狀態(tài)、修飾冰晶形態(tài)及抑制重結(jié)晶的特性。與魚(yú)類、昆蟲(chóng)ISPs不同，植物ISPs的抗凍特性是低熱滯活性和高重結(jié)晶抑制活性，使其更適于應(yīng)用到冷凍食品中，以減少貯藏和運(yùn)輸過(guò)程中因溫度波動(dòng)而引起的冷凍食品品質(zhì)劣變。
[0003]目前ISPs的純化大部分采用常規(guī)的系列柱層析技術(shù)進(jìn)行，只有少量利用“冰手指”(Ice finger)法特異性純化ISPs的報(bào)道。常規(guī)的系列柱層析方法適用范圍廣，但存在工藝繁瑣，回收率低且處理周期長(zhǎng)、處理量小的缺點(diǎn)。而且在純化過(guò)程中通常選擇活性相對(duì)高的組分進(jìn)行下一步純化處理，因此存在漏檢的可能。ISPs的吸附-抑制理論認(rèn)為ISPs是通過(guò)自身吸附到冰晶表面從而抑制冰晶的生長(zhǎng)的?！氨种浮狈ㄌ禺愋约兓且訧SPs的吸附-抑制理論為基礎(chǔ)從粗提物中純化與冰結(jié)合的ISPs的?！氨种浮狈軌虮苊獬Ｒ?guī)柱層析法漏檢的缺陷，能夠同時(shí)獲得多種ISPs，但對(duì)設(shè)備和操作條件的要求較高。而且在純化過(guò)程中一方面要對(duì)“冰手指”進(jìn)行降溫，另一方面又要對(duì)粗提液體系進(jìn)行升溫處理以彌補(bǔ)“冰手指”傳熱引起的體系溫度的降低，存在能源浪費(fèi)問(wèn)題。另外，由于“冰手指”上有效冰吸附表面有限，操作所需時(shí)間較長(zhǎng)。
[0004]溶液凍結(jié)包括降溫和結(jié)晶兩個(gè)過(guò)程。降溫過(guò)程中溫度低于凝固點(diǎn)但仍未凝固或結(jié)晶的液體稱為過(guò)冷液體。過(guò)冷液體是處于亞穩(wěn)態(tài)的，只要有微小擾動(dòng)形成凝結(jié)核就能誘發(fā)結(jié)晶，瞬間形成大量小冰晶。根據(jù)植物ISPs低熱滯活性和高重結(jié)晶抑制活性的特點(diǎn)，本發(fā)明利用ISPs通過(guò)自身吸附到冰晶表面從而抑制冰晶的生長(zhǎng)的特性，建立了一種利用溶液自身產(chǎn)生的冰晶進(jìn)行ISPs親和純化的新型快速特異性純化方法，利用該方法能夠特異性的從大麥籽粒ISP粗提液中純化ISPs，具有特異性強(qiáng)，對(duì)設(shè)備和操作條件要求低，能源節(jié)約且處理量大，耗時(shí)短的特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種大麥籽粒冰結(jié)構(gòu)蛋白的快速特異性純化方法。本發(fā)明，以通過(guò)真空滲透離心法從大麥籽粒中分離獲得的ISPs粗提物為純化對(duì)象，通過(guò)控制溶液降溫速率和溶液溫度，使溶液自身產(chǎn)生大量冰晶并與ISPs發(fā)生親和吸附，然后經(jīng)過(guò)固液分離即可得到組成相對(duì)簡(jiǎn)單且活性較高的ISPs，從而為進(jìn)一步拓寬ISPs在各領(lǐng)域的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。
[0006]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是:
[0007](I)溶液除雜及蛋白濃度調(diào)節(jié):采用0.22 μπι的微孔濾膜，除去ISPs粗提液中的顆粒性雜質(zhì)，并調(diào)節(jié)蛋白濃度為0.1?1.0mg/mL ；
[0008](2)凍結(jié)曲線測(cè)定:利用熱電偶，測(cè)定溶液的凍結(jié)曲線，確定冰點(diǎn)溫度與過(guò)冷溫度，降溫速率為0.5?3°C /min ；
[0009](3)程序降溫:采用低溫制冷循環(huán)系統(tǒng)對(duì)溶液進(jìn)行程序降溫，降溫速率為0.5?30C /min,降溫終點(diǎn)溫度為-10?0°C ；
[0010](4)晶核引入及冰晶形成:可以以微晶玻璃作為晶核直投方式加入晶核，也可通過(guò)震蕩、點(diǎn)觸方式誘發(fā)產(chǎn)生晶核，使冰晶大量形成；
[0011](5)親和吸附:將⑷中形成的冰水懸浮液在-10?0°C下以10-100r/min的轉(zhuǎn)速攬拌I?5min ；
[0012](6)固液分離:低溫下，使用預(yù)冷的砂芯漏斗將(5)中得到的懸浮液進(jìn)行固液分離，真空抽濾除去冰渣中夾帶的蛋白溶液，將獲得的冰渣置50mM的磷酸鹽緩沖液中，使其融化；
[0013](7)冷凍干燥:將(6)中獲得的溶液冷凍干燥即得到冰親和純化后的大麥籽粒冰結(jié)構(gòu)蛋白。
[0014]本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn):
[0015]1、本發(fā)明以蛋白溶液自身產(chǎn)生的冰晶進(jìn)行ISPs的冰親和吸附，大大提高了降低了對(duì)設(shè)備的要求，能夠降低冰結(jié)構(gòu)蛋白的成本。
[0016]2、本發(fā)明利用溶液在過(guò)冷階段引入晶核能產(chǎn)生大量小冰晶的原理進(jìn)行ISPs的冰親和吸附，大大提高了能夠親和ISPs的冰晶的數(shù)量和表面積，縮短親和所需時(shí)間，提高純化效率。
[0017]3、本發(fā)明不要任何特殊昂貴的儀器設(shè)備，且實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單易實(shí)現(xiàn)，完全符合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的要求。
【附圖說(shuō)明】
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[0018]圖1所示為本發(fā)明實(shí)施例1中大麥籽粒ISPs的快速特異性純化方法流程圖；
[0019]圖2所示為本發(fā)明實(shí)施例1中大麥籽粒ISPs的凍結(jié)曲線圖；
[0020]圖3所示為本發(fā)明實(shí)施例1中大麥籽粒ISPs快速特異性純化前后熱滯活性對(duì)比圖；
[0021]圖4所示為本發(fā)明實(shí)施例1中大麥籽粒ISPs快速特異性純化前后分子量分布對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
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[0022]實(shí)施例1
[0023](I)溶液除雜及蛋白濃度調(diào)節(jié):采用0.22 μπι的微孔濾膜，除去粗提液中的顆粒性雜質(zhì)，并調(diào)節(jié)蛋白濃度為0.5mg/mL ；
[0024](2)凍結(jié)曲線測(cè)定:利用熱電偶，測(cè)定蛋白溶液的凍結(jié)曲線，降溫速率約1°C/min ；
[0025](3)程序降溫:采用低溫制冷循環(huán)系統(tǒng)對(duì)蛋白溶液進(jìn)行程序降溫，降溫速率為10C /min,降溫終點(diǎn)溫度為-7V ;
[0026](4)晶核引入:通過(guò)點(diǎn)觸方式誘發(fā)產(chǎn)生晶核，使冰晶大量形成；
[0027](5)親和吸附:將(4)中形成的冰水懸浮液在-7 °C下以50r/min的轉(zhuǎn)速攪拌3min ；
[0028](6)分離:_7°C下，使用預(yù)冷的砂芯漏斗將(5)中得到的懸浮液進(jìn)行固液分離，真空抽濾除去冰渣中夾帶的蛋白溶液，將獲得的冰渣置50mM的磷酸鹽緩沖液中，使其融化；
[0029](7)冷凍干燥:將￠)中獲得的溶液冷凍干燥即得到冰親和純化后的大麥籽粒冰結(jié)構(gòu)蛋白。
[0030]用差示掃描量熱法測(cè)定冰親和純化后大麥籽粒ISPs提取物的熱滯活性，并與原始大麥籽粒提取物的熱滯活性進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3。從圖中可以看出，經(jīng)冰親和純化后ISPs溶液活性得到了較大的提高。
[0031]采用Superdex_G75凝膠柱對(duì)冰親和純化前后蛋白溶液進(jìn)行洗脫，結(jié)果如圖4。從圖中可以看出，經(jīng)冰親和純化后ISPs溶液的分子量分布發(fā)生了改變，證明部分非ISPs被除去。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種大麥籽粒中冰結(jié)構(gòu)蛋白的快速特異性純化方法，其特征包括以下步驟: (1)粗提液除雜及蛋白濃度調(diào)節(jié):采用0.22 μπι的微孔濾膜，除去粗提液中的顆粒性雜質(zhì)，并調(diào)節(jié)蛋白濃度為0.1?1.0mg/mL ； (2)凍結(jié)曲線測(cè)定:利用熱電偶，測(cè)定并記錄(I)中溶液的凍結(jié)曲線，確定冰點(diǎn)溫度與過(guò)冷溫度，降溫速率為0.5?3°C /min ； (3)程序降溫:采用低溫制冷循環(huán)系統(tǒng)對(duì)(I)中溶液進(jìn)行程序降溫，降溫速率為0.5-30C /min,降溫終點(diǎn)溫度為-10?0°C ； (4)晶核引入:以微晶玻璃作為晶核，采用直投方式加入溶液，也可通過(guò)震蕩、點(diǎn)觸方式誘發(fā)產(chǎn)生晶核，使冰晶大量形成； (5)親和吸附:將(4)中形成的冰水懸浮液在恒溫下以10?100r/min的轉(zhuǎn)速攪拌I?5min ； (6)分離:低溫下，使用預(yù)冷的砂芯漏斗將(5)中得到的懸浮液進(jìn)行固液分離，真空抽濾除去冰渣中夾帶的溶液，將獲得的冰渣置于50mM的磷酸鹽緩沖液中，使其融化； (7)冷凍干燥:將￠)中獲得的溶液冷凍干燥即得到冰親和純化后的大麥籽粒冰結(jié)構(gòu)蛋白O
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種大麥籽粒中冰結(jié)構(gòu)蛋白的快速特異性純化方法。其特征包括以下步驟：(1)溶液除雜及蛋白濃度調(diào)節(jié)，(2)凍結(jié)曲線測(cè)定，(3)程序降溫，(4)晶核的引入，(5)親和吸附，(6)分離，(7)冷凍干燥。本發(fā)明利用大麥籽粒冰結(jié)構(gòu)蛋白能夠特異性親和到冰晶上的特點(diǎn)，在溶液過(guò)冷階段引入晶核使溶液產(chǎn)生大量小冰晶，達(dá)到特異性純化冰結(jié)構(gòu)蛋白的目的，具有用時(shí)短，效率高的特點(diǎn)，建立了一種新的特異性純化大麥籽粒中冰結(jié)構(gòu)蛋白的方法。
【IPC分類】C07K1-36, C07K1-22, C07K14-415, C07K1-34
【公開(kāi)號(hào)】CN104650199
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510014453
【發(fā)明人】張暉, 丁向麗, 齊希光, 王立, 錢(qián)海峰
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年1月12日