專利名稱：藻類細胞的制備方法以及化學物質的毒性評價用試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藻類細胞的制備方法以及化學物質的毒性評價用試劑盒。
背景技術：
在使用藻類的評價化學物質的毒性的情況下，必須以用液體培養(yǎng)或用瓊脂培養(yǎng)基等進行維持的細胞為基礎實施原代培養(yǎng)(primary culture)以及繼代培養(yǎng)(subculture)并制備藻類細胞，并將被檢物質添加到制備好的藻類細胞中來進行試驗。但是，維持藻類細胞或者每個試驗中進行繼代培養(yǎng)都很麻煩而不便。為了消除這種麻煩，可以利用冷凍了的藻類細胞(非專利文獻I以及2等)。通過就在試驗之前解凍已冷凍了的藻類細胞并利用解凍了的藻類細胞，從而可以不對藻類細胞實施繼代培養(yǎng)而能夠迅速地提供給試·驗?，F(xiàn)有技術文獻專利文獻專利文獻1:國際公開第2005/062027號非專利文獻非專利文獻1:桑野和可，2002年《藻類的冷凍保存》；堀輝三 大野正夫 堀口健雄編“21世紀初的藻學的現(xiàn)狀”；日本藻類學會，山形，108 111頁非專利文獻2:森史等，“國立環(huán)境研究所微生物系統(tǒng)保存設施之藍藻和綠藻的冷凍保存”，Microbiol.Cult.Coll.，2002 年 6 月，45-55 頁非專利文獻3 J.G.Day等，“藻類的超低溫保存”，分子生物學方法，38卷，冷凍保存與冷凍干燥實驗指南，81-89頁

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的技術問題作為冷凍的藻類細胞，通常使用穩(wěn)定期的細胞。這是因為能夠減少解凍而制備成具有生存能力的細胞的時間，而且脂質等細胞內(nèi)物質作為細胞保護劑進行工作(非專利文獻3)。在使用藻類的評價化學物質的毒性的方法中，作為較經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)測試指南TG201所規(guī)定的抑制生長試驗更迅速并且更簡便的方法，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了利用藻類的延遲發(fā)光的方法(專利文獻I)。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn):如果冷凍穩(wěn)定期的藻類細胞并解凍來進行培養(yǎng)的話，則與冷凍前的細胞相比較生長會變得不良。細胞的生長會影響到利用延遲發(fā)光的毒性評價，所以如果使用穩(wěn)定期的藻類細胞作為冷凍的藻類細胞的話，則會產(chǎn)生不能夠進行與使用冷凍前的藻類細胞的情況相同等的毒性評價的問題。因此，有必要制備解凍后的生長良好的藻類的冷凍細胞。解決技術問題的手段本發(fā)明人為了解決上述技術問題反復作了悉心研究，發(fā)現(xiàn):通過使用對數(shù)生長期(logarithmic growth phase)的細胞作為冷凍的藻類細胞,解凍后的藻類細胞能夠順利地進行繁殖，以至于完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明提供一種用于利用延遲發(fā)光進行的化學物質的毒性評價的藻類細胞的制備方法，其中包括使對數(shù)生長期的藻類細胞冷凍的工序。如果使對數(shù)生長期的藻類細胞冷凍，則解凍后的藻類細胞的生長將變得良好，并且能夠獲得與冷凍前同等強度的延遲發(fā)光的發(fā)光量。優(yōu)選相對于冷凍的藻類細胞的總數(shù)，50%以上的藻類細胞具有4.以上的粒徑。另外，優(yōu)選冷凍的藻類細胞的粒徑分布曲線顯示雙峰分布。通過使用像這樣的藻類細胞，解凍后的藻類細胞的生長將變得更為良好，對于延遲發(fā)光來說也將變得容易獲得與冷凍前同等的強度的發(fā)光量。另外，優(yōu)選在使用以株號NIES-35被保存于日本國立環(huán)境研究所的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata)作為冷凍的藻類細胞的情況下，相對于所冷凍的藻類細胞總數(shù)，55%以上的藻類細胞具有顯示雙峰分布的粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑。另外，優(yōu)選在使用以株號NIES-35被保存于日本國立環(huán)境研究所的綠藻的情況下，相對于粒徑小的峰處的細胞數(shù)與粒徑大的峰處的細胞數(shù)之和，顯示雙峰分布的粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細胞數(shù)為50%以上。在使用以株號NIES-35被保存的綠藻的情況下，通過使用如以上所述的粒徑分布的藻類細胞，解凍后的藻類細胞的生長將變得更為良好。另外，優(yōu)選在使用以ATCC編號22662被保存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)中的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata)作為冷凍的藻類細胞的情況下，相對于冷凍的藻類細胞的總數(shù)，46%以上的藻類細胞具有顯示雙峰分布的粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑。另外，優(yōu)選在使用以ATCC編號22662被保存于美國典 型培養(yǎng)物保藏中心的綠藻的情況下，相對于粒徑小的峰處的細胞數(shù)與粒徑大的峰處的細胞數(shù)之和，顯示雙峰分布的粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細胞數(shù)為37%以上。在使用以ATCC編號22662被保存的綠藻的情況下，通過使用如以上所述的粒徑分布的藻類細胞，解凍后的藻類細胞的生長將變得更為良好。另外，本發(fā)明的方法優(yōu)選在使對數(shù)生長期的藻類細胞冷凍的工序之前，進一步包括:在培養(yǎng)液中培養(yǎng)對數(shù)生長期的藻類細胞的工序，離心分離含有該藻類細胞的培養(yǎng)液的工序，以及從藻類細胞中完全除去由離心分離分離出的培養(yǎng)上清液的工序。通過從藻類細胞中完全除去培養(yǎng)上清液，從而減少冷凍、解凍對延遲發(fā)光圖形的影響，并且容易獲得與冷凍前的細胞同等的延遲發(fā)光圖形。再有，本發(fā)明的方法優(yōu)選包括在-80°C以下的溫度下維持被冷凍的所述對數(shù)生長期的藻類細胞的工序。通過在_80°C以下的溫度下進行維持，從而就能夠防止冷凍中的細胞發(fā)生損傷，并且冷凍后的藻類細胞的生長將變得更為良好。另外，本發(fā)明是提供一種包含被冷凍的對數(shù)生長期的細胞的利用延遲發(fā)光的化學物質毒性評價用的試劑盒。通過使用這樣的試劑盒，從而就能夠簡易而且迅速地進行利用延遲發(fā)光的化學物質的毒性評價。優(yōu)選相對于所述被冷凍的藻類細胞的總數(shù)，50%以上的藻類細胞具有4.5 y m以上的粒徑，另外，優(yōu)選藻類細胞的粒徑分布曲線顯示雙峰分布。
另外，優(yōu)選包含于上述毒性評價試劑盒中的被冷凍的藻類細胞是以株號NIES-35被保存于日本國立環(huán)境研究所的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata),相對于被冷凍的藻類細胞總數(shù)，55%以上的藻類細胞具有顯示雙峰分布的粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑，優(yōu)選相對于粒徑小的峰處的細胞數(shù)與粒徑大的峰處的細胞數(shù)之和，顯示雙峰分布的粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細胞數(shù)為50%以上。另外，優(yōu)選包含于上述毒性評價試劑盒中的被冷凍的藻類細胞是以ATCC編號22662被保存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata),相對于被冷凍的藻類細胞的總數(shù)，46%以上的藻類細胞具有顯示雙峰分布的粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑，優(yōu)選相對于粒徑小的峰處的細胞數(shù)與粒徑大的峰處的細胞數(shù)之和，顯示雙峰分布的粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細胞數(shù)為37%以上。另外，包含于上述毒性評價試劑盒中的被冷凍的藻類細胞優(yōu)選由包括以下工序的方法進行制備:在培養(yǎng)液中培養(yǎng)對數(shù)生長期的藻類細胞的工序，離心分離含有該藻類細胞的培養(yǎng)液的工序，從藻類細胞中完全除去由離心分離分離出的培養(yǎng)上清液的工序，以及冷凍余下的藻類細胞的工序。另外，包含于上述毒性評價試劑盒中的藻類細胞優(yōu)選在-80°C以下的溫度下被維持。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明的藻類細胞的制備方法，因為冷凍以及解凍之后的藻類細胞的繁殖良好，所以在進行利用延遲發(fā)光的化學物質的毒性評價的時候，能夠與冷凍前的藻類細胞同樣地進行使用。再有，根據(jù)本發(fā)明的利用延遲發(fā)光的化學物質的毒性評價用試劑盒，能夠簡易而且迅速地進行化學物質的毒性評價。


圖1是表示對數(shù)生長期的綠藻細胞(實施例1)的冷凍以及解凍后的生長曲線的圖。圖2是表示穩(wěn)定期的綠藻細胞(比較例I)的冷凍以及解凍后的生長曲線的圖。圖3是表示對數(shù)生長期的冷凍和解凍了的綠藻細胞(實施例1)以及沒有冷凍的綠藻細胞的延遲發(fā)光的發(fā)光圖形的圖。圖4是表示對數(shù)生長期的冷凍和解凍了的綠藻細胞(實施例2)以及沒有冷凍的綠藻細胞的延遲發(fā)光的發(fā)光圖形的圖。圖5是表示NIES-35株的細胞(A)的粒徑分布曲線的圖。圖6是表示NIES-35株的細胞(B)的粒徑分布曲線的圖。圖7是表示NIES-35株的細胞(C)的粒徑分布曲線的圖。圖8是表示NIES-35株的細胞(D)的粒徑分布曲線的圖。圖9是表示培養(yǎng)了 NIES-35株的細胞(A) (D)的活細胞之后的各個的顆粒數(shù)的圖。圖10是表示培養(yǎng)了 NIES-35株的細胞(A) (D)的活細胞之后的各個的延遲發(fā)光的發(fā)光量的圖。圖11是表示ATCC-22662株的細胞(H)的粒徑分布曲線的圖。
圖12是表示ATCC-22662株的細胞(I)的粒徑分布曲線的圖。圖13是表示ATCC-22662株的細胞(J)的粒徑分布曲線的圖。圖14是表示ATCC-22662株的細胞(K)的粒徑分布曲線的圖。圖15是表示ATCC-22662株的細胞(L)的粒徑分布曲線的圖。圖16是表示ATCC-22662株的細胞(M)的粒徑分布曲線的圖。圖17是表示培養(yǎng)了 ATCC-22662株的細胞(H) (M)的活細胞之后的各個的顆粒數(shù)的圖。圖18是表示培養(yǎng)了 ATCC-22662株的細胞(H) (M)的活細胞之后的各個的延遲發(fā)光的發(fā)光量的圖。圖19是表示冷凍和解凍的綠藻(比較例2)以及沒有冷凍的綠藻的顆粒數(shù)的圖。圖20是表示冷凍和解凍的綠藻(比較例2)以及沒有冷凍的綠藻的菌落存活率的圖。圖21是表示冷凍和解凍的綠藻(比較例2)以及沒有冷凍的綠藻的延遲發(fā)光的發(fā)光圖形的圖。圖22是表示冷凍和解凍 的綠藻(比較例2)以及沒有冷凍的綠藻的發(fā)光量(累計值)的圖。圖23是表示冷凍和解凍的綠藻(實施例5)以及沒有冷凍的綠藻的延遲發(fā)光的發(fā)光圖形的圖。圖24是表示冷凍和解凍的綠藻(實施例5)以及沒有冷凍的綠藻的發(fā)光量(累計值)的圖。圖25是說明使用了比較例2所涉及的藻類的評價化學物質的毒性的方法的流程圖。圖26是說明使用了實施例5所涉及的藻類的評價化學物質的毒性的方法的流程圖。
具體實施例方式以下適當參照附圖并就 用于實施本發(fā)明的方式進行詳細的說明。在本發(fā)明的制備方法中包括使對數(shù)生長期的藻類細胞冷凍。更為具體地來說，將藻類細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，并回收培養(yǎng)的藻類細胞，冷凍保存所回收的藻類細胞。被冷凍保存的藻類細胞被解凍并被用于利用延遲發(fā)光的化學物質的毒性評價中。在本說明書中，所謂“對數(shù)生長期”，是指藻類細胞每一定時間分裂而增殖并且細胞數(shù)相對于時間成對數(shù)增殖的時期。另外，所謂“穩(wěn)定期”，是指分裂率和死亡率基本達到平衡并且細胞數(shù)基本成為一定的時期。作為能夠使用于本發(fā)明的藻類細胞，例如可以使用綠藻(PseudokirchnerielIasubcapitata (原名 Selenastrum capricornutum)、Desmodesmus subspicatus (原名 Scenedesmus subspicatus))、 藍藻(Anabaena flos-aquae、 SynechococcusIeopoliensis)、娃藻(Navicula pelliculosa)等藻類的細胞。作為一個例子，綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata)可以使用以株號NIES-35被保存于日本國立環(huán)境研究所(National Institute for Environmental Studies)的綠藻(以下根據(jù)情況會稱其為“NIES-35株”)、或者、以ATCC編號22662被保存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Culture Collection)的綠藻(以下根據(jù)情況會稱其為“ATCC-22662株”)。被保存于這些機構的株在個體之間性質的差異小且穩(wěn)定，所以優(yōu)選。對于將藻類細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期來說，可以使用標準的方法。例如，在使用綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata)作為藻類細胞的情況下，可以通過在溫度為25±0.5°C以及照明度為50 55iimol -m^2 -s^1的條件下使用C (75)培養(yǎng)基以及OECD培養(yǎng)基等培養(yǎng)液，將穩(wěn)定期的細胞制備成初始細胞密度I X IO4細胞/毫升并培養(yǎng)70 73小時，從而獲得對數(shù)生長期的細胞。可以通過使用顆粒測量裝置(CDA-500)在一定期間內(nèi)對所獲得的細胞實施3次以上細胞數(shù)測量，并將細胞數(shù)相對于培養(yǎng)時間進行對數(shù)表示來制作生長曲線，通過該生長曲線基本成為直線可以確認是對數(shù)生長期的細胞?？梢砸约毎牧阶鳛橹笜藖砼袛嗨囵B(yǎng)的對數(shù)生長期的藻類細胞之中作為用于本發(fā)明的方法的細胞群而優(yōu)選的細胞群。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選使細胞的粒徑大的細胞冷凍。具體是，在將所冷凍的藻類細胞的數(shù)量作為100%的時候，即相對于所冷凍的藻類細胞的總數(shù)，具有4.5 以上大小的粒徑的藻類細胞的數(shù)量優(yōu)選為50%以上，進一步優(yōu)選為53%以上，更加優(yōu)選為57%以上。還有，在本說明書中，所謂藻類細胞的“粒徑”，是指由電感應區(qū)方式的粒度分布測定裝置計算出的藻類細胞的直徑。另外，所冷凍的藻類細胞的粒徑分布曲線優(yōu)選顯示雙峰分布。所謂雙峰分布是指呈現(xiàn)2個大峰的雙相性分布。像這樣的對于冷凍來說優(yōu)選的細胞可以根據(jù)由細胞數(shù)測量而獲得的數(shù)據(jù)來確認。對于如以上所述使用雙峰的粒徑分布的藻類細胞來說，被認為具有以下所述那樣的意義。進行冷凍的時候的細胞的狀態(tài)會較大地影響到解凍后的細胞生長。為了使從冷凍保存狀態(tài)解凍了的細胞迅速地進行對數(shù)生長，優(yōu)選所冷凍的細胞群為被分成兩個細胞群、即細胞分裂前的大細胞群和剛剛細胞分裂后的小細胞群的狀態(tài)。即，被分成兩個群體是表示細胞分裂正處于活躍的狀態(tài)。再有，可以將谷值的粒徑作為指標來判斷在顯示雙峰的粒徑分布的藻類細胞中更優(yōu)選的細胞群。還有，在本說明 書中所謂“谷值的粒徑”，是指雙峰分布的粒徑分布曲線上的2個峰之間的細胞數(shù)變成極小的粒徑。谷值的粒徑優(yōu)選不過分大。所謂谷值大，則表示粒徑尺寸小的細胞群的比例大，即，表示細胞群的細胞生長發(fā)生降低的狀態(tài)。作為其原因，例如可以列舉:生物質生產(chǎn)所必需的營養(yǎng)鹽、光能以及二氧化碳等伴隨著細胞的增加而不足、消耗等。在細胞生長發(fā)生降低的狀態(tài)下進行冷凍也會有細胞在解凍后難以立即進行對數(shù)生長的傾向。因此，優(yōu)選谷值的粒徑不要過大。具體是谷值的粒徑優(yōu)選為大約4 5pm。使用NIES-35株作為藻類細胞的情況也優(yōu)選粒徑分布曲線顯示雙峰分布。再有，在將所冷凍的藻類細胞的數(shù)量作為100%的時候，即相對于所冷凍的藻類細胞的總數(shù)，具有雙峰的粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑的細胞數(shù)量優(yōu)選為55%以上，更加優(yōu)選76%以上。另外，在使用NIES-35株作為藻類細胞的情況下，在將粒徑小的峰處的細胞數(shù)與粒徑大的峰處的細胞數(shù)之總和作為100%的時候，即相對于該總和，雙峰的粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細胞數(shù)優(yōu)選為50%以上，更加優(yōu)選為72%以上。還有，在本說明書中，所謂“峰處的細胞數(shù)”,是指在將峰的粒徑作為Pum的時候的具有P±0.02 ii m大小的粒徑的細胞的數(shù)量。另外，在使用NIES-35株的情況下，谷值優(yōu)選為小于4.52 u m，進一步優(yōu)選為
4.40 u m以下,更加優(yōu)選為4.12 ii m以下。
使用ATCC-22662株作為藻類細胞的情況下，也是優(yōu)選粒徑分布曲線顯示雙峰分布。再有，在將所冷凍的藻類細胞的數(shù)量作為100%的時候，即相對于所冷凍的藻類細胞的總數(shù)，具有雙峰的粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑的細胞數(shù)量優(yōu)選為46%以上，更加優(yōu)選為48%以上。另外，在使用ATCC-22662株作為藻類細胞的情況下，在將粒徑小的峰處的細胞數(shù)與粒徑大的峰處的細胞數(shù)之總和作為100%的時候，即相對于該總和，雙峰的粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細胞數(shù)優(yōu)選為37%以上，更加優(yōu)選為41%以上。另外，在使用ATCC-22662株的情況下，谷值優(yōu)選為小于4.87 u m,更加優(yōu)選為4.78 y m以下。還有，使用NIES-35株作為藻類細胞的情況和使用ATCC-22662株作為藻類細胞的情況都可以用上述說明以外的各種各樣的方法來判斷是否是對于用于本發(fā)明的方法來說優(yōu)選的細胞群。例如，在粒徑分布曲線顯示雙峰分布的情況下，可以將大于谷值粒徑的細胞作為“大細胞”并將小于谷值的細胞作為“小細胞”，從而分成兩個群體，用“大細胞”和“小細胞”來比較將規(guī)定粒徑與在該規(guī)定粒徑下的細胞數(shù)累積而得到的值(粒徑X細胞數(shù))的每一個群體的積分值(以下稱之為“·特征值”)，判斷是否為優(yōu)選的細胞群。還有，所謂“在規(guī)定粒徑下的細胞數(shù)”，是指在將規(guī)定粒徑作為Qum的時候的具有Q±0.02 ii m大小的粒徑的細胞的數(shù)量。在將“大細胞”與“小細胞”的特征值的總和作為100%的時候，即相對于該總和，“大細胞”的特征值在NIES-35株的情況下優(yōu)選為64%以上，在ATCC-22662株的情況下優(yōu)選為53%以上。另外，同樣，可以在粒徑分布曲線顯示雙峰分布的情況下，將大于谷值粒徑的細胞作為“大細胞”并將小于谷值的細胞作為“小細胞”，從而分成兩個群體，用“大細胞”和“小細胞”來比較峰處的粒徑與在該峰處的細胞數(shù)的累積值(峰粒徑X細胞數(shù)，以下稱之為“特征量代表值”)，判斷是否為優(yōu)選的細胞群。在將“大細胞”與“小細胞”的特征量代表值比的總和作為100%的時候，即相對于該總和，“大細胞”的特征量代表值比在NIES-35株的情況下優(yōu)選為61%以上，在ATCC-22662株的情況下優(yōu)選為43%以上。另外，根據(jù)所使用的藻類細胞的表面積或者藻類細胞的體積也可以判斷對于本發(fā)明的方法來說是否為優(yōu)選的細胞群。例如，在藻類細胞的表面積為已知的情況下，根據(jù)
權利要求
1.一種藻類細胞的制備方法，其特征在于: 用于利用延遲發(fā)光來評價化學物質的毒性， 包括使對數(shù)生長期的藻類細胞冷凍的工序。
2.按權利要求1所述的方法，其特征在于: 相對于所述冷凍的藻類細胞的總數(shù)，50%以上的藻類細胞具有4.5 y m以上的粒徑。
3.按權利要求1或者2所述的方法，其特征在于: 所述冷凍的藻類細 胞的粒徑分布曲線顯示雙峰分布。
4.按權利要求3所述的方法，其特征在于: 所述所冷凍的藻類細胞是以株號NIES-35被保存于日本國立環(huán)境研究所的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相對于所述冷凍的藻類細胞的總數(shù)，55%以上的藻類細胞具有所述粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑。
5.按權利要求3或者4所述的方法，其特征在于: 所述冷凍的藻類細胞是以株號NIES-35被保存于日本國立環(huán)境研究所的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相對于粒徑小的峰處的細胞數(shù)與粒徑大的峰處的細胞數(shù)之和，所述粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細胞數(shù)為50%以上。
6.按權利要求3所述的方法，其特征在于: 所述冷凍的藻類細胞是以ATCC編號22662被保存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相對于所述冷凍的藻類細胞總數(shù)，46%以上的藻類細胞具有所述粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑。
7.按權利要求3或者6所述的方法，其特征在于: 所述冷凍的藻類細胞是以ATCC編號22662被保存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相對于粒徑小的峰處的細胞數(shù)與粒徑大的峰處的細胞數(shù)之和，所述粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細胞數(shù)為37%以上。
8.按權利要求1 7中的任意一項所述的方法，其特征在于: 在使所述對數(shù)生長期的藻類細胞冷凍的工序之前，進一步包括: 在培養(yǎng)液中培養(yǎng)所述對數(shù)生長期的藻類細胞的工序， 離心分離含有所述藻類細胞的所述培養(yǎng)液的工序，以及 從所述藻類細胞中完全除去由所述離心分離所分離出的培養(yǎng)上清液的工序。
9.按權利要求1 8中的任意一項所述的方法，其特征在于: 進一步包括在_80°C以下的溫度下維持被冷凍的所述對數(shù)生長期的藻類細胞的工序。
10.一種試劑盒，其特征在于: 是用于利用延遲發(fā)光來評價化學物質的毒性的試劑盒，其中包含被冷凍的對數(shù)生長期的藻類細胞。
11.按權利要求10所述的試劑盒，其特征在于: 相對于所述被冷凍的藻類細胞的總數(shù)，50%以上的藻類細胞具有4.5 i! m以上的粒徑。
12.按權利要求10或者11所述的試劑盒，其特征在于: 所述被冷凍的藻類細胞的粒徑分布曲線顯示雙峰分布。
13.按權利要求12所述的試劑盒，其特征在于: 所述被冷凍的藻類細胞是以株號NIES-35被保存于日本國立環(huán)境研究所的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata)， 相對于所述被冷凍的藻類細胞的總數(shù)，55%以上的藻類細胞具有所述粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑。
14.按權利要求12或者13所述的試劑盒，其特征在于: 所述被冷凍的藻類細胞是以株號NIES-35被保存于日本國立環(huán)境研究所的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相對于粒徑小的峰處的細胞數(shù)與粒徑大的峰處的細胞數(shù)之和，所述粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細胞數(shù)為50%以上。
15.按權利要求12所述的試劑盒，其特征在于: 所述被冷凍的藻類細胞是以ATCC編號22662被保存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相對于所述被冷凍的藻類細胞的總數(shù)，46%以上的藻類細胞具有所述粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑。
16.按權利要求12或者15所述的試劑盒，其特征在于: 所述被冷凍的藻類細胞是以ATCC編號22662被保存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相對于粒徑小的峰處的細胞數(shù)與粒徑大的峰處的細胞數(shù)之和，所述粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細胞數(shù)為37%以上。
17.按權利要求10 16中的任意一項所述的試劑盒,其特征在于: 所述被冷凍的藻類細胞由包括以下所述工序的方法進行制備: 在培養(yǎng)液中培養(yǎng)對數(shù)生長期的藻類細胞的工序， 離心分離含有所述藻類細胞的所述培養(yǎng)液的工序， 從所述藻類細胞中完全除去由所述離心分離所分離出的培養(yǎng)上清液的工序，以及 冷凍余下的所述藻類細胞的工序。
18.按權利要求10 17中的任意一項所述的試劑盒,其特征在于: 所述藻類細胞被維持在_80°C以下的溫度下。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種藻類細胞的制備方法，用于利用延遲發(fā)光來評價化學物質的毒性，其中包括使對數(shù)生長期的藻類細胞冷凍的工序。
文檔編號C12R1/89GK103097544SQ201180043478
公開日2013年5月8日 申請日期2011年7月14日 優(yōu)先權日2010年9月8日
發(fā)明者數(shù)村公子, 竹內(nèi)彩乃, 勝又政和 申請人:浜松光子學株式會社