專利名稱：新的細(xì)胞內(nèi)溶素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有細(xì)胞內(nèi)溶素活性的多肽，其具有依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列，以及所述多肽的片段或衍生物。此外，本發(fā)明涉及編碼所述多肽或其片段或衍生物的核酸分子，包含所述核酸分子的載體，以及包含所述核酸分子或所述載體的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明涉及所述多肽、或其片段或衍生物用作藥物，尤其是用于治療或預(yù)防革蘭氏陰性細(xì)菌感染、作為診斷手段、作為化妝物質(zhì)或作為消毒劑。本發(fā)明還涉及所述多肽或其片段或衍生物用來(lái)處理或防止食品、食品加工設(shè)備、食品加工工廠，與食品接觸的表面、醫(yī)療設(shè)備、醫(yī)院和診所的表面的細(xì)菌污染，尤其是革蘭氏陰性污染。此外，本發(fā)明涉及包含所述多肽或其片段或衍生物的藥物組合物。
背景技術(shù)：
革蘭氏陰性細(xì)菌具有外膜，其特點(diǎn)為特征性的不對(duì)稱雙分子層。外膜的雙分子層由含有磷脂(主要為磷脂酰乙醇胺)的內(nèi)側(cè)單分子層和主要由單一糖脂一脂多糖(LPS)構(gòu)成的外側(cè)單分子層組成。在細(xì)菌界，LPS結(jié)構(gòu)具有廣闊的多樣性，且LPS結(jié)構(gòu)可響應(yīng)主導(dǎo)的環(huán)境條件而受到修飾。LPS層的穩(wěn)定性以及不同LPS分子之間的相互作用主要通過(guò)二價(jià)離子(Mg2+、Ca2+)與LPS分子的陰離子組分(脂質(zhì)A中的磷酸基團(tuán)和KDO的內(nèi)核和羧基基團(tuán))的靜電相互作用達(dá)成。此外，由于缺乏不飽和脂肪酸所致，脂質(zhì)A疏水部分的密集而有序的包裝形成具有高粘性的剛性結(jié)構(gòu)。這使其較不易被親脂性分子滲透，并賦予外膜(OM)額外的穩(wěn)定性。已知多種類型的具有殺菌或抑菌活性的試劑，例如抗生素、細(xì)胞內(nèi)溶素、抗微生物肽和防衛(wèi)素。然而，微生物對(duì)抗生素的增加的抗性對(duì)于治療越來(lái)越多由細(xì)菌導(dǎo)致的感染造成困難。革蘭氏陰性細(xì)菌如腸桿菌科，諸如沙門氏菌屬(Salmonella sp.)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)導(dǎo)致的感染產(chǎn) 生了特別的困難。細(xì)胞內(nèi)溶素為細(xì)菌噬菌體(或細(xì)菌的病毒)編碼的肽聚糖水解酶。其在噬菌體復(fù)制的裂解周期中的晚期基因表達(dá)過(guò)程中合成，并通過(guò)降解細(xì)菌肽聚糖來(lái)介導(dǎo)后代病毒體從受感染的細(xì)胞的釋放。其為β (1，4)_糖基化酶(溶菌酶)、糖基轉(zhuǎn)移酶、酰胺酶或內(nèi)肽酶。細(xì)胞內(nèi)溶素的抗微生物應(yīng)用已經(jīng)在1991年由Gasson(GB2243611)提出。盡管細(xì)胞內(nèi)溶素的殺滅能力久為人知，由于抗生素的成功和主宰地位，這些酶作為抗細(xì)菌劑的用途一直受忽略。僅在多重抗生素耐藥性細(xì)菌出現(xiàn)后，用細(xì)胞內(nèi)溶素對(duì)抗人類病原體這一簡(jiǎn)單概念方才受到注意。出現(xiàn)了開(kāi)發(fā)完全新類型的抗細(xì)菌劑的令人矚目的需求，且用作酶抗生素(enzybioticsM “酶”和“抗生素”的糅合術(shù)語(yǔ))的細(xì)胞內(nèi)溶素完美地符合該需求。在2001年，F(xiàn)ischetti及其同事首次闡明了細(xì)菌噬菌體Cl細(xì)胞內(nèi)溶素對(duì)A組鏈球菌的治療潛力(Nelson等，2001)。從此，許多文獻(xiàn)確立了細(xì)胞內(nèi)溶素作為控制細(xì)菌感染，特別是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)菌感染的有吸引力和補(bǔ)充的替代手段。接著，針對(duì)其他革蘭氏陽(yáng)性病原體如肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae) (Loeffler 等，2001)、炭疽芽抱桿菌(Bacillusanthracis) (Schuch等，2002)、無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae) (Cheng等，2005)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (Rashel等，2007)的不同的細(xì)胞內(nèi)溶素證明了其作為酶抗生素的效力。目前，細(xì)胞內(nèi)溶素療法面臨的最嚴(yán)重的挑戰(zhàn)在于革蘭氏陰性細(xì)菌對(duì)細(xì)胞內(nèi)溶素的外源作用不敏感，這是由于外膜屏蔽了細(xì)胞內(nèi)溶素接觸肽聚糖。這一點(diǎn)目前阻礙了有效的內(nèi)溶素范圍擴(kuò)展到重要的革蘭氏陰性病原體?？刮⑸镫?AMP)代表一大類短的、陽(yáng)離子性或兩親性(amphipatic)、由基因編碼的肽抗生素，其可見(jiàn)于幾乎所有生物。不同的AMP顯示不同的特性，且該類型中的許多肽不僅作為抗生素，還作為細(xì)胞穿透肽的模板正經(jīng)受徹底的研究。盡管分享一些共同特征(例如，陽(yáng)離子性，兩親性和小尺寸)，AMP序列變化極大，且已提出至少四種結(jié)構(gòu)組U -螺旋，β-片層，延伸型(extended)和環(huán)狀(looped))引起觀察到的AMP構(gòu)象的多樣性。同樣，已提出了幾種其作為抗生素的作用模式，且顯示例如許多這些肽的主要靶是細(xì)胞膜，而對(duì)于其他肽，主要靶是細(xì)胞質(zhì)侵襲和核心代謝功能的擾亂。盡管缺乏特異性靶結(jié)合，AMP可變得足夠集中(concentrated)以顯示協(xié)作活性(cooperative activity),例如，通過(guò)在膜上形成孔，如對(duì)于大部分AMP的情況下。然而，該現(xiàn)象僅在模式磷脂雙分子層中觀察到，且在一些情況下，需要在膜中AMP的濃度高至每六個(gè)磷脂分子一個(gè)肽分子來(lái)使這些事件發(fā)生。所述濃度接近甚至可達(dá)到全膜飽和。因?yàn)閷?duì)于AMP最低抑制濃度(MIC)通常在低微摩爾范圍，可理解地，對(duì)于這些閾值的相關(guān)性及其在體內(nèi)的重要性產(chǎn)生了懷疑(Me1等，Naturereviews, Microbiology, 2009, 245)。防衛(wèi)素是由小的、陽(yáng)離子性、富含半胱氨酸和精氨酸的抗微生物肽構(gòu)成的一個(gè)大家族，見(jiàn)于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物兩者。防衛(wèi)素根據(jù)半胱氨酸的間隔樣式(spacingpattern)分為五個(gè)組:植物、無(wú)脊椎動(dòng)物、α _、β -和Θ -防衛(wèi)素。后三種主要見(jiàn)于哺乳動(dòng)物。α-防衛(wèi)素為見(jiàn)于嗜中性粒細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)。β_防衛(wèi)素為最廣泛分布的，并由白細(xì)胞和許多類型的上皮細(xì)胞所分泌。Θ-防衛(wèi)素目前很少見(jiàn)，例如見(jiàn)于獼猴(rhesusmacaques)的白血病。防衛(wèi)素對(duì)細(xì)菌、真菌和許多有包膜和無(wú)包膜病毒有活性。然而，多數(shù)情況下有效殺滅細(xì)菌所需的濃度較高，即在微摩爾范圍。許多肽的活性在生理鹽條件、二價(jià)陽(yáng)離子和血清的存在下受限。 取決于疏水氨基酸殘基的含量，防衛(wèi)素亦顯示溶血活性。因此，存在對(duì)針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的新型抗微生物劑的需要。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及新的具有細(xì)胞內(nèi)溶素活性的多肽，其從腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritis)噬菌體PVPSEl分離而來(lái)，可用于制備針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的新型抗細(xì)菌劑。本發(fā)明的第一個(gè)目的提供涂有具有細(xì)胞內(nèi)溶素活性的多肽，其包含依照SEQ IDNO:1的氨基酸序列，或其片段或衍生物。包含依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽優(yōu)選由依照SEQ ID NO: 2的核苷酸序列編碼。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中所述片段包含依照SEQ ID N0:3和/或5的氨基酸序列，優(yōu)選分別由核苷酸序列SEQ ID N0:4和/或SEQ ID N0:6編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中所述衍生物在依照SEQ ID NO: 1、3和/或5的氨基酸序列中具有缺失、添加、插入和/或取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述依照本發(fā)明的多肽或其片段或衍生物在N-或C-段融合于具有破壞膜或LPS活性的肽段，尤其是陽(yáng)離子性或多聚陽(yáng)離子性肽。
所述肽、片段或其衍生物或融合蛋白可以進(jìn)一步包含標(biāo)簽，優(yōu)選His6_標(biāo)簽。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽包含依照SEQ ID N0:7的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及這樣的融合蛋白，其包含依照前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的多肽以及在N端或C端融合于所述多肽的肽段，其中所述肽段是陽(yáng)離子性肽、多聚陽(yáng)離子性肽、兩親肽、壽司肽(sushi peptide)、防衛(wèi)素、疏水性肽和/或抗微生物肽。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽段包含約5至約100個(gè)氨基酸殘基，尤其是約5個(gè)至50個(gè)氨基酸殘基，尤其是約5個(gè)至30個(gè)氨基酸殘基。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述陽(yáng)離子性和/或多聚陽(yáng)離子性肽段包含選自下組的至少一個(gè)氨基酸殘基:精氨酸、組氨酸和賴氨酸殘基，尤其是其中所述肽段中包含的至少70%的氨基酸殘基是精氨酸、組氨酸和/或賴氨酸殘基，尤其是精氨酸和/或賴氨酸殘基。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述兩親肽包含至少一個(gè)選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的荷正電的氨基酸殘基，與至少一個(gè)選自纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甘氨酸殘基的疏水性氨基酸殘基組合，其中所述兩親肽中的至少70%的所述氨基酸殘基是精氨酸或賴氨酸殘基，而所述兩親肽中 的大約30%的所述氨基酸殘基為纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸或甘氨酸殘基。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽段包含依照SEQ ID NO: 14-19的氨
基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含依照SEQ IDN0:13的
氨基酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及包含依照SEQ ID NO: 13的核酸分子的載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的提供編碼依照本發(fā)明的多肽、其片段或衍生物、或融合蛋白的分尚的核酸分子。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及包含依照本發(fā)明的核酸分子的載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及包含依照本發(fā)明的核酸分子或依照本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及依照本發(fā)明的多肽、片段或衍生物或依照本發(fā)明的融合蛋白作為人醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)醫(yī)學(xué)或診斷物質(zhì)，作為食物中或化妝品上的抗微生物劑，作為消毒劑或在環(huán)境領(lǐng)域中使用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述依照本發(fā)明的多肽、片段或衍生物或融合蛋白在制備用于治療或預(yù)防革蘭氏陰性細(xì)菌感染的藥物中使用。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及所述所述依照本發(fā)明的多肽、片段或衍生物或融合蛋白用于處理或防止食品、食品加工設(shè)備、食品加工工廠、與食品接觸的表面、醫(yī)療設(shè)備、醫(yī)院及診所中的表面的革蘭氏陰性細(xì)菌污染的用途。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及包含本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的融合蛋白的藥物組合物。
詳細(xì)說(shuō)明


下列附圖用于例示本發(fā)明。附圖1顯示了使用BLASTp和Pfam分析系統(tǒng)對(duì)野生型模塊性腸炎沙門氏菌細(xì)胞內(nèi)溶素PVPSElgpl46的功能性分析。氨基酸和DNA和氨基酸序列，如它們?cè)谝吧褪删w中出現(xiàn)的，分別為SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2。預(yù)測(cè)的N端肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PBD，氨基酸3-39，SEQ ID NO: 3，加下劃線的)和C端溶菌酶樣超家族催化結(jié)構(gòu)域(氨基酸81-234，SEQID N0:5,加灰色聞売的)在不意圖和序列中均可視化。圖2 - PVPSE Igp 146 (左)和 PK-PVPSElgp 147 (右)的重組表達(dá)和純化的 SDS-PAGE分析。SDS-PAGE分析顯示洗脫蛋白級(jí)分，相對(duì)于LMW參照標(biāo)志物，以及穿透級(jí)分(FT)和廢液級(jí)分(W)。26.4kDa (之于 PVPSEIgp146)和 27.7kDa (之于 PK-PVPSEIgp146)左右的粗條帶顯示了這兩種重組蛋白的高產(chǎn)率?？梢?jiàn)一些次要的次級(jí)條帶(蛋白降解)以及分別位于52.8kDa和55.4kDa左右的蛋白二聚化。圖3-腸炎沙門氏菌噬菌體細(xì)胞內(nèi)溶素PVPSElgpl46在洗脫緩沖液中對(duì)經(jīng)外膜通透化的銅綠假單胞菌PAOl的溶胞壁活性的飽和曲線。顯示了遞增濃度的PVPSElgpl46(以nM計(jì)，X軸)的活性(以AOD655nmAiin計(jì)，Y軸)。此外，對(duì)線性曲線部分的最佳線性回歸表示為趨勢(shì)線，以及相應(yīng)的最優(yōu)R平方值。結(jié)果是一式三份測(cè)定的。PAOltoyltjv底物溶于最優(yōu)的ΚΗ2Ρ04/ΚΗ2Ρ04緩沖液中。圖4顯示的是修飾的標(biāo)簽-PVP_SElgpl46變體的可能的二維模塊化結(jié)構(gòu)。展示了PVP-SElgpl46的推定的N端肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PBD)和C端溶菌酶樣超家族催化性殼聚糖酶結(jié)構(gòu)域，以及N端融合的抗細(xì)菌肽標(biāo)簽(A PT)的方向。圖5 顯示 PVPSElgpH6 (藍(lán)色條)和 PK-PVP_SElgpl46 (紅色條)在 42°C ⑷和500C (B)下溫育后在24h中不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)對(duì)外膜通透化后的PAOl細(xì)胞底物的熱穩(wěn)定性。將溶胞壁活性與時(shí)間點(diǎn)O的未加熱樣品相對(duì)比較，并以百分比表示。顯示了三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖6 顯示了 PVP-SElgpl46(A)和 PK_PVP_SElgpl46 (B)在 50_100°C溫育 O (藍(lán)色)、20 (紅色)、40 (綠色)和60 (紫色)分鐘時(shí)間(對(duì)于PVP-SEIgp146);和O (藍(lán)色)、20 (紅色)、30 (綠色)、和40 (紫色)分鐘時(shí)間(對(duì)于PK-PVP-SEIgp146)之后對(duì)經(jīng)過(guò)膜通透化的PAOl細(xì)胞底物的熱穩(wěn)定性。將溶胞壁活性與時(shí)間點(diǎn)O的未加熱樣品相對(duì)比較，并以百分比表不。顯不了二個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。說(shuō)明定義下列術(shù)語(yǔ)若在本文中出現(xiàn)，則應(yīng)具有下面的定義。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”與術(shù)語(yǔ)“多肽”所指相同。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”指氨基酸殘基通過(guò)肽鍵以特定序列連接的直鏈聚合物。蛋白的氨基酸殘基可通過(guò)例如共價(jià)附著多種基團(tuán)如糖和磷酸來(lái)修飾。其他的物質(zhì)如血紅素或脂質(zhì)可更松散的與多肽鏈相聯(lián)系，得到偶合的蛋白質(zhì)，其也包含于本文中使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”中。有多種方式闡明多肽鏈的折疊，特別是針對(duì)α螺旋和β折疊片層的存在。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”指所有四種類型的蛋白質(zhì)，即全^、全^^/^和^加上運(yùn)。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”指由兩個(gè)核酸序列融合所得的表達(dá)產(chǎn)物。上述蛋白可在例如重組DNA表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生。而且，如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”指第一氨基酸序列如例如細(xì)胞內(nèi)溶素，與第二或別的氨基酸序列的融合物。所述第二或別的氨基酸序列優(yōu)選是肽段，特別是陽(yáng)離子性肽或多聚陽(yáng)離子性肽。優(yōu)選地，所述第二和/或別的氨基酸序列對(duì)于第一氨基酸序列為外源的，并不與第一氨基酸序列的任何域?qū)嵸|(zhì)上同源。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“肽段”指連接于蛋白質(zhì)如細(xì)胞內(nèi)溶素的任何類型的肽。然而，本發(fā)明的意義中的妝段不指His6_標(biāo)簽，Strep-標(biāo)簽，Av1-標(biāo)簽，Myc-標(biāo)簽，Gst-標(biāo)簽，JS-標(biāo)簽，半胱氨酸(cystein)-標(biāo)簽，F(xiàn)LAG-標(biāo)簽或本領(lǐng)域中已知的其他標(biāo)簽，硫氧還蛋白或麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)。與如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“肽段”相對(duì)，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)簽”指可用于幫助多肽的表達(dá)和/或親和純化，將多肽固定于表面或者充當(dāng)標(biāo)志物或標(biāo)記部分以供檢測(cè)多肽(例如通過(guò)在不同的ELISA測(cè)定形式中的抗體結(jié)合)的肽，只要使該標(biāo)簽可用于上述所列舉之一的功能并非由所述肽所荷的正電荷所致即可。然而，His6標(biāo)簽可能取決于相應(yīng)的PH，亦可荷正電，但卻是因?yàn)槠浣Y(jié)合于固定化的二價(jià)陽(yáng)離子而用作親合純化工具而并非用作根據(jù)本發(fā)明的肽段。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“肽”指由約2至約100個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選約4至約50個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選約5至30個(gè)氨基酸殘基組成的短多肽，其中一個(gè)氨基酸殘基的氨基基團(tuán)通過(guò)肽鍵連接于另一個(gè)氨基酸殘基的羧基基團(tuán)。肽可具有特定功能。肽可為天然出現(xiàn)的肽或合成設(shè)計(jì)和產(chǎn)生的肽。所述肽可例如通過(guò)酶法或化學(xué)剪切來(lái)源于天然蛋白或從天然蛋白移出，或者可使用常規(guī)的肽合成技術(shù)(例如固相合成)或分子生物學(xué)技術(shù)(參見(jiàn) Sambrook, J.等,M olecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPress, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))來(lái)制備。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞內(nèi)溶素”指適于水解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶?！凹?xì)胞內(nèi)溶素”包含至少一個(gè)具有至少下述活性之一的“酶活性域(EAD) ”:內(nèi)肽酶、N-乙?；?胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(酰胺酶)、N-乙酰基胞壁酰胺酶(N-acetyl-muramidase)、N-乙?；?氨基葡萄糖苷酶(溶菌酶)或轉(zhuǎn)糖基酶。此外，所述細(xì)胞內(nèi)溶素還可含有不具酶活性并結(jié)合于宿主細(xì)菌細(xì)胞壁的區(qū)，即所謂CBD(細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。所述細(xì)胞內(nèi)溶素可含有兩個(gè)或更多個(gè)CBD。然而，如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞內(nèi)溶素”還指具有至少一個(gè)EAD但沒(méi)有CBD的酶。一般而言，細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合細(xì)菌表面上不同的組分。優(yōu)選地，所述細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)殡木厶墙Y(jié)合結(jié)構(gòu)域并結(jié)合于細(xì)菌的肽聚糖結(jié)構(gòu)。細(xì)胞內(nèi)溶素的不同結(jié)構(gòu)域可通過(guò)結(jié)構(gòu)域接頭連接。如本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域接頭”是指起著將單個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域彼此相連的作用的氨基酸序列。作為規(guī)則，結(jié)構(gòu)域接頭不形成或僅形成很少的規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)，如α螺旋或β_片層，并且能夠占據(jù)就結(jié)構(gòu)背景而言的不同構(gòu)象。檢測(cè)結(jié)構(gòu)域接頭的方法以及接頭序列的特征是本領(lǐng)域公知的，例如描述于Bae等，2005, Bioinformatics, 21, 2264-2270或George&Heringa, 2003, Protein Engineering, 15, 871-879 中。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“野生型”或“wt”是指如SEQ ID N0:1所示的細(xì)胞內(nèi)溶素PVPSEIgp146的氨基酸序列。編碼該野生型細(xì)胞內(nèi)溶素PVPSElgpl46的核酸序列描述于SEQID N0:2。
如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“缺失”指從對(duì)應(yīng)的起始序列去除1、2、3、4、5或更多個(gè)氨基
酸或核酸殘基。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“插入”或“添加”指向?qū)?yīng)的起始序列插入或添加1、2、3、4、
5或更多個(gè)氨基酸或核酸殘基。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“取代”指用不同的氨基酸殘基替換位于特定位置的氨基酸殘基。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞壁”指所有構(gòu)成革蘭氏陰性細(xì)菌外細(xì)胞圍繞物(enclosure)并由此確保其完整性的組分。具體而言，如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞壁”指肽聚糖、革蘭氏陰性細(xì)菌具有脂多糖的外膜、細(xì)菌細(xì)胞膜，但也指沉積于肽聚糖上的其他層例如莢膜(capsule)、外蛋白層或粘液(slime)。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“EAD”指細(xì)胞內(nèi)溶素的酶活性結(jié)構(gòu)域。EAD負(fù)責(zé)水解細(xì)菌肽聚糖。其呈現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)溶素的至少一種酶活性。EAD還可由超過(guò)一種酶活性模塊構(gòu)成。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“EAD”與術(shù)語(yǔ)“催化結(jié)構(gòu)域”同義。本發(fā)明涉及一種新的模塊性(modular)細(xì)胞內(nèi)溶素，其分離自腸炎沙門氏菌噬菌體PVPSE1，可用于制備針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的新型抗細(xì)菌劑。尤其是，本發(fā)明涉及包含依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽或其片段或衍生物。所述包含依照SEQ ID NO:1的多肽優(yōu)選由依照SEQ ID NO:2的核苷酸序列編碼。具有依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列的細(xì)胞內(nèi)溶素PVPSElgpl46的長(zhǎng)度為236個(gè)氨基酸。其包含一個(gè)N端細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBC)和一個(gè)C端酶活性結(jié)構(gòu)域(EAD)。該N端CBD是一個(gè)肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PGB，aa3 39)，具有依照SEQ ID NO: 3的氨基酸序列以及依照SEQ ID NO:4的核苷酸序列。C端EAD是一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域(aa81 234)，與溶菌酶樣超家族的催化結(jié)構(gòu)域一致，且具有依照SEQ ID NO:5的氨基酸序列及依照SEQ ID NO:6的核苷酸序列。細(xì)胞內(nèi)溶素PVPSElgpl46的PGB和催化結(jié)構(gòu)域通過(guò)結(jié)構(gòu)域接頭連接。因此，依照本發(fā)明的肽的優(yōu)選片段是包含依照SEQ ID N0:3和/或依照SEQ IDNO:5的氨基酸序列的多肽。依照本發(fā)明的衍生物是包含依照SEQ ID NO: 1、3和/或5的氨基酸序列但具有另外的修飾和/或改變的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)溶素的衍生物的所述修飾和/或改變可以是突變，尤其是缺失、插入、添加、取代或其任何組合，和/或氨基酸殘基的化學(xué)改變，例如生物素化、乙?；?、PEG化、氨基、SH或羧基基團(tuán)的化學(xué)變化。依照本發(fā)明的所述衍生物呈現(xiàn)PVPSElgpl46(SEQ ID NO:1)的溶解活性和/或依照本發(fā)明的所述片段活性。所述活性可為PVPSElgpl46活性和/或依照本發(fā)明的片段活性的約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或約200%。所述活性可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本領(lǐng)域公知的測(cè)定法來(lái)測(cè)量，例如平板裂解(plate lysis)測(cè)定法或液體裂解(liquidlysis)測(cè)定法，其例如描述于(Briers 等，J.Biochem.Biophys Methods70:531-533,(2007))。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的多肽、片段和/或衍生物還在N端或C端包含標(biāo)簽，諸如His6標(biāo)簽 、Strep標(biāo)簽、Avi標(biāo)簽、Myc標(biāo)簽、Gst標(biāo)簽、JS標(biāo)簽、半胱氨酸標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽，或其他本領(lǐng)域公知的標(biāo)簽。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽與依照本發(fā)明的多肽、片段和/或衍生物在C端連接。所述標(biāo)簽可通過(guò)額外的氨基酸殘基與所述多肽、片段和/或衍生物連接。所述額外的氨基酸殘基可由至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)額外氨基酸殘基組成。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽通過(guò)額外的氨基酸殘基Leu-Glu或Lys-Gly連接于依照本發(fā)明的多肽、片段和/或衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含依照SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽。與具有依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽相比，具有依照SEQ IDNO: 7的氨基酸序列的多肽分別包含額外的C端His6_標(biāo)簽，所述標(biāo)簽通過(guò)額外的氨基酸殘基賴氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)與具有依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的C端連接。此外，在第2和第3位導(dǎo)入了 BamHI限制性位點(diǎn)。包含依照SEQID NO:7的氨基酸殘基的多肽優(yōu)選由依照SEQ ID NO:8的核苷酸序列編碼。本發(fā)明的另一個(gè)方面是這樣的融合蛋白，其由依照本發(fā)明的多肽、片段和/或衍生物，以及與該依照本發(fā)明的多肽、片段和/或衍生物多肽在N端或C段融合以增強(qiáng)該細(xì)胞內(nèi)溶素針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的活性的、具有膜破壞活性或LPS破壞活性的肽段構(gòu)成。優(yōu)選地，所述肽段是根據(jù)W02010023207的陽(yáng)離子性肽和/或多聚陽(yáng)離子性肽，通過(guò)提述將該文件完整并入本文。依照本發(fā)明的融合蛋白的肽段優(yōu)選與依照本發(fā)明的多肽、片段和/或衍生物共價(jià)連接。優(yōu)選地，所述肽段由至少5個(gè)、更優(yōu)選至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或至少100個(gè)氨基酸殘基組成。特別優(yōu)選的肽段包含約5至約100個(gè)氨基酸殘基、約5至約50個(gè)或約5至30個(gè)氨基酸殘基。更優(yōu)選的肽段包含約6至約42個(gè)氨基酸殘基、約6至約39個(gè)氨基酸殘基、約6至約38個(gè)氨基酸殘基、約6至約31個(gè)氨基酸殘基、約6至約25個(gè)氨基酸殘基、約6至約24個(gè)氨基酸殘基、約6至約22個(gè)氨基酸殘基、約6至約21個(gè)氨基酸殘基、約6至約20個(gè)氨基酸殘基、約6至約19個(gè)氨基酸殘基、約6至約16個(gè)氨基酸殘基、約6至約14個(gè)氨基酸殘基、約6至約12個(gè)氨基酸殘基、約6至約10個(gè)氨基酸殘基或約6至約9個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，所述肽段不是諸如His6標(biāo)簽、Strep標(biāo)簽、Avi標(biāo)簽、Myc標(biāo)簽、Gst標(biāo)簽、JS標(biāo)簽、半胱氨酸標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、或其他本領(lǐng)域公知標(biāo)簽的標(biāo)簽，也不是硫氧還蛋白或麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)。然而，該肽段可額外的包含此類標(biāo)簽或多個(gè)標(biāo)簽等，其用于純化或定位蛋白。本發(fā)明還涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的分離的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的核酸分子包含根據(jù)SEQ ID N0:2、6或18的核酸序列。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的載體。所述載體可提供根據(jù)本發(fā)明的所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)。本發(fā)明還涉及用于從微生物獲得所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的方法，如經(jīng)遺傳修飾的合適的宿主細(xì)胞，其表達(dá)所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白。所述宿主細(xì)胞可為微生物如細(xì)菌或酵母，或者動(dòng)物細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞特別是人細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。宿主可僅由于生物技術(shù)上的原因選取，例如產(chǎn)量、溶解度、成本等，但也可從醫(yī)藥的觀點(diǎn)來(lái)選取，例如，非病理性細(xì)菌或酵母或人 細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于遺傳轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞以獲得本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的表達(dá)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是通過(guò)將編碼所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的遺傳物質(zhì)引入所述宿主細(xì)胞，并通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所公知的遺傳工程方法獲得其翻譯和表達(dá)來(lái)遺傳修飾的。在另一個(gè)方面本發(fā)明涉及組合物，優(yōu)選藥物組合物，其包含依照本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或經(jīng)下述核酸分子或載體轉(zhuǎn)化的宿主，所述核酸分子或載體包含編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含其他的試劑，其滲透革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜，如金屬螯合劑例如EDTA、TRIS、乳酸、乳鐵蛋白、多粘菌素、檸檬酸和/或其他如 Vaara(Agents that increase the permeability of the outer membrane.VaaraM.Microbiol Rev.1992Sep; 56 (3):395-441)所述的物質(zhì)。還優(yōu)選的是包含上述提及的滲透劑的組合的組合物。特別優(yōu)選的是包含約10 μ M至約IOOmM EDTA、更優(yōu)選約50 μ M至約IOmM EDTA、更優(yōu)選約0.5mM至約IOmM EDTA、更優(yōu)選約0.5mM至約2mM EDTA、更優(yōu)選約0.5mM至約ImM EDTA的組合物。還優(yōu)選包含約0.5mM至約2mM EDTA，更優(yōu)選約ImM EDTA以及另外約10至約IOOmM TRIS的組合物。本發(fā)明還涉及用作藥物的根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或經(jīng)包含編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主。在其他方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或經(jīng)包含下述核酸分子的載體轉(zhuǎn)化的宿主在制備用于治療和/或預(yù)防與病原性革蘭氏陰性細(xì)菌相關(guān)的病癥、疾病或病狀中的用途，所述核酸分子包含編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。具體而言，待治療和/或預(yù)防的病癥、疾病或病狀可以由下述包含人或動(dòng)物的病原性菌株的細(xì)菌組、科、屬或種的革蘭氏陰性細(xì)菌引起，如腸桿菌科(埃希氏菌屬(Escherichia)特別是大腸桿菌、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、朽1檬酸桿菌屬(Citrobacter)、愛(ài)德華氏菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)特別是肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、摩根氏菌屬(Morganella)、變形桿菌屬(Proteus)、普羅維登斯菌屬(Providencia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、耶爾森氏菌屬(Yersinia))、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)(假單胞菌屬特別是銅綠假單胞菌、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、鞘胺醇單胞菌屬(Sphingomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas))、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、弧菌屬(Vibiro)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、布魯氏菌屬(Brucella)、弗朗西斯氏菌屬(Francisella)、博德特氏菌屬(Bordetella)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、巴爾通氏體屬(Bartonella)、考克斯氏體屬(Coxiella)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、曼氏菌屬(Mannheimia)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、加德納氏菌屬(Gardnerella)、螺旋體科(Spriochaetaceae)(密螺旋體屬(Treponema)和疏螺旋體屬(Borrelia))、鉤端螺旋體科(Leptospiraceae)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacte r)、螺菌屬(Spirillum)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)、類桿菌科(Bacteroidaceae)(類桿菌屬(Bacteroides)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、卩卜啉單胞菌(Porphyromonas))、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、特別是鮑氏不動(dòng)桿菌(A.baumanii)。特別的，待治療和/或預(yù)防的病癥、疾病或病狀可由銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、類鼻疽伯克霍爾德氏菌、大腸桿菌和/或鼠傷寒沙門氏菌造成。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或經(jīng)下述核酸轉(zhuǎn)化的宿主的藥物，所述核酸包含編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。在其他方面，本發(fā)明涉及在需要治療和/或預(yù)防的受試者中治療病癥、疾病或病狀的方法，所述方法包括施與所述受試者有效量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或有效量的經(jīng)下述核酸轉(zhuǎn)化的宿主或根據(jù)本發(fā)明的組合物，所述核酸包含編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。所述受試者可為人或動(dòng)物。具體而言，所述治療方法可用于治療和/或預(yù)防由革蘭氏陰性細(xì)菌特別是上述列舉的革蘭氏陰性細(xì)菌造成的皮膚，軟組織，呼吸系統(tǒng)，肺，消化道，眼，耳，牙齒，鼻咽，口，骨，陰道，菌血癥(bacteraemia)傷口和/或心內(nèi)膜炎的感染。用于本發(fā)明的治療(或預(yù)防)方法中的施用劑量和途徑取決于待治療的具體疾病/感染位置。施用途徑可例如為經(jīng)口、局部、鼻咽、腸胃外、靜脈內(nèi)、直腸或任何其他的施用途徑。對(duì)于將根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或有效量的經(jīng)核酸(所述核酸包含編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列)轉(zhuǎn)化的宿主或根據(jù)本發(fā)明的組合物施用于感染位置(或有受感染危險(xiǎn)的位置)，可使用下述制齊U，所述制劑保護(hù)活性化合物免受環(huán)境影響如蛋白酶、氧化、免疫應(yīng)答等，直至其抵達(dá)感染位置。因此，所述制劑可為膠囊、錠劑、丸劑、栓劑、可注射溶液或任何其他醫(yī)藥上合理的蓋侖(galenic)制劑。優(yōu)選地，所述蓋侖制劑可包含合適的載體、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、緩沖劑或其他合適的試劑。例如，對(duì)于局部施用，所述制劑可為洗液或硬膏(plaster)，對(duì)于鼻咽施用所述試劑可為通過(guò)噴霧施與鼻部的鹽水溶液。

優(yōu)選地，如果待治療(或預(yù)防)的感染是由多重抗性的細(xì)菌菌株，特別是針對(duì)一種或多種下述抗生素具有抗性的菌株造成時(shí)，將根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白用于醫(yī)療，所述抗生素為:鏈霉素、四環(huán)素、頭孢噻吩、慶大霉素、頭孢噻肟、頭孢菌素、頭孢他啶或亞胺培南。此外，根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白可通過(guò)將其與常規(guī)的抗細(xì)菌劑如抗生素、硫醚抗生素、細(xì)菌素或細(xì)胞內(nèi)溶素等組合給藥而用于治療方法。本發(fā)明還涉及包含一個(gè)或多個(gè)隔室的藥物包(pharmaceutical pack),其中至少一個(gè)隔室包含一種或多種根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或一種或多種經(jīng)下述核酸轉(zhuǎn)化的宿主或根據(jù)本發(fā)明的組合物，所述核酸包含編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。在另一個(gè)方面本發(fā)明涉及制備藥物組合物的方法，所述方法包括將可藥用的稀釋齊U、賦形劑或載體與一種或多種根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或一種或多種經(jīng)下述核酸轉(zhuǎn)化的宿主混合，所述核酸包含編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。在甚至其他方面，本發(fā)明的組合物是化妝組合物。幾種細(xì)菌菌種可導(dǎo)致患者的身體暴露于環(huán)境的表面如皮膚的刺激。為了預(yù)防此類刺激或者為了消除所述細(xì)菌病原體的次要病候(minor manifestation),可使用特定的化妝制備物,其包含足夠量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白以降解已經(jīng)存在或新沉降的病原性革蘭氏陰性細(xì)菌。在其他方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白作為診斷手段用于醫(yī)藥、食品或飼料或環(huán)境診斷，特別是作為診斷手段用于診斷細(xì)菌感染，特別是由革蘭氏陰性細(xì)菌造成的細(xì)菌感染。在此方面，根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白可用作工具以特異性降解病原性細(xì)菌，特別是革蘭氏陰性病原性細(xì)菌。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白使得細(xì)菌細(xì)胞降解可通過(guò)添加去污劑如TritonX-100或其他減弱細(xì)菌細(xì)胞包膜(envelope)的添加劑如多粘菌素B來(lái)支持。需要特定細(xì)胞降解作為后續(xù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行特異性檢測(cè)的起始步驟，所述檢測(cè)使用基于核酸的方法如PCR、核酸雜交或NASBA (基于核酸序列的擴(kuò)增)，免疫方法如IMS、免疫熒光或ELISA技術(shù)，或其他依賴于細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞成分的方法如使用對(duì)獨(dú)特細(xì)菌組或種具有特異性的酶測(cè)定法(例如，β_半乳糖苷酶之于腸細(xì)菌，凝固酶之于凝固酶陽(yáng)性菌株)。在其他方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白用于處理或防止革蘭氏陰性細(xì)菌污染食品、食品加工設(shè)備、食品加工廠、與食品接觸的表面如架子和食品儲(chǔ)藏區(qū)域以及在所有其他病原性、偶發(fā)病原性(facultative pathogenic)或其他不受歡迎的細(xì)菌可潛在地感染食品材料情況下，醫(yī)療設(shè)備和醫(yī)院和診所中所有類型的表面時(shí)。具體而言，本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白可預(yù)防性地用作消毒劑。所述消毒劑可在手術(shù)之前或之后使用，或者例如在血液透析過(guò)程中使用。而且，早產(chǎn)嬰兒和免疫妥協(xié)的個(gè)體，或有假體裝置需要的那些受試者，可用根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白治療。所述治療可為預(yù)防性的，或在急性感染過(guò)程中進(jìn)行。在相同背景下，醫(yī)院內(nèi)感染，特別是由抗生素抗性菌株如銅綠假單胞菌(FQRP)，不動(dòng)桿菌屬菌種和腸桿菌科如大腸桿菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、朽1檬酸桿菌屬、愛(ài)德華氏菌屬、腸桿菌屬、哈夫尼菌屬、克雷伯氏菌屬、摩根氏菌屬、變形桿菌屬、普羅維登斯菌屬、沙雷氏菌屬和耶爾森氏菌屬菌種造成的感染可預(yù)防性地或在急性期中用根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白來(lái)治療。因此，根據(jù)本發(fā)明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白還可用作與其他可用于消毒溶液的成分如去污劑、tensid、溶劑、抗生素、硫醚抗生素或細(xì)菌素組合使用的消毒劑。下述實(shí)施例解釋本發(fā)明，但并不視為限定性的。除非另行指出，使用如SambiOCk等,1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 所述的分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法。實(shí)施例1:PVP-SEIgp 146 及其 N 端 PK 融合的變體 PK_PVP_SElgpl46腸炎沙門氏菌噬菌體PVPSEl的模塊性細(xì)胞內(nèi)溶素及其N端PK融合變體PK-PVP-SEIgp146的克隆、表達(dá)和純化PVP_SElgpl46(236個(gè)氨基酸長(zhǎng)，MW=2532 a)是來(lái)源于腸炎沙門氏菌噬菌體PVPSEl的模塊性細(xì)胞內(nèi)溶素，預(yù)測(cè)為具有一個(gè)N端肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(從氨基酸3至39)，和一個(gè)屬于溶菌酶樣家族的C端催化性殼聚糖酶結(jié)構(gòu)域(從氨基酸81至234)(見(jiàn)圖1)。用純化卩遼菌體 PVPSEl 基因組 DNA (獲自 S.Santos 博士，Universidade doMinho, Braga, Portugal)作為模板，使用 Pfu 聚合酶(Fermentas, Ontario, Canada)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增編碼細(xì)胞內(nèi)溶素PVP-SElgpl46的可讀框(0RF146)。使用了下述PCR參
數(shù):
權(quán)利要求
1.具有細(xì)胞內(nèi)溶素活性的多肽，其包含依照SEQID NO:1的氨基酸序列，或其片段或衍生物。
2.依照權(quán)利要求1的多肽，其中所述片段包含依照SEQID N0:3和/或5的氨基酸序列。
3.依照SEQID NO:1或2的多肽，其中所述衍生物在依照SEQ ID NO: 1、3和/或5的氨基酸序列中具有缺失、添加、插入和/或取代。
4.依照權(quán)利要求1-3的多肽，其中所述多肽在N端或C端與具有破壞膜或LPS活性的肽段融合。
5.依照前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的多肽，其還包含標(biāo)簽，優(yōu)選His6標(biāo)簽。
6.依照權(quán)利要求5的多肽，其中所述多肽包含依照SEQID NO:7的氨基酸序列。
7.一種融合蛋白 ，其包含依照前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的多肽以及在N端或C端融合于所述多肽的肽段，其中所述肽段是陽(yáng)離子性肽、多聚陽(yáng)離子性肽、兩親肽、壽司肽、防衛(wèi)素、疏水性肽和/或抗微生物肽。
8.依照權(quán)利要求7的融合蛋白，其中所述肽段包含約5至約100個(gè)氨基酸殘基，尤其是約5個(gè)至50個(gè)氨基酸殘基,尤其是約5個(gè)至30個(gè)氨基酸殘基。
9.依照權(quán)利要求7或8的融合蛋白，其中所述陽(yáng)離子性和/或多聚陽(yáng)離子性肽段包含選自精氨酸、組氨酸和賴氨酸殘基的至少一個(gè)氨基酸殘基，尤其是其中所述肽段中包含的至少約70%的氨基酸殘基是精氨酸、組氨酸和/或賴氨酸殘基，尤其是精氨酸和/或賴氨酸殘基。
10.依照權(quán)利要求7的融合蛋白，其中所述兩親肽包含至少一個(gè)選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸殘基的荷正電的氨基酸殘基，與至少一個(gè)選自纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甘氨酸殘基的疏水性氨基酸殘基組合，尤其是其中所述兩親肽中的至少約70%的所述氨基酸殘基是精氨酸或賴氨酸殘基，而所述兩親肽中的至少約30%的所述氨基酸殘基為纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸或甘氨酸殘基。
11.依照權(quán)利要求7的融合蛋白，其中所述肽段包含依照SEQID NO: 14-19的氨基酸序列。
12.依照權(quán)利要求7的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含依照SEQID NO: 13的氨基酸序列。
13.分離的核酸分子，其編碼依照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的多肽或依照權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的融合蛋白。
14.包含依照權(quán)利要求13的核酸分子的載體。
15.包含依照權(quán)利要求13的核酸分子或依照權(quán)利要求14的載體的宿主細(xì)胞。
16.依照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的多肽或依照權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的融合蛋白，用于人醫(yī)學(xué)、動(dòng)物醫(yī)學(xué)或診斷物質(zhì)，作為食物中或化妝品上的抗微生物劑，作為消毒劑或在環(huán)境領(lǐng)域中使用。
17.依照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的多肽或依照權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的融合蛋白，用作治療或預(yù)防革蘭氏陰性細(xì)菌感染的藥物。
18.依照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的多肽或依照權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的融合蛋白用于處理或防止食品、食品加工設(shè)備、食品加工工廠、與食品接觸的表面、醫(yī)療設(shè)備、醫(yī)院及診所中的表面的革蘭氏陰性細(xì)菌污染的用途。
19.藥物組合物,其包含依照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的多肽或依照權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的融合蛋白 。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有細(xì)胞內(nèi)溶素活性的多肽，其具有依照SEQ ID NO:1的氨基酸序列，以及所述多肽的片段或衍生物。此外，本發(fā)明涉及編碼所述多肽或其片段或衍生物的核酸分子，包含所述核酸分子的載體，以及包含所述核酸分子或所述載體的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明涉及所述多肽、或其片段或衍生物用作藥物，尤其是用于治療或預(yù)防革蘭氏陰性細(xì)菌感染、作為診斷手段、作為化妝物質(zhì)或作為消毒劑。本發(fā)明還涉及所述多肽或其片段或衍生物用來(lái)處理或防止食品、食品加工設(shè)備、食品加工工廠，與食品接觸的表面、醫(yī)療設(shè)備、醫(yī)院和診所的表面的細(xì)菌污染，尤其是革蘭氏陰性污染。此外，本發(fā)明涉及包含所述多肽或其片段或衍生物的藥物組合物。
文檔編號(hào)C12N9/52GK103201381SQ201180053178
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月3日
發(fā)明者J.C.V.羅德里格斯阿澤里多, S.R.布蘭科多桑托斯, L.D.克魯斯肯斯, R.拉維格尼, M.瓦爾馬格 申請(qǐng)人:勒芬天主教大學(xué)，K.U.勒芬R&D, 米尼奧大學(xué)