水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)的制備方法及其在制備抗前列腺癌藥品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物的制備方法及其新用途，尤其是水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)的制備方法 及其在制備抗前列腺癌藥品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 前列腺癌是指發(fā)生于前列腺體的惡性腫瘤。前列腺癌病理類型上包括腺癌、導(dǎo)管 腺癌、尿路上皮癌、鱗狀細胞癌、腺鱗癌，其中前列腺癌占95%以上。
[0003] 前列腺癌是一種全身性疾病，目前治療以前列腺根治術(shù)、睪丸切除術(shù)、內(nèi)分泌治療 為主，輔以化療、放療等。
[0004] 中醫(yī)中藥中的活血化瘀藥物能有效降低血液黏度和周圍血管阻力，有利于免疫系 統(tǒng)對癌細胞的作用。
[0005] CN1636017公開了含有蛋白酶激活系列的氣單胞菌溶素原及其在前列腺癌治療中 的使用方法，公開了修飾的氣單胞菌溶素原肽，該蛋白包含一個前列腺特異性蛋白酶切割 位點及一個前列腺組織特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0006] CN102946878A公開了前列腺癌的治療方法，采用釕絡(luò)合物鹽作為治療藥物。
[0007] CN1222935公開了用于前列腺癌的免疫治療和免疫診斷的化合物及方法，該發(fā)明 的化合物包括含有一種前列腺蛋白質(zhì)的至少一部分的多肽及多肽的核苷酸序列。
[0008] CN103347540A公開了用于治療前列腺癌的抗-a -Y-整聯(lián)蛋白抗體，通過抗血管 生成抗體DI17E6及其結(jié)構(gòu)性突變體治療前列腺癌患者。
[0009] CN102813939A公開了前列腺癌特異性基因-病毒藥物，本藥物是將前列腺癌特意 的抗癌基因插入到前列腺癌特異性的溶瘤病毒中而制成。
[0010] CN101949565A公開了 T-2毒素在制備治療前列腺癌的藥物中的應(yīng)用，通過瘤內(nèi)注 射T-2毒素治療實體瘤。
[0011] CN102421414A公開了用于治療前列腺癌的組合物，主要用藥為地加瑞克及其它藥 用鹽。
[0012] CN102268436A公開了前列腺癌靶向基因的寡核苷酸適配體、遞釋載體、遞釋系統(tǒng) 及其制備方法。遞釋載體由聚陽離子高分子材料、親水性聚合物和寡核苷酸適配體為基礎(chǔ)， 三者以共價方式鏈接構(gòu)成，所述遞釋系統(tǒng)由遞釋載體與miRNA、SiRNA或質(zhì)粒DNA形成的基 因遞釋系統(tǒng)。
[0013] CN101928696A公開了一種前列腺癌靶向腺病毒的制備方法及應(yīng)用，本發(fā)明涉及一 種前列腺癌特異性免疫溶瘤雙功能重組腺病毒載體系統(tǒng)的建立及其在前列腺癌細胞中的 目的基因的表達，病毒特異性復(fù)制及溶瘤功能的驗證。
[0014] CN101816685A公開了預(yù)防和治療前列腺癌的含羥基酸提取物及提取方法與應(yīng)用， 該方法是將瘤枝藻干燥、粉碎、過篩、超聲提取、提取液減壓濃縮兩次，得到雄性激素依賴型 或非雄性激素依賴型前列腺癌細胞增殖活性的預(yù)防和治療的藥品。
[0015] CN101442995公開了新型抗前列腺活性劑，該活性劑由含有番茄紅素和染料木黃 酮等組成。
[0016] CN103860528A公開了一種芳基萘型木質(zhì)素在制備抗前列腺癌藥物中的應(yīng)用，該發(fā) 明所述木質(zhì)素為6-羥基-4 0 -(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3 a-羥甲基-7-甲氧基-3, 4-二 氫-2-萘醛，并提供了芳基萘型木質(zhì)素類化合物的提取方法。
[0017] CN103813788A公開了治療前列腺癌的方法，該發(fā)明公開了用于減少前列腺癌的方 法和組合物。治療方法包括向受試者施用有效量的抑制前列腺基底上皮細胞增殖的試劑， 施用的試劑選用氟他米特、比卡魯胺、尼魯米特和ASC-J9。
[0018] CN103897050A公開了一種烏賊墨抗前列腺癌多肽及其制備方法，該方法所述烏賊 墨抗前列腺癌多肽的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No. 1，并提供了制備方法。
[0019] CN103204904A公開了一種抗前列腺癌赤魟軟骨蛋白多肽及其制備方法和用途，該 抗前列腺癌多肽的氨基酸序列為Ilc-Gla-Pr 0-His (IEPH)，并提供了制備方法。
[0020] CN103897037A公開了特異性結(jié)合前列腺癌的短肽及其應(yīng)用，該發(fā)明提供了一系列 利用噬菌體展示肽庫技術(shù)篩選得到的具有靶向前列腺癌特性的多肽。
[0021] 水蛭為醫(yī)蛭科動物水蛭，螞蝗的全體，味咸、苦，性平，有毒，歸肝經(jīng)，功能：破血逐 瘀，通經(jīng)消瘀，但水蛭的副作用較大。
[0022] 201210315709. 1公開了人工培育水蛭蛆蟲的工藝，該發(fā)明以水蛭等為原料，通過 人工可控的方法定向生成生物活性較高的蟲體。該發(fā)明首次提出一種水蛭基因重組的方 法，該方法可以批量工業(yè)化生產(chǎn)，生成的重組水蛭基因蛋白質(zhì)對前列腺癌有特殊藥理作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023] 本發(fā)明的目的是提供一種水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)的制備方法及其在制備抗前列腺癌藥 品中的應(yīng)用，本發(fā)明工藝過程中采用適宜的方法提取分離水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)，并根據(jù)水蛭蛆 蟲蛋白質(zhì)的特性輔以相應(yīng)的材料至制備成不同劑型的藥劑。
[0024] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的： (1)將1000 g水蛭蛆蟲在常溫膨化裝置（200520108339. X)中常溫條件下膨化粉碎。
[0025] 本步驟中，所述膨化壓力為0? l~5MPa，時間為10~60min。
[0026] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中，加入 膨脹溶劑并加壓至2~10MPa，形成膨脹溶劑體系，提取出水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)粗品。
[0027] 本步驟中，所述膨脹溶劑由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH 3 ? H2O組成或由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化銨組 成。
[0028]本步驟中，所述提取溫度為10~20°C，時間為10~30min。
[0029] (3)收集含有水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)粗品的溶液并且用微孔過濾器過濾去掉雜質(zhì)。
[0030] 本步驟中，所述微孔過濾器的孔徑為0. 5~50Mffl。
[0031] (4)用超濾機超濾處理，收集含有相應(yīng)分子量的水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)超濾溶液。
[0032] 本步驟中，所述超濾機的孔徑為50~100nm。
[0033](5)超濾液溶解在適宜的溶劑中用固相萃取柱分離，收集洗脫成分。
[0034]本步驟中，所述溶劑為乙腈。
[0035] (6)將洗脫成分溶解在合適的溶劑體系中，用超聲駐波液相制備色譜 (200920274485. 8)分離純化。
[0036] 本步驟中，所述溶劑體系由正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1. 25:3. 75:5)組成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）組成。
[0037] (7)純化后的水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)用真空冷凍干燥機制備成凍干蛋白粉。
[0038] 本步驟中，所述真空冷凍干燥溫度為_30~50°C、時間為18~26h。
[0039] (8)賦予不同的藥用輔助材料，分別制備成注射劑、口服劑、栓劑等，可用于制備抗 前列腺癌藥品。
[0040] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果如下：通過本發(fā)明分離純化的水蛭蛆蟲蛋白質(zhì) 用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法及葡聚糖凝膠G-75凝膠過濾法測得相對分子量為 10. 7~12. 2KPa ;用等電聚焦法測定其等電點為pH8. 9~9. 6 ;常規(guī)化學(xué)法分析結(jié)果表明其不 含糖類和磷酸基團；紫外分光光度法分析在260nm和280nm測定純化的水輕蛆蟲蛋白質(zhì)含 量為97. 7%;分子結(jié)構(gòu)屬非典型、非單一的昆蟲蛋白質(zhì)，鏈內(nèi)與鏈間不含二硫鍵，其三級結(jié) 構(gòu)構(gòu)象單元以無規(guī)卷曲為主，a螺旋與e折疊的含量比例基本相當(dāng)。本發(fā)明制備的水蛭 蛆蟲蛋白質(zhì)制劑質(zhì)量穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)清楚，藥理明晰，療效明顯，含量可檢可測，劑型多樣，成本 較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0041] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但并不局限如此，凡是對 本發(fā)明技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵 蓋在本發(fā)明的保護范圍中。
[0042] 實施例1: (1) 將1000 g水蛭蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對膨化裝置內(nèi) 充入二氧化碳氣體并加壓至〇. l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，水蛭蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的水蛭蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 ? H2O,加壓至2~10MPa，形成膨 脹溶劑體系，保持溫度l〇~20°C，時間10~30min，水