在含油酵母中通過提高yap1轉錄因子活性提高油含量的制作方法
【專利摘要】本文描述了具有提高的油含量的轉基因含油酵母，其包含提高的Yap1轉錄因子活性，其中所述提高的油含量是與非轉基因含油酵母的油含量相比的。所述提高的Yap1轉錄因子活性是由過表達Yap1轉錄因子、通過提高所述轉錄因子和能夠激活所述轉錄因子的蛋白質之間的相互作用、或通過它們的組合引起的。本文還描述了使用這些酵母菌株的方法。
【專利說明】在含油酵母中通過提高YAP1轉錄因子活性提高油含量
[0001]本專利申請要求2010年12月30日提交的美國臨時申請61/428，655的權益，該臨時申請全文以引用方式并入本文。
【技術領域】[0002]本發(fā)明屬于生物【技術領域】。更具體地，本發(fā)明涉及包含提高的Yapl轉錄因子活性而引起提高的油含量的含油酵母菌株。
【背景技術】
[0003]反應性氧物質[“R0S”]是包含氧并且包含未配對的價電子層電子的化學反應性分子。R0S，例如羥基自由基、超氧陰離子、和過氧化氫[“H202”]，作為有氧代謝的副產物在細胞中持續(xù)地產生，例如，通過呼吸作用過程中氧至水的不完全還原。ROS還通過暴露于輻射、光照、金屬、和氧化還原活性藥物而在脂肪酸的(6-氧化過程中產生。由于ROS可擾亂細胞的氧化還原狀態(tài)并最終導致對細胞組分(包括脂質、蛋白質、和DNA)的毒性損傷，細胞必須具有多種方法來感測ROS水平和轉換該信號，使得細胞防止氧化脅迫的效應和維持細胞的完整性。
[0004]通常，ROS的水平通過使用谷胱甘肽還原-氧化(氧還)循環(huán)和硫氧還蛋白體系而被控制，使得從NADPH接受電子并用于將H2O2還原為水。更具體地，電子從NADPH至硫氧還蛋白還原酶至硫氧還蛋白至抗氧化蛋白至H2O2地傳遞，產生水。該途徑中的多種基因的調控是復雜的。在酵母啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中對H2O2的適應性響應已被發(fā)現涉及至少167種蛋白質的表達的改變(Godon, C.等人，J.Biol.Chem.,.273:22480-22489 (1998))。
[0005]酵母啤酒糖酵母中感測H2O2水平的一種方式依賴基于氧化應激反應的主要轉錄因子(即，轉錄因子蛋白質Yapl)的信號途徑。響應于H2O2脅迫，基于至少一種分子內二硫鍵的形成(由抗氧化蛋白如Tsal和Gpx3催化并被其它蛋白質如Ybpl促進的反應),在Yapl中發(fā)生多步驟的構象變化。以這種活性的氧化形式，Yapl控制至少32種不同蛋白質(包括參與細胞抗氧化防御和谷胱甘肽/NADPH再生的那些)的大的調節(jié)子的表達(Lee，J.等人，J.Biol.Chem.，274:16040-16046( 1999))。Yapl的鈍化通過用Yapl-控制的硫氧還蛋白的酶還原發(fā)生，從而提供了自調控機制。缺少功能性Yapl蛋白質的啤酒糖酵母突變菌株對通過H2O2的殺滅是高度敏感的。
[0006]已知具有更多雙鍵的脂肪酸是更易受脂質過氧化作用影響的。因此，多不飽和脂肪酸[“PUFA”]是更易受通過ROS的氧化降解作用影響的，因為它們在其間包含多個位于具有尤其反應性的氫的亞甲基-CH2-基團的雙鍵。Avery，A.M.和S.V.Avery (J.Biol.Chem.，276:33730-33735 (2001))報道了啤酒糖酵母 gpxl A /gpx2 A /gpx3 A 突變體對于在補充了 PUFAa-亞麻酸[“ALA”；18:3]的培養(yǎng)基中生長是缺陷型的，其中ALA能夠占總的膜脂肪酸的至多60% ；gpxl A、gpx2 A和gpx3 A突變體還展示了對于18:3的毒性,盡管該效應基于外源18:3向膜脂質內較緩慢的摻入速率而被延遲。[0007]由于ROS在進行有氧代謝的細胞中持續(xù)地產生，并且由于ROS能夠導致細胞的損傷和死亡，本領域的技術人員將會知道提高重組地工程化的生物防御ROS的能力的方法。在產生微生物油的那些生物中尤其如此，因為在某些微生物菌株中，在產生這些油的過程中，ROS的產生能夠導致微生物油生產中的較低的產量和/或降低的效率。
[0008]已經發(fā)現，工程化改造含油酵母以具有提高的Yapl轉錄因子活性和產生PUFA，導致了提高的脂質含量[“TFA%DCW”]和提高的平均PUFA滴度[“PUFA%DCW”]。

【發(fā)明內容】

[0009]在一個實施例中，本發(fā)明涉及具有提高的油含量的轉基因含油酵母，其包含提高的Yapl轉錄因子活性，其中所述提高的油含量是與非轉基因含油酵母細胞的油含量相比的。
[0010]在第二個實施例中，所述提高的Yapl轉錄因子活性是由過表達Yapl轉錄因子、通過提高所述轉錄因子和能夠激活所述轉錄因子的蛋白質之間的相互作用、或通過它們的組合引起的。
[0011]在第三個實施例中，所述能夠激活所述轉錄因子的蛋白質選自:Gpx3、Ybpl和Tsal ο
[0012]在第四個實施例中，所述Yapl轉錄因子包含編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽具有轉錄因子活性并且包含:(a)bZIP亮氨酸拉鏈基序；(b)N_末端富含半胱氨酸的結構域，其包含至少兩個由至少6個氨基酸隔開的半胱氨酸殘基的序列；和((3) C-末端富含半胱氨酸的結構域，其包含至少兩個由至少8個氨基酸隔開的半胱氨酸殘基的序列。
[0013]在第五個實施例中，所述Gpx3蛋白質包含:(a)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽能夠與所述Yapl轉錄因子相互作用以提高Yapl轉錄因子活性，其中基于BLASTP比對方法，所述多肽在與選自SEQ ID N0:26[ScGpx3]或SEQ ID N0:28[YlGpx3]的序列進行比較時具有至少70%的氨基酸同一性；(b)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽能夠與所述Yapl轉錄因子相互作用以提高Yapl轉錄因子活性，其中基于BLASTN比對方法，所述核苷酸序列在與選自SEQ ID N0:25[ScGpx3]或SEQ ID NO:27[YlGpx3]的序列進行比較時具有至少70%的序列同一性JP(C) (a)或(b)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和所述核苷酸序列由相同數量的核苷酸組成并且是100%互補的。
[0014]在第六個實施例中，所述Tsal蛋白質包含:(a)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽能夠與所述Yapl轉錄因子相互作用以提高Yapl轉錄因子活性，其中基于BLASTP比對方法，所述多肽在與選自SEQ ID N0:34[ScTsal]或SEQ ID NO:36[YlTsal]的序列進行比較時具有至少70%的氨基酸同一性；(b)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽能夠與所述Yapl轉錄因子相互作用以提高Yapl轉錄因子活性，其中基于BLASTN比對方法，
[0015]所述核苷酸序列在與選自SEQ ID N0:33[ScTsal]或SEQ ID NO: 35 [YlTsal]的序列進行比較時具有至少70%的序列同一性；和((3) (a)或(b)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和所述核苷酸序列由相同數量的核苷酸組成并且是100%互補的。
[0016]在第七個實施例中，所述Ybpl蛋白質包含:(a)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽能夠與所述Yapl轉錄因子相互作用以提高Yapl轉錄因子活性，其中所述多肽選自SEQ IDNO: 38 [ScYbpI]或SEQ ID NO:40 [YlYbpI] ; (b)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽能夠與所述Yapl轉錄因子相互作用以提高Yapl轉錄因子活性，其中基于保守結構域分析方法，將所述多肽序列分類在kinetOChor_Ybp2超家族內；或(0) (a)或(b)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和所述核苷酸序列由相同數量的核苷酸組成并且是100%互補的。
[0017]在第八個實施例中，所述轉基因含油酵母細胞來自選自下列的屬:耶氏酵母屬(Yarrowia)、假絲酵母屬(Candida)、紅酵母屬(Rhodotorula)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、絲抱酵母屬(Trichosporon)和油月旨酵母屬(Lipomyces)。優(yōu)選地，所述轉基因含油酵母細胞是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
[0018]在第九個實施例中，所述轉基因含油酵母細胞產生至少一種多不飽和脂肪酸。
[0019]在第十個實施例中，本發(fā)明涉及提高含油酵母中油含量的方法，其包括:
[0020]a)工程化所述含油酵母以過表達選自下列的蛋白質:
[0021](i) Yapl 轉錄因子；
[0022](ii)能夠激活所述轉錄因子的蛋白質；
[0023](iii) (a)和(b)的組合；以及
[0024]b)使所述含油酵母在適宜的條件下生長以產生與非轉基因含油酵母的油含量相比提高的油含量。
[0025]【專利附圖】

【附圖說明】和序列描 沭
[0026]圖1是啤酒糖酵母GPX3[ “ScGPX3”]通過其激活啤酒糖酵母YAPl [ “ScYapl”]的機制的圖。ScGPX3包含Cys36和Cys82，它們形成分子間二硫鍵(_S_S_)或被還原為包含硫醇基(-SH)。ScYapl包含N-末端和C-末端富含半胱氨酸的結構域(各自以黑色顯示)；這些富含半胱氨酸的結構域中的Cys303、Cys310和Cys315和Cys598、Cys620和Cys629被顯示為6條垂直的黑色線。Cys36ScGpx3的硫醇基(_SH)與H2O2反應，導致水的釋放和磺酸(-S0H)的形成。然后-SOH與ScYapl (還原形式)的Cys598的-SH縮合，形成分子間二硫鍵(-S-S-)，然后其被轉換為ScYapl的Cys303和Cys598之間的分子內二硫鍵，從而產生氧化的ScYapl蛋白質中的構象變化。
[0027]圖2 是 ScYAPl (SEQ ID N0:2)和 YlYAPl (SEQ ID NO:4)之間的序列比較。在ScYAPl的位點69-115(對應于YlYAPl的位點115-166)的帶下劃線的、粗體的堿性氨基酸，表示用于DNA結合的bZIP結構域的堿性區(qū)域。在ScYAPl的位點87、94、108、和115 (對應于YlYAPl的位點138、145、159、和166)，在比對中以星號顯示的粗體的亮氨酸殘基，是bZIP結構域的亮氨酸拉鏈基序。在ScYAPl的位點303、310、315、598、620和629(對應于YlYAPl的位點309、316、483、505和514)的帶框線的半胱氨酸殘基，對于分子間和分子內相互作用是重要的(或很可能重要的)。
[0028]圖3提供了下列質粒的質粒圖譜:(A) pYRH60 ;和(B) pYRH61。
[0029]圖4顯示了在提高的H2O2濃度(即，從OmM至50mM H2O2)下，在YPD平板上的H2O2敏感度檢測結果。(A)比較了解脂耶氏酵母菌株Y4184 (對照)和Y4184U (yaplA)細胞的生長。(B)比較了用pRS316 (對照)或PYRH61轉化的啤酒糖酵母菌株BY4743 (對照)和BY4743 (yaplA )細胞的生長。
[0030]圖5提供了下列質粒的質粒圖譜:(A) pYRH43 ;和(B) pYRH65。
[0031]圖6 是 ScGPX3 (SEQ ID NO:26)和 Y1GPX3 (SEQ ID NO:28)之間的序列比較。在ScGpx3的位點36、64和82(對應于YlGpx3的位點42、70和88)的帶框線的半胱氨酸殘基，對于分子間和分子內相互作用是重要的(或很可能重要的)。[0032]圖7 是 ScTsal (SEQ ID NO:34)和 YlTsal (SEQ ID N0:36)之間的序列比較。在ScTsal的位點48和171 (對應于YlTsal的位點48和169)的帶框線的半胱氨酸殘基，對于分子間和分子內相互作用是重要的(或很可能重要的)。
[0033]圖8 是 ScYbpl (SEQ ID NO:38)和 YlYbpl (SEQ ID NO:40)之間的序列比較。
[0034]圖9 是 ScYbpl (SEQ ID N0:38)、YlYbpl (SEQ ID N0:40)、光滑假絲酵母(Candida glabrata)Ybpl [ “CgYbpl，，] (SEQ ID NO:43)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)NRRL Y-1140 Ybp I [ “KlYbpl”] (SEQ ID N0:44)、木糖發(fā)酵酵母(Scheffersomycesstipitis) CBS6054Ybpl [ “SsYbpl”] (SEQ ID NO:45)> 魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii) CBS732Ybpl[ “ZrYbpl”] (SEQ ID N0:46)、和白假絲酵母(Candida albicans)SC5314Ybpl[ “CaYbpl”] (SEQ ID NO:47)之間的序列比較。
[0035]下面的序列遵循37C.F.R.§ § 1.821-1.825 (“對含有核酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請的要求一序列規(guī)則” (“Requirements for Patent ApplicationsContaining Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-theSequence Rules”))，并且符合世界知識產權組織(World Intellectual PropertyOrganization) (WIPO)ST.25 標準(1998)以及 EPO 和 PCT 的序列表要求(規(guī)則 5.2 和 49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208節(jié)和附錄C)。用于核苷酸和氨基酸序列數據的符號和格式遵循如37C.F.R.§ 1.822所示的規(guī)定。
[0036]SEQ ID NO:1至47是表1中鑒定的ORF編碼基因、蛋白質(或它們的部分)、引物或質粒。
`[0037]表1:核酸和蛋白質序列號簡述
[0038]
【權利要求】
1.具有提高的油含量的轉基因含油酵母，包含提高的Yapl轉錄因子活性，其中所述提高的油含量是與非轉基因含油酵母的油含量相比的。
2.根據權利要求1所述的轉基因含油酵母，其中所述提高的Yapl轉錄因子活性是由過表達Yapl轉錄因子、通過提高所述轉錄因子和能夠激活所述轉錄因子的蛋白質之間的相互作用、或通過它們的組合引起的。
3.根據權利要求2所述的轉基因含油酵母，其中所述能夠激活所述轉錄因子的蛋白質選自:Gpx3、Ybpl 和 Tsal。
4.根據權利要求2所述的轉基因含油酵母，其中所述Yapl轉錄因子包含編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽具有轉錄因子活性并且包含: a)bZIP亮氨酸拉鏈基序； b)N-末端富含半胱氨酸的結構域，其包含至少兩個由至少6個氨基酸隔開的半胱氨酸殘基的序列；和 c)C-末端富含半胱氨酸的結構域，其包含至少兩個由至少8個氨基酸隔開的半胱氨酸殘基的序列。
5.根據權利要求4所述的轉基因含油酵母，其中所述Yapl轉錄因子的序列選自SEQIDNO:2 和 SEQ ID NO:4。
6.根據權利要求3所述的轉基因含油酵母，其中所述Gpx3蛋白質包含: a)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽能夠與所述Yapl轉錄因子相互作用以提高Yapl轉錄因子活性，其中基于BLASTP比對方法，所述多肽在與選自SEQ ID N0:26[ScGpx3]或SEQ ID N0:28[YlGpx3]的序列進行比較時具有至少70%的氨基酸同一性； b)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽能夠與所述Yapl轉錄因子相互作用以提高Yapl轉錄因子活性，其中基于BLASTN比對方法，所述核苷酸序列在與選自SEQ IDNO:25[ScGpx3]或SEQ ID NO:27[YlGpx3]的序列進行比較時具有至少70%的序列同一性；或 c)(a)或(b)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和所述核苷酸序列由相同數量的核苷酸組成并且是100%互補的。
7.根據權利要求3所述的轉基因含油酵母，其中所述Tsal蛋白質包含: a)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽能夠與所述Yapl轉錄因子相互作用以提高Yapl轉錄因子活性，其中基于BLASTP比對方法，所述多肽在與選自SEQ ID NO:34[ScTsal]或SEQ ID NO:36[YlTsal]的序列進行比較時具有至少70%的氨基酸同一性； b)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽能夠與所述Yapl轉錄因子相互作用以提高Yapl轉錄因子活性，其中基于BLASTN比對方法，所述核苷酸序列在與選自SEQ IDNO:33[ScTsal]或SEQ ID NO:35[YlTsal]的序列進行比較時具有至少70%的序列同一性；或 c)(a)或(b)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和所述核苷酸序列由相同數量的核苷酸組成并且是100%互補的。
8.根據權利要求3所述的轉基因含油酵母，其中所述Ybpl蛋白質包含: a)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽能夠與所述Yapl轉錄因子相互作用以提高Yapl轉錄因子活性，其中所述多肽選自SEQ ID NO:38[ScYbpl]或SEQ ID NO:40[YlYbpI];或b)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽能夠與所述Yapl轉錄因子相互作用以提高Yapl轉錄因子活性，其中基于保守結構域分析方法，將所述多肽序列分類在kinetochor_Ybp2超家族內；或 c)(a)或(b)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和所述核苷酸序列由相同數量的核苷酸組成并且是100%互補的。
9.根據權利要求1所述的轉基因含油酵母，其中所述轉基因含油酵母來自選自下列的屬:耶氏酵母屬(Yarrowia)、假絲酵母屬(Candida)、紅酵母屬(Rhodotorula)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、絲抱酵母屬(Trichosporon)和油脂酵母屬(Lipomyces)0
10.根據權利要求8所述的轉基因含油酵母，其中所述轉基因含油酵母是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
11.根據權利要求1所述的轉基因含油酵母，其中所述轉基因含油酵母產生至少一種多不飽和脂肪酸。
12.提高含油酵母中油含量的方法，包括: a)工程化所述含油酵母以過表達選自下列的蛋白質: (i)Yapl轉錄因子； (?)能夠激活所述轉錄因子的蛋白質； (iii) (a)和(b)的組合；以及` b)使所述含油酵母在適宜的條件下生長以產生與非轉基因含油酵母的油含量相比提高的油含量。
【文檔編號】C12P7/64GK103502461SQ201180063058
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2011年12月29日 優(yōu)先權日:2010年12月30日
【發(fā)明者】S-P.洪, Z.薛, Q.Q.朱 申請人:納幕爾杜邦公司