專(zhuān)利名稱(chēng)：用基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增來(lái)擴(kuò)增和檢測(cè)hbvdna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增HBV DNA的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法。
核酸擴(kuò)增方法應(yīng)用于分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)領(lǐng)域。這些方法用于增加特異核酸序列的拷貝數(shù)，這些特異核酸序列少量存在并常常存在于同時(shí)也存在有多種其他核酸序列(包括RNA和DNA)的環(huán)境中。使用核酸擴(kuò)增方法尤其有助于核酸的檢測(cè)和定量，其對(duì)于診斷例如傳染病、遺傳病和各種類(lèi)型的癌癥是重要的。核酸擴(kuò)增方法也應(yīng)用于其他領(lǐng)域，在這些領(lǐng)域中研究其中可能微量存在核酸的樣品，例如法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)或者確定親權(quán)。
已知幾種核酸擴(kuò)增技術(shù)基于不同的作用機(jī)制。在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP200362和EP 201148中描述了一種核酸擴(kuò)增的方法，其稱(chēng)為“聚合酶鏈反應(yīng)”(PCR)。
本發(fā)明涉及一種不同類(lèi)別的核酸擴(kuò)增方法，即“基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增技術(shù)”。采用這些方法可以從含有可被RNA聚合酶識(shí)別的功能啟動(dòng)子的DNA模板獲得多重RNA拷貝。將這些RNA拷貝作為目標(biāo)，從中可以獲得新的DNA模板等等。Gingeras等人在WO 88/10315中和Burg等人在WO 89/1050中描述了這些方法。Davey等人在EP 323822(涉及NASBA方法)中，Gingeras等人在EP 373960中和Kacian等人在EP 408295中描述了基于等溫轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增技術(shù)?；谵D(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)也可以用熱穩(wěn)定的酶來(lái)進(jìn)行?；谵D(zhuǎn)錄的擴(kuò)增通常在大約41攝氏度的溫度進(jìn)行。熱穩(wěn)定的酶使得反應(yīng)能夠在更高的溫度進(jìn)行。在以ToyoBoseki KK的名義申請(qǐng)的EP 682121中描述了這種熱穩(wěn)定方法。
EP 323822、EP 373960和EP 408295中描述的方法是等溫連續(xù)方法。采用這些方法需要四種酶活性來(lái)完成擴(kuò)增依賴(lài)RNA的DNA聚合酶活性、依賴(lài)DNA的DNA聚合酶活性、RNA酶(H)活性和RNA聚合酶活性。這些活性中的一些可以聯(lián)合在一種酶中，所以通常只有2或3種酶是必需的。逆轉(zhuǎn)錄酶如AMV(禽成肌細(xì)胞瘤病毒)或MMLV(莫洛尼鼠白血病病毒)逆轉(zhuǎn)錄酶具有依賴(lài)RNA和DNA的DNA聚合酶活性以及固有的RNA酶H活性。另外，也可以向基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)混合物中加入RNA酶，例如大腸桿菌(E.coli)RNA酶H。
依賴(lài)DNA的RNA聚合酶從含有可被RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子的DNA模板合成多重RNA拷貝。RNA聚合酶的例子為來(lái)自大腸桿菌和噬菌體T7、T3和SP6的聚合酶。通常與基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法一起使用的RNA聚合酶的例子為T(mén)7聚合酶。因此，結(jié)合入用于產(chǎn)生RNA多重拷貝的模板中的啟動(dòng)子為T(mén)7-啟動(dòng)子。含有啟動(dòng)子的模板通常必須從含有目標(biāo)序列的核酸開(kāi)始來(lái)產(chǎn)生。該核酸可能存在于用作擴(kuò)增反應(yīng)輸入的起始材料中。在起始材料中存在的核酸通常含有目標(biāo)序列，該目標(biāo)序列作為長(zhǎng)得多的序列的一部分。額外的核酸序列可以存在于目標(biāo)序列的3′和5′末端?？梢酝ㄟ^(guò)將下列物質(zhì)放在一起來(lái)開(kāi)始擴(kuò)增反應(yīng)來(lái)自起始材料的該核酸；適當(dāng)?shù)拿?，這些酶一起提供上述的活性；和至少一種(但通常為兩種)寡核苷酸。這些寡核苷酸中至少一種應(yīng)當(dāng)含有RNA聚合酶啟動(dòng)子的序列。雖然單鏈或雙鏈DNA同樣可用作輸入材料，但是如果輸入材料為單鏈RNA，則基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法就特別有用。當(dāng)基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法應(yīng)用于含有單鏈RNA(附加序列位于目標(biāo)序列的3′末端和5′末端)的樣品時(shí)，適宜用于現(xiàn)有技術(shù)中所描述的方法的寡核苷酸對(duì)由下列組成-第一寡核苷酸(通常稱(chēng)為“啟動(dòng)子-引物”或“正向-引物”)，其能夠與目標(biāo)序列的3′末端雜交，并具有連接到其5′末端上的啟動(dòng)子序列(優(yōu)選的為T(mén)7啟動(dòng)子)(該寡核苷酸的雜交部分具有與用作輸入材料的目標(biāo)RNA相反的極性)。
-第二寡核苷酸(通常稱(chēng)為“反向引物”)，其含有目標(biāo)序列的5′末端(該寡核苷酸具有與目標(biāo)RNA相同的極性)。
當(dāng)將這樣的寡核苷酸對(duì)、同具有適當(dāng)活性的所有的酶和足夠量的必需的核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸一起構(gòu)成一個(gè)反應(yīng)混合物，并在適當(dāng)?shù)臈l件下(即在適當(dāng)?shù)木彌_條件下和于適當(dāng)?shù)臏囟认?保持足夠的時(shí)間時(shí)，等溫連續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)就將開(kāi)始。上述主題的許多變體已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)行了描述?；谵D(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)包括從模板合成單鏈RNA轉(zhuǎn)錄物，該模板含有可被RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)識(shí)別的啟動(dòng)子(例如T7啟動(dòng)子)。含有啟動(dòng)子序列的正向引物可作為引物來(lái)起始與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的DNA鏈的合成。
引物通過(guò)依賴(lài)RNA的DNA聚合酶活性進(jìn)行延伸。所形成的RNA-cDNA雜化物通過(guò)RNA酶H來(lái)降解。這使得特異的反向引物與cDNA雜交。該引物通過(guò)依賴(lài)RNA的DNA聚合酶進(jìn)行延伸直至cDNA的5′末端，結(jié)果導(dǎo)致雙鏈啟動(dòng)子序列的形成，由此作為正向引物一部分的啟動(dòng)子序列被用作模板。然后通過(guò)依賴(lài)DNA的RNA聚合酶將該雙鏈啟動(dòng)子用于產(chǎn)生許多新的RNA分子，這些RNA分子與目標(biāo)RNA互補(bǔ)。在該起始階段之后，擴(kuò)增進(jìn)入循環(huán)階段。
實(shí)際上，從樣品中的單鏈RNA開(kāi)始，一旦將所有的成分放在一起，并將混合物置于適當(dāng)?shù)臏囟纫宰屆付加谢钚?，整個(gè)一系列事件就會(huì)發(fā)生。該方法的操作者不需要通過(guò)干預(yù)來(lái)完成這些步驟中的任何一個(gè)。
正如上面所解釋的，基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法對(duì)于從單鏈RNA開(kāi)始的擴(kuò)增特別有用。含有將要擴(kuò)增的核酸的起始材料可以不含有以指定長(zhǎng)度的RNA的形式存在的目標(biāo)核酸。當(dāng)對(duì)于含有目標(biāo)序列(只以雙鏈DNA的形式存在，環(huán)狀或線(xiàn)性)的起始材料施行基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法時(shí)，必須將DNA轉(zhuǎn)變成單鏈核酸。這可以通過(guò)在應(yīng)用升高的溫度(直至100攝氏度)的條件而分離雙鏈DNA的鏈來(lái)完成。然后可以將在擴(kuò)增中用作引物的第一寡核苷酸與單鏈中的一條進(jìn)行退火。在通常的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法中使用的酶不能耐受如此的高溫，因此其只能在分離DNA鏈之后加入。當(dāng)一個(gè)寡核苷酸與單鏈DNA進(jìn)行退火并進(jìn)行延伸時(shí)，就再次形成雙鏈DNA，然后必須將反應(yīng)混合物經(jīng)歷升高的溫度，該溫度足夠高以將雙鏈DNA再次分解成其分離的鏈。酶將會(huì)再次失活，在實(shí)施加熱步驟之后要加入新的酶?，F(xiàn)在可以加入第二寡核苷酸，并與從在第一步中延伸的第一寡核苷酸所形成的鏈進(jìn)行退火。由于一個(gè)寡核苷酸含有依賴(lài)DNA的RNA聚合酶的5′啟動(dòng)子序列(見(jiàn)上)，所以獲得含有雙鏈功能啟動(dòng)子的雙鏈DNA模板，從中可以發(fā)生RNA產(chǎn)生的第一步。結(jié)果產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物可以進(jìn)入擴(kuò)增的循環(huán)階段，并且該過(guò)程進(jìn)一步將等溫進(jìn)行。
從上述中明顯的是，從雙鏈DNA開(kāi)始基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法會(huì)是一個(gè)繁瑣的過(guò)程。其要求操作者進(jìn)行幾個(gè)特殊的操作，樣品必須反復(fù)加熱和冷卻，以及酶必須在每次加熱步驟之后進(jìn)行補(bǔ)充。
一些研究已經(jīng)進(jìn)入開(kāi)發(fā)能夠從dsDNA開(kāi)始的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法，而避免上述的將dsDNA轉(zhuǎn)變成ssRNA的繁瑣的程序，ssRNA可以用作循環(huán)等溫的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增的輸入。
在WO 9925868中公開(kāi)了相當(dāng)簡(jiǎn)單的用于dsDNA的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法。
根據(jù)WO 9925868所描述的方法，樣品中的dsDNA可以直接采用基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方案來(lái)擴(kuò)增，而根本不需任何的加熱處理步驟[超過(guò)90℃]，或者在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中只需一個(gè)起始的加熱步驟。相對(duì)短的dsDNA在該方法中優(yōu)選。實(shí)際上，該方法并沒(méi)有根本上不同于用來(lái)擴(kuò)增ssRNA的常規(guī)的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方案。
作為另一種選擇，起始材料中的雙鏈DNA可以在擴(kuò)增開(kāi)始之前轉(zhuǎn)錄成RNA。這一額外的步驟可以依靠酶來(lái)進(jìn)行，例如大腸桿菌RNA聚合酶，該酶可在無(wú)啟動(dòng)子序列(也稱(chēng)為聚合酶結(jié)合位點(diǎn))存在的情況下將雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄成RNA。這一具有額外步驟的方法有助于通過(guò)基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法來(lái)擴(kuò)增雙鏈DNA，其已在PCT專(zhuān)利申請(qǐng)no.WO 9602668中進(jìn)行了描述。在該程序中所描述額外步驟不僅包括額外的處理步驟和處理時(shí)間，而且包括附加成分即大腸桿菌RNA聚合酶的使用。
在EP 397269中描述了制備用于基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法的合適模板的另一種方法。
在該專(zhuān)利中描述了一種方法，由此dsDNA用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行預(yù)處理。在用限制性?xún)?nèi)切酶處理之后，只需一個(gè)加熱分離步驟就可形成單鏈DNA(ssDNA)。在該方法中使用正向引物(啟動(dòng)子-引物)，其3′部分含有與DNA單鏈中的一條的準(zhǔn)確3′末端互補(bǔ)的序列，以及5′末端含有可被RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)識(shí)別的啟動(dòng)子序列。當(dāng)啟動(dòng)子-引物與DNA單鏈的3′末端雜交時(shí)，就形成了雙鏈復(fù)合物，其中正向引物的5′啟動(dòng)子序列可以作為用于從DNA鏈3′末端開(kāi)始延伸反應(yīng)的模板。因此，通過(guò)依賴(lài)DNA的DNA聚合酶可形成雙鏈啟動(dòng)子，結(jié)果產(chǎn)生的復(fù)合物可以作為對(duì)于依賴(lài)DNA的RNA聚合酶的模板從而合成RNA的多重拷貝。
在WO 9104340中也公開(kāi)了幾個(gè)對(duì)于單鏈DNA開(kāi)始基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)的方法?？梢栽俅斡孟拗菩?xún)?nèi)切酶在DNA上形成適當(dāng)?shù)?′末端，其能夠與啟動(dòng)子引物的3′序列雜交。
在WO 9104340中公開(kāi)了怎樣可以用切割ssDNA的限制性?xún)?nèi)切酶形成ssDNA上指定的3′末端。在同樣方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，切割dsDNA的限制性?xún)?nèi)切酶和能夠與目標(biāo)ssDNA雜交的限制性寡核苷酸一起使用，因此形成雙鏈DNA片段，其可用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行切割從而形成適當(dāng)?shù)?′末端。在這種方法中，限制性?xún)?nèi)切酶切割雙鏈復(fù)合物之后會(huì)剩下小片段的限制性寡核苷酸?？墒?，根據(jù)WO9104340的公開(kāi)內(nèi)容，顯然以這樣的方式挑選限制性寡核苷酸，使其在消化之后剩下的片段太小而不能保持與ssDNA 3′末端的雜交，因此將掉下去而為啟動(dòng)子寡核苷酸讓出空間?？墒?，雖然用現(xiàn)有技術(shù)方法中所使用的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行預(yù)處理可以導(dǎo)致靈敏的基于轉(zhuǎn)錄的測(cè)定，但是其需要許多額外的處理步驟和處理時(shí)間。
乙型肝炎病毒(HBV)感染在人類(lèi)中很普遍。該引起乙型肝炎的病毒看來(lái)似乎只感染人和黑猩猩。
肝炎感染通過(guò)三種一般機(jī)制傳播(1)通過(guò)腸胃外接種受感染的血液或體液，其可以大量如輸血或者以微量如通過(guò)偶然的皮膚刺破發(fā)生；(2)通過(guò)親密的家庭或性接觸；和(3)通過(guò)一些母親，她們將病毒傳播給她們的新生兒。在自然條件下，HBV并非高傳染性。通過(guò)吸入傳播即使有也很少發(fā)生。通過(guò)受到污染的血液或血液制品的傳播途徑是對(duì)于人類(lèi)健康的主要威脅。
HBV的感染常常導(dǎo)致亞臨床的或急性自限的肝臟疾病，或者可以導(dǎo)致慢性長(zhǎng)期感染。慢性HBV感染引發(fā)多種疾病實(shí)體，其從最嚴(yán)重形式的慢性活動(dòng)性肝炎，至嚴(yán)重性稍小的慢性遷延性肝炎，至無(wú)癥狀的帶毒者狀態(tài)。最近已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種診斷測(cè)定來(lái)幫助臨床醫(yī)生區(qū)分乙型肝炎病毒感染和其他形式的病毒性肝炎(即甲型肝炎、丙型肝炎或戊型肝炎)?？墒?，區(qū)別急性乙型肝炎感染和有癥狀的慢性乙型肝炎感染的能力仍然存在問(wèn)題。由于慢性活動(dòng)性肝炎和慢性遷延性肝炎患者常常表現(xiàn)出肝炎的循環(huán)模式，因此這就尤其是真實(shí)的問(wèn)題，該循環(huán)模式以肝損傷的急性惡化和正常肝功能的交替出現(xiàn)為特征。
在HBV感染之后，血清中存在大量的病毒和相關(guān)顆粒。在有癥狀的感染階段，急性和慢性HBV患者都具有升高的肝酶水平，在他們的血清中具有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，并產(chǎn)生對(duì)于核衣殼抗原(HBcAg)的抗體。沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)于HBsAg或乙型肝炎e抗原(HBeAg)特異的抗體。通常觀(guān)察不到對(duì)于HBsAg的抗體的出現(xiàn)，直至大約循環(huán)的HBsAg消失之后兩個(gè)月。已知存在于血清中的病毒顆粒脫去它們的表面包被從而暴露出核衣殼，其稱(chēng)為核心抗原(HBcAg)。HBcAg的抗體產(chǎn)生出現(xiàn)在HBV感染的急性階段期間的早期，并能夠持續(xù)許多年，且慢性感染的患者能夠產(chǎn)生高滴度的抗HBc抗體。
HBsAg確定為急性或慢性乙型肝炎感染的最重要的標(biāo)記，其能夠在受感染的個(gè)體的血清中檢測(cè)到。供體血液的HBsAg篩選例如對(duì)于避免乙型肝炎的傳播是必需的。很清楚的是，在診斷性HBV測(cè)定中其靈敏度具有最大的重要性。
HBV是已知最小的DNA病毒；其基因組顯示出高度緊湊的組織。在HBV復(fù)制循環(huán)中獨(dú)特的方面為，前基因組mRNA作為第一條病毒DNA鏈合成的模板。HBV DNA聚合酶的RNA酶H活性隨后切除mRNA，然后合成互補(bǔ)的DNA鏈，從而產(chǎn)生部分雙鏈的DNA分子以裝入病毒體。在病毒成功進(jìn)入之后，部分雙鏈的DNA分子轉(zhuǎn)變成完全雙鏈的DNA分子。
在受感染的宿主的血液中可檢測(cè)到HBV DNA，這些宿主在超過(guò)90％情況中是HBsAg和HBeAg陽(yáng)性。當(dāng)前測(cè)量感染顆粒數(shù)量的技術(shù)方法為通過(guò)測(cè)量血清或血漿中病毒DNA的數(shù)量，因?yàn)槠渥羁煽康胤从吵鰪?fù)制的病毒的數(shù)量。有幾種測(cè)定法可用于此目的，例如分枝DNA(bDNA)測(cè)定法(Hendricks DA，Stowe BJ，Hoo BS，Kolberg J，IrvineBD，Neuwald PD，Urdea MS，Perrillo RP，1995.用分枝DNA(bDNA)信號(hào)擴(kuò)增測(cè)定法定量人血清中的HBV DNA(Quantitation of HBVDNA in human serum using a branched DNA(bDNA) signalamplification assay).Am J Clin Pathol 104537-546)、DNA雜交測(cè)定法和定量PCR(Pawlotsky JM，Bastie A，Lonjon I，Remire J，DarthuyF，Soussy CJ，Dhumeaux D，1997。對(duì)于臨床樣品中HBV DNA的常規(guī)檢測(cè)和定量應(yīng)當(dāng)使用什么技術(shù)呢？(What technique should be usedfor routine detection and quantification of HBV DNA in clinicalsamples？)Journal of Virological Methods 65245-253；Zaaijer HL，terBorg F， Cuypers HT，Hermus MC，Lelie PN，1994。用于檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA的方法的比較(Comparison of methods for detection ofhepatitis B Virus DNA).J Clin Microbiol 322088-2091)?？墒沁@些測(cè)定法中的大部分只有有限的靈敏度。
本發(fā)明涉及包括限制性?xún)?nèi)切酶消化的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法。該方法使得能夠進(jìn)行乙型肝炎病毒DNA的靈敏和特異的擴(kuò)增(以及隨后的檢測(cè))。使用本發(fā)明的方法，HBV DNA能夠以比使用現(xiàn)有技術(shù)的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法更有效的方式進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)方法相比較，使用限制性?xún)?nèi)切酶不會(huì)使本發(fā)明方法中所用的程序變得復(fù)雜。
本發(fā)明提供基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增目標(biāo)HBV核酸序列的方法，該方法從可選存在于樣品中的HBV DNA開(kāi)始，其包括下列步驟-在擴(kuò)增緩沖液中溫育懷疑含有HBV的樣品，該溫育體系中含有一種或多種能夠在所選限制位點(diǎn)切割DNA的限制性?xún)?nèi)切酶，該限制性?xún)?nèi)切酶在DNA鏈中的一條上形成指定的3′末端，和啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子引物具有包含被依賴(lài)DNA的RNA聚合酶所識(shí)別的啟動(dòng)子序列的5′區(qū)域和與指定的DNA鏈的3′末端互補(bǔ)的3′區(qū)域，第二引物，其具有與啟動(dòng)子引物相反的極性且含有目標(biāo)序列的5′末端，和在HBV ssDNA的情況下，含有限制性引物；-將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間，以進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶的消化；-將樣品以一定的溫度和時(shí)間進(jìn)行加熱處理，該溫度和時(shí)間足以失活限制性?xún)?nèi)切酶和/或至少部分地導(dǎo)致雙鏈的單鏈化；-向樣品中加入下列試劑，具有依賴(lài)RNA的DNA聚合酶活性的酶具有依賴(lài)DNA的DNA聚合酶活性的酶具有RNA酶H活性的酶具有RNA聚合酶活性的酶；和-將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間，以進(jìn)行擴(kuò)增。必需的(適當(dāng)?shù)?三磷酸核苷可以在用限制性?xún)?nèi)切酶溫育步驟期間就已經(jīng)存在，例如作為該擴(kuò)增緩沖液的一部分。可是，它們也可以在該程序中的稍后階段加入，例如在加熱處理之后與酶一起加入。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道用于基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法的酶和實(shí)行基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法的條件，并且知道所有可以作出的優(yōu)化基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)的通常修飾。例如，正向引物即啟動(dòng)子引物可以在位于引物5′末端的啟動(dòng)子序列和位于引物3′末端的雜交序列之間含有嘌呤區(qū)域。
引物的序列主要由所選擇的限制位點(diǎn)的位置來(lái)決定。正向引物的3′末端應(yīng)當(dāng)與緊接著限制位點(diǎn)的目標(biāo)序列進(jìn)行退火。引物的長(zhǎng)度可以變化，只要其長(zhǎng)足夠能在擴(kuò)增反應(yīng)所使用的條件下進(jìn)行雜交。引物的雜交部分一般由大約10至大約35個(gè)核苷酸組成。
如果目標(biāo)為HBV ssDNA，在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的限制性引物就要求它們所顯示的與正向引物的重疊區(qū)為最??；并且以使限制性?xún)?nèi)切酶可以真正有效地切割DNA的方式結(jié)合入限制位點(diǎn)序列。
限制性?xún)?nèi)切酶是能夠在所選位點(diǎn)(即被該酶識(shí)別的特異的核苷酸序列)切割dsDNA的酶。在為本發(fā)明的方法選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意挑選在HBV DNA的所有變體中都存在的限制位點(diǎn)(例如，如果進(jìn)行擴(kuò)增是為了檢測(cè)樣品中所有的病毒HBV DNA，則應(yīng)挑選在乙型肝炎病毒的所有基因型中都存在的限制位點(diǎn))。限制位點(diǎn)應(yīng)當(dāng)不存在于所使用的正向和反向引物之間的DNA序列之內(nèi)。
限制性?xún)?nèi)切酶的添加導(dǎo)致指定的DNA目標(biāo)鏈的3′末端的形成，其對(duì)于和啟動(dòng)子引物的雜交部分的結(jié)合是有用的。另外的方面是，由于消化，DNA那部分的變性將會(huì)得到改善，因此有助于引物的結(jié)合。含有T7-啟動(dòng)子序列的啟動(dòng)子寡核苷酸應(yīng)當(dāng)以這樣的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)，即雜交部分與正位于限制位點(diǎn)上游的模板相互作用。具有依賴(lài)DNA的DNA聚合酶活性的酶(通常為逆轉(zhuǎn)錄酶，如MMLV-RT或AMV-RT)能夠用引物作為模板來(lái)延伸由限制性?xún)?nèi)切酶消化所形成的DNA目標(biāo)鏈的3′末端。將會(huì)形成雙鏈T7-啟動(dòng)子序列，從而能夠開(kāi)始生產(chǎn)擴(kuò)增子RNA。
令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)限制性?xún)?nèi)切酶能夠在適宜于和適合于基于轉(zhuǎn)錄的HBV DNA擴(kuò)增程序的環(huán)境中有效地作用。換言之，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用限制性?xún)?nèi)切酶來(lái)切割用作基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增的輸入材料的HBVDNA，不會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜的和附加的樣品處理。將限制性?xún)?nèi)切酶的使用合并入那些通常已經(jīng)是基于轉(zhuǎn)錄的DNA擴(kuò)增流程的一部分的步驟之中從而成為其中的一部分。
所有的現(xiàn)有技術(shù)方法都描述了限制性?xún)?nèi)切酶在制備用于基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增的DNA模板中的用途，其以真正的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增之前的分離的預(yù)處理形式進(jìn)行。因此，現(xiàn)有技術(shù)在制備DNA模板中使用限制性?xún)?nèi)切酶導(dǎo)致樣品的附加處理，如分離的限制性?xún)?nèi)切酶失活步驟和分離的DNA純化步驟。其使得整個(gè)擴(kuò)增程序變得復(fù)雜，尤其對(duì)于自動(dòng)化的過(guò)程，并增加了污染的風(fēng)險(xiǎn)。
雖然在WO 9104340中已經(jīng)公開(kāi)了與限制性?xún)?nèi)切酶一起添加限制性寡核苷酸，但是其沒(méi)有先于本發(fā)明公開(kāi)怎樣能夠?qū)⑾拗菩詢(xún)?nèi)切酶(和寡核苷酸)的使用與基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增有效地聯(lián)合在一起。
在現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有公開(kāi)以何種方式能夠?qū)⑾拗菩詢(xún)?nèi)切酶的使用與基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增聯(lián)合在一起而不需附加的樣品處理和試劑添加步驟。
本發(fā)明的方法提供了這種聯(lián)合而沒(méi)有使現(xiàn)有技術(shù)的基于轉(zhuǎn)錄的DNA擴(kuò)增過(guò)程變得復(fù)雜。
本發(fā)明的方法幾乎沒(méi)有不同于一般的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法。所采取的僅有的附加步驟為將用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)樣品進(jìn)行“內(nèi)置溫育(builtin incubation)”，這表示以這種方式使用限制性?xún)?nèi)切酶，即實(shí)際的樣品處理不會(huì)不同于常規(guī)的/現(xiàn)有技術(shù)的基于轉(zhuǎn)錄的DNA擴(kuò)增過(guò)程。
在本發(fā)明方法中所優(yōu)選使用的限制性?xún)?nèi)切酶當(dāng)然是在將其添加到含有擴(kuò)增緩沖液(含有相對(duì)較高濃度的鹽)的反應(yīng)混合物中的條件下仍相對(duì)穩(wěn)定和保持高活性的酶。
在添加限制性?xún)?nèi)切酶之后，需要將樣品在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行溫育并保持合適的時(shí)間以使酶起作用?？梢詫悠泛拖拗菩?xún)?nèi)切酶進(jìn)行溫育相對(duì)較短的時(shí)間，優(yōu)選溫育大約10-20分鐘，更優(yōu)選于大約35至大約45℃且特別是大約37-41℃溫育大約15分鐘，這顯然依賴(lài)于所使用的限制性?xún)?nèi)切酶的特性。事實(shí)上，與常規(guī)的基于轉(zhuǎn)錄的DNA擴(kuò)增方法相比較，這是要采取的僅有的附加措施。
本發(fā)明的方法包括在用限制性?xún)?nèi)切酶溫育之后加熱樣品的步驟。在該加熱期間，使得限制性?xún)?nèi)切酶失活和導(dǎo)致雙鏈DNA[至少部分地]變成單鏈。該加熱步驟已經(jīng)是進(jìn)行基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法的流程中的一部分。這些方法包括在引物添加之后樣品的加熱處理，從而形成對(duì)于引物退火最佳的環(huán)境(核酸伸展開(kāi)來(lái)，核酸的鏈或內(nèi)環(huán)分離開(kāi)，和在冷卻期間便于引物和模板的雜交)。
用酶溫育之后的加熱步驟可以在大約50℃或更高的較低溫度進(jìn)行，但優(yōu)選在超過(guò)90℃(優(yōu)選95+/-3℃)的溫度下通過(guò)短時(shí)間的溫育(大約5-10分鐘)來(lái)進(jìn)行。
此后，可以將樣品冷卻至對(duì)于進(jìn)行基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)適當(dāng)?shù)臏囟?通常為大約41℃)。
由于加熱，至少導(dǎo)致一部分的雙鏈DNA變成單鏈。當(dāng)引物(尤其是啟動(dòng)子寡核苷酸)在樣品加熱之前已經(jīng)存在時(shí)，加熱處理也可以有助于引物與DNA的退火。
因此，在樣品經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶的處理之后不需從樣品中純化出DNA。在加熱處理中可簡(jiǎn)單地將酶失活，該加熱處理已經(jīng)成為基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增程序的一部分。用本發(fā)明的方法已經(jīng)證明這足夠消除限制性?xún)?nèi)切酶干擾實(shí)際的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法的風(fēng)險(xiǎn)。
在加熱處理之后，以通常的方式加入用于基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增的其他擴(kuò)增試劑，然后基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增可以技術(shù)人員已知的通常方式來(lái)進(jìn)行。
擴(kuò)增酶只是在加熱處理之后加入以防止在加熱處理期間酶的降解(當(dāng)然除非使用熱穩(wěn)定的酶)。
本發(fā)明方法的主要優(yōu)點(diǎn)為，盡管使用了額外的試劑(例如限制性?xún)?nèi)切酶)，但這不會(huì)導(dǎo)致要進(jìn)行額外的(分離的)反應(yīng)步驟或操作。
不需額外的樣品處理的事實(shí)尤其重要，因?yàn)槊總€(gè)額外的樣品處理都會(huì)增加污染風(fēng)險(xiǎn)，這是無(wú)論如何都要避免的，尤其是在擴(kuò)增反應(yīng)中。此外，如果需要額外的樣品處理，這將會(huì)使得方法的自動(dòng)化操作復(fù)雜化。
本發(fā)明的方法也可用于單鏈DNA。當(dāng)DNA是單鏈時(shí)，限制性寡核苷酸或限制性引物含有與包括目標(biāo)DNA的限制位點(diǎn)的區(qū)域互補(bǔ)的序列，將其和限制性?xún)?nèi)切酶一起添加。
限制性寡核苷酸[限制性引物]與單鏈DNA雜交，并形成能夠被限制性?xún)?nèi)切酶切割的雙鏈復(fù)合物。又一試劑的添加(限制性寡核苷酸)不會(huì)使得實(shí)踐者進(jìn)行額外的步驟。限制性寡核苷酸可以簡(jiǎn)單地和限制性?xún)?nèi)切酶及其他對(duì)于擴(kuò)增所必需的寡核苷酸一起添加。因此，不需打開(kāi)擴(kuò)增系統(tǒng)來(lái)再次添加試劑。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，限制性寡核苷酸的功能可以合并入也含有可被依賴(lài)DNA的RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子序列的寡核苷酸(聯(lián)合型啟動(dòng)子和限制性引物)。采用這種方式，對(duì)于擴(kuò)增只需兩種寡核苷酸，即啟動(dòng)子[或正向]引物，其合并有與包含限制位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)的序列，和第二[或反向]引物。包含該優(yōu)選[聯(lián)合型啟動(dòng)子和限制性]引物的限制位點(diǎn)的序列應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地以這種方式配置，即-在消化之后，引物的剩余部分會(huì)在加熱期間從目標(biāo)上變性，-目標(biāo)雜交序列的剩余部分足夠長(zhǎng)以用于結(jié)合新的聯(lián)合型啟動(dòng)子和限制性引物，-如果對(duì)于限制性?xún)?nèi)切酶的活性是必需的，那么限制位點(diǎn)周?chē)念~外核苷酸包括在雜交之內(nèi)。
因此，聯(lián)合型啟動(dòng)子和限制性引物的一部分現(xiàn)在將作為限制性寡核苷酸；其將與目標(biāo)DNA進(jìn)行退火，從而導(dǎo)致含有可被限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別的限制位點(diǎn)的dsDNA。隨后限制性?xún)?nèi)切酶將切割該dsDNA，從而提供出指定的DNA上的3′末端。
優(yōu)選，相對(duì)于目標(biāo)DNA的存在數(shù)量，應(yīng)當(dāng)存在至少1000倍過(guò)量的聯(lián)合型啟動(dòng)子和限制性引物，這對(duì)于基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)中的常規(guī)啟動(dòng)子引物也已是通常水平。
本發(fā)明的方法提供了在懷疑含有乙型肝炎病毒(HBV)的樣品中有效和靈敏地?cái)U(kuò)增和檢測(cè)病毒DNA的方法，尤其是用此處所描述的HBV引物和HBV探針。所以，這些HBV引物和HBV探針代表了本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案。
在本發(fā)明方法中所選的限制位點(diǎn)優(yōu)選為在HBV的不同基因型中保守的限制位點(diǎn)。
如果目標(biāo)序列和限制位點(diǎn)位于HBV基因組中編碼表面抗原的那部分內(nèi)，就可獲得好結(jié)果。
在本發(fā)明的方法中特別有用的位于HBsAg編碼區(qū)域內(nèi)的保守限制位點(diǎn)(與切割這些位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶一起)為位于根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的核苷酸247-252上的XbaI位點(diǎn)、位于根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的核苷酸253-258上的BssSI位點(diǎn)和位于根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的核苷酸178-183上的AvrII位點(diǎn)。
當(dāng)然，引物的寡核苷酸序列主要由所選擇的限制位點(diǎn)的位置來(lái)決定。引物的長(zhǎng)度可以變化，只要其長(zhǎng)足以能在擴(kuò)增反應(yīng)所使用的條件下進(jìn)行雜交即可。引物的雜交部分一般由大約10至大約35個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選由大約15至大約30個(gè)核苷酸組成。
正向引物的5′末端應(yīng)當(dāng)與緊接著限制位點(diǎn)的目標(biāo)序列進(jìn)行退火。
反向引物的位置的關(guān)鍵性稍小，其應(yīng)當(dāng)優(yōu)選具有保守區(qū)域部分的序列，該保守區(qū)域離正向引物足夠遠(yuǎn)，從而讓探針能夠在正向和反向引物區(qū)域之間的區(qū)域內(nèi)與擴(kuò)增出的目標(biāo)序列雜交。
優(yōu)選的限制性引物為與正向引物有著最小重疊的寡核苷酸，其以使限制性?xún)?nèi)切酶能夠真正切割如此形成的dsDNA的方式包含限制位點(diǎn)的序列并且其長(zhǎng)足以能夠以充分的方式與HBV DNA雜交。
在與XbaI、AvrII和/或BssSI限制性?xún)?nèi)切酶聯(lián)合中特別有用的寡核苷酸正向引物是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。特別地，含有下列部分中至少10個(gè)和優(yōu)選多于15個(gè)核苷酸[從切割位點(diǎn)算起]的寡核苷酸序列是優(yōu)選的與限制性?xún)?nèi)切酶XbaI聯(lián)合時(shí)，SEQ ID No 1的HBV雜交部分[該雜交部分照此為SEQ ID No 10]；與限制性?xún)?nèi)切酶BssSI聯(lián)合時(shí)，SEQ ID No 2的HBV雜交部分[該雜交部分照此為SEQ ID No 11]；和/或與限制性?xún)?nèi)切酶AvrII聯(lián)合時(shí)，SEQ ID No 3的雜交部分[該雜交部分照此為SEQ ID No 12]。
能夠用作限制性引物的寡核苷酸包含在相關(guān)HBV DNA限制位點(diǎn)兩側(cè)的至少10個(gè)和優(yōu)選多于15個(gè)核苷酸，尤其是在下列位點(diǎn)兩側(cè)的核苷酸，即位于根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的核苷酸247-252的XbaI位點(diǎn)、位于根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的核苷酸253-258的BssSI位點(diǎn)和位于根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的核苷酸178-183上的AvrII位點(diǎn)。
特別合適的限制性引物具有SEQ ID No 8和SEQ ID No 9中所描繪的寡核苷酸序列。
用于檢測(cè)所擴(kuò)增的HBV目標(biāo)的合適探針含有10至大約35個(gè)且更優(yōu)選大約15至大約30個(gè)與所擴(kuò)增的HBV目標(biāo)雜交的核苷酸，以及含有SEQ ID No 6和SEQ ID No 7的HBV雜交部分中的至少10個(gè)且優(yōu)選多于15個(gè)核苷酸。(這些序列的HBV雜交部分出示在表1中，并分別標(biāo)明為SEQ ID No 13和SEQ ID No 14。進(jìn)一步提供了顯示于表1中的探針，在其兩個(gè)末端具有非HBV的核苷酸，這些非HBV的核苷酸完全地或者有時(shí)與少許HBV核苷酸一起形成探針的“主干”；該主干為所選擇的檢測(cè)系統(tǒng)的一部分。)合適的反向引物含有HBV保守區(qū)域中的大約10至大約35個(gè)且更優(yōu)選大約15至大約30個(gè)核苷酸。優(yōu)選的反向引物含有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5中的至少10個(gè)且優(yōu)選多于15個(gè)核苷酸。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案為適合根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行HBV DNA的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增和檢測(cè)的測(cè)試試劑盒，其含有-此處所描述的限制性?xún)?nèi)切酶，-如此處所說(shuō)明的，與所選限制性?xún)?nèi)切酶的切割位點(diǎn)相應(yīng)的正向引物，其和啟動(dòng)子序列一起提供，-進(jìn)行基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)的其他試劑，-檢測(cè)所擴(kuò)增的HBV DNA的方法，和-使用說(shuō)明書(shū)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1包括限制性?xún)?nèi)切酶消化的DNA NASBA的圖解顯示。限制性?xún)?nèi)切酶(箭頭)只是在NASBA的起始階段有活性。在消化之后，正向引物與模板雜交。AMV RT將會(huì)用正向引物來(lái)延伸包含T7啟動(dòng)子序列(暗灰色)作為模板的DNA目標(biāo)鏈(黑色)的3′末端。T7 DdRp會(huì)識(shí)別出雙鏈T7啟動(dòng)子序列，于是開(kāi)始產(chǎn)生RNA擴(kuò)增子(淺灰色)。RNA擴(kuò)增子序列與目標(biāo)DNA鏈互補(bǔ)。在循環(huán)階段期間，可用分子信標(biāo)技術(shù)來(lái)擴(kuò)增和檢測(cè)RNA擴(kuò)增子。只是在循環(huán)階段期間需要RNA酶H和反向引物。
圖2有和沒(méi)有XbaI消化的HBV DNA聯(lián)合正向引物S-p3.8的NASBA。在用XbaI消化之后，S-p3.8可用作目標(biāo)DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信標(biāo)S-WT2用作探針。沒(méi)有模板的樣品(NT)作為負(fù)對(duì)照。
圖3有和沒(méi)有BssSI消化的HBV DNA聯(lián)合正向引物S-p3.10的NASBA。在用BssSI消化之后，S-p3.10可用作目標(biāo)DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信標(biāo)S-WT2用作探針。沒(méi)有模板的樣品(NT)作為負(fù)對(duì)照。
圖4有和沒(méi)有XbaI消化的HBV DNA聯(lián)合正向引物S-p3.10的NASBA。在用XbaI消化之后，S-p3.10不可用作目標(biāo)DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信標(biāo)S-WT2用作探針。沒(méi)有模板的樣品(NT)作為負(fù)對(duì)照。
圖5有和沒(méi)有BssSI消化的HBV DNA聯(lián)合正向引物S-p3.8的NASBA。在用BssSI消化之后，S-p3.8可作用作目標(biāo)DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信標(biāo)S-WT2用作探針。沒(méi)有模板的樣品(NT)作為負(fù)對(duì)照。
圖6有和沒(méi)有AvrII消化的HBV DNA聯(lián)合正向引物S-p3.5的NASBA。在用AvrII消化之后，S-p3.5可用作目標(biāo)DNA延伸的模板。引物S-p4.4用作反向引物而分子信標(biāo)S-WT4用作探針。沒(méi)有模板的樣品(NT)作為負(fù)對(duì)照。
本發(fā)明通過(guò)下面的實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的舉例說(shuō)明。
實(shí)施例1HBV DNA的擴(kuò)增兩個(gè)保守的限制性位點(diǎn)(XbaI和BssSI)編碼于HBV DNA的S-gen的保守區(qū)域(根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的nt 244-285)內(nèi)。當(dāng)S-區(qū)域的這部分能夠成為負(fù)極性的單鏈DNA時(shí)，加入與包含限制位點(diǎn)序列的區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸(“限制性引物”(RP))，從而為所有存在的基因組DNA形成雙鏈限制位點(diǎn)。用Nuclisens Extractor(Organon Teknika)從被3×109geq/ml的HBV基因型A感染的血漿的一系列稀釋液中分離出HBV DNA。按照所述對(duì)于分離RNA的標(biāo)準(zhǔn)程序(Operator ManualExtractor，41001-9，rev A，1999)可獲得50μl的提取液。每次測(cè)定用5μl的提取液。限制性?xún)?nèi)切酶消化在下列條件下進(jìn)行NASBA緩沖液(40mM Tris-HCl pH8.5，12mM MgCl2，70mM KCl，15％v/v DMSO，5mM DTT，1mM的各種dNTP，2mM ATP，2mM CTP，2mM UTP，1.5mM GTP，0.5mM ITP，0.2μM正向引物(對(duì)于XbaI為S-p3.8，對(duì)于BssSI為S-p3.10，表1)，0.2μM反向引物(S-p4.5，表1)，0.1μM分子信標(biāo)探針(S-WT2，表1)，0.17μM限制性引物(RP-3，表1))和0.2單位的限制性?xún)?nèi)切酶BssSI(New England BioLabs，Inc.，Beverly，MA，USA)或3.0單位的限制性?xún)?nèi)切酶XbaI(New England BioLabs，Inc.，Beverly，MA，USA)。在于41℃溫育15分鐘之后，加熱失活限制性?xún)?nèi)切酶，并將DNA模板于95℃變性5分鐘。將反應(yīng)混合物冷卻至41℃并保持3分鐘，在此期間發(fā)生引物的雜交。隨后加入NASBA酶(2.1μg BSA，0.08單位的RNA酶H，32單位的T7 RNA聚合酶和6.4單位的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶)，并通過(guò)輕輕地敲打和短時(shí)間的離心將反應(yīng)混合物混和，然后開(kāi)始擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測(cè)。將反應(yīng)混合物在NucliSensEasyQ Analyzer(Organon Teknika)中于41℃溫育120分鐘，并每分鐘進(jìn)行熒光監(jiān)測(cè)。反應(yīng)物于485nm激發(fā)，于518nm測(cè)量到發(fā)射信號(hào)。
實(shí)施例1.1包括XbaI消化的HBV DNA的擴(kuò)增進(jìn)行有和沒(méi)有使用限制性?xún)?nèi)切酶XbaI處理的NASBA測(cè)定。在NASBA條件下的最佳XbaI濃度這樣確定即能夠消化109拷貝的含有HBV DNA的擴(kuò)增子區(qū)域的PCR片段，且結(jié)果顯示為3個(gè)單位。S-p3.8用作正向引物，并能夠在XbaI消化之后被AMV RT用作模板來(lái)延伸模板DNA。沒(méi)有消化時(shí)獲得3×106geq/ml的靈敏度，而消化之后靈敏度為3×103geq/ml，這表明靈敏度增加了1000倍(圖2)。另外，沒(méi)有消化時(shí)到達(dá)陽(yáng)性的時(shí)間(TTP)為大約16分鐘，而在XbaI消化之后其為大約6分鐘，這表明TTP減少了大約10分鐘(圖2)。這兩者都是擴(kuò)增反應(yīng)改善的指標(biāo)。
實(shí)施例1.2包括BssSI消化的HBV DNA的擴(kuò)增用同樣的HBV DNA提取物和與上述同等的反應(yīng)條件來(lái)進(jìn)行有和沒(méi)有使用限制性?xún)?nèi)切酶BssSI處理的NASBA反應(yīng)。在NASBA條件下的最佳BssSI濃度這樣確定即能夠消化109拷貝的含有HBV DNA的擴(kuò)增子區(qū)域的PCR片段，結(jié)果顯示為0.2個(gè)單位。S-p3.10用作正向引物，并能夠在BssSI消化之后被AMV RT用作模板來(lái)延伸模板DNA。用限制性?xún)?nèi)切酶BssSI處理的結(jié)果再次獲得了顯著的測(cè)試改善(圖3)。沒(méi)有消化時(shí)只獲得3×107geq/ml的靈敏度，而消化之后靈敏度為3×104geq/ml，這再次表明作為消化的結(jié)果靈敏度增加了1000倍(圖3)。另外，沒(méi)有消化時(shí)到達(dá)陽(yáng)性的時(shí)間(TTP)為大約21分鐘，而在BssSI消化之后其為大約11分鐘，這再次表明TTP減少了大約10分鐘(圖3)。這些結(jié)果證明在NASBA反應(yīng)之前用限制性?xún)?nèi)切酶消化HBV DNA能夠在相當(dāng)程度上改善HBV DNA的擴(kuò)增并因此改善HRV DNA的檢測(cè)。
實(shí)施例1.3包括XbaI消化的HBV DNA的擴(kuò)增-2為了測(cè)試由其本身消化還是限制性?xún)?nèi)切酶與所選引物的聯(lián)合是改善的測(cè)定結(jié)果的基本原因，用引物S-p3.10代替S-p3.8再次進(jìn)行包括XbaI消化的測(cè)定。在XbaI消化之后，AMV RT不能用S-p3.10作為模板來(lái)延伸目標(biāo)序列。正如能夠在圖4中所見(jiàn)的，在聯(lián)合S-p3.10的XbaI消化之后只獲得了靈敏度的輕微增加(10倍)和TTP的少量減少(大約5分鐘，從21至16分鐘)。這表明在NASBA起始期間模板的延伸是獲得改善的結(jié)果的原因，這些改善的結(jié)果可用XbaI與引物S-p3.8和用BssSI與引物S-p3.10來(lái)獲得。
實(shí)施例1.4包括BssSI消化的HBV DNA的擴(kuò)增-2為了測(cè)試目標(biāo)的延伸是否的確為測(cè)定結(jié)果改善的基本原因，用引物S-p3.8代替S-p3.10再次進(jìn)行包括BssSI消化的測(cè)定。在BssSI消化之后，AMV RT能夠用S-p3.8作為模板來(lái)延伸目標(biāo)序列?？墒?，在BssSI消化之后只有17個(gè)核苷酸參與了引物和目標(biāo)序列的雜交，而其通常為大約20個(gè)核苷酸。盡管有這些差異，但是在BssSI消化之后再次獲得了明顯的測(cè)試改善(圖5)。可以使用引物S-p3.8與S-p4.5、限制性引物RT-3和分子信標(biāo)S-WT2，用NASBA中包括的XbaI和BssSI來(lái)進(jìn)行雙消化，這與單消化NASBA測(cè)定相比并沒(méi)有降低擴(kuò)增效率。
實(shí)施例1.5包括AvrII消化的HBV DNA的擴(kuò)增限制位點(diǎn)(AvrII)編碼于HBV DNA的S-gen的另一個(gè)保守區(qū)域(根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的nt177-192)內(nèi)。如在NASBA中一樣使用正向引物S-p3.5、反向引物S-p4.4、分子信標(biāo)S-WT4和限制性引物RT-1(表1)。在AvrII消化之后，AMV RT能夠用S-p3.5作為模板來(lái)延伸HBV DNA的目標(biāo)鏈。使用與上述同樣的反應(yīng)條件。使用與上述同樣的HBV DNA提取物來(lái)進(jìn)行有和沒(méi)有使用限制性?xún)?nèi)切酶AvrII處理的NASBA反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)使用2單位的AvrII。沒(méi)有消化時(shí)獲得＞108geq/ml的靈敏度，而消化之后靈敏度為1×105geq/ml，這表明作為消化的結(jié)果靈敏度增加了＞103倍(圖6)。這些結(jié)果再次證明在NASBA反應(yīng)中包括的HBV DNA的限制性?xún)?nèi)切酶消化能夠在相當(dāng)程度上改善HBV DNA的擴(kuò)增。
表1 引物和探針序列
*T7-啟動(dòng)子序列用斜體表示，嘌呤序列用小寫(xiě)字母表示，探針的主干序列用加下劃線(xiàn)的斜體表示，并標(biāo)明了限制位點(diǎn)。
序列表<110>Akzo Nobel NV<120>用基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增來(lái)擴(kuò)增和檢測(cè)HBV DNA的方法<130>2001.633<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1aattctaata cgactcacta tagggagact cgtggtggac ttctctca 48<210>2<211>50
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2aattctaata cgactcacta tagggagaag gtggacttct ctcaattttc 50<210>3<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3aattctaata cgactcacta tagggagagg acccctgctc gtgttacagg c 51<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4gaaccaacaa gaagatgagg ca 22
<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5gggactgcga attttggcca20<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>6cgatcgaggg actgcgaatt ttggccgatc g 31<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>探針<220>
<221>misc feature<222>(9)..(10)<223>n＝肌苷<400>7ggatccctng aaaattgaga gaagtccacc acgggatcc 39<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8aataccgcag agtctagact cgtgg 25<210>9<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9catcaggayt cctagga17<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10gactcgtggt ggacttctct ca 22<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11ggtggacttc tctcaatttt c 21<210>12<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>12ggacccctgc tcgtgttaca ggc23<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>13agggactgcg aattttggcc20<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<220>
<221>misc feature
<222>(4)..(5)<223>n＝肌苷<400>14cctngaaaat tgagagaagt ccaccacg 28
權(quán)利要求
1.基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增目標(biāo)HBV核酸序列的方法，該方法從可選存在于樣品中的HBV DNA開(kāi)始，其包括下列步驟-在擴(kuò)增緩沖液中溫育疑似含有HBV的樣品，該溫育體系中含有一或多種能夠在所選限制位點(diǎn)切割該HBV DNA的限制性?xún)?nèi)切酶，該限制性?xún)?nèi)切酶在該HBV DNA鏈上形成指定的3′末端；啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子引物的5′區(qū)域包含被依賴(lài)DNA的RNA聚合酶所識(shí)別的啟動(dòng)子序列且其3′區(qū)域與該DNA鏈的指定的3′末端互補(bǔ)；第二或反向引物，其具有與啟動(dòng)子引物相反的極性且含有該目標(biāo)序列的5′末端；以及在HBV ssDNA作為目標(biāo)序列的情況下，含有限制性引物；-將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間，以進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶的消化；-將如此獲得的樣品以足以失活限制性?xún)?nèi)切酶和/或至少部分地導(dǎo)致雙鏈的單鏈化的溫度和時(shí)間進(jìn)行加熱處理；-向樣品中加入下列試劑，具有依賴(lài)RNA的DNA聚合酶活性的酶具有依賴(lài)DNA的DNA聚合酶活性的酶具有RNA酶H活性的酶具有RNA聚合酶活性的酶；和-將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間，以進(jìn)行擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該DNA為雙鏈HBV DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該DNA為單鏈且使用聯(lián)合型啟動(dòng)子和限制性引物從而聯(lián)合了啟動(dòng)子引物的功能和限制性引物的功能，該聯(lián)合型啟動(dòng)子和限制性引物含有與包括目標(biāo)ssDNA的限制位點(diǎn)的區(qū)域互補(bǔ)的序列和可被依賴(lài)DNA的RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中于加熱處理前向起始的溫育混合物中加入適當(dāng)?shù)娜姿岷塑铡?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所用逆轉(zhuǎn)錄酶聯(lián)合具有依賴(lài)RNA的DNA聚合酶活性的酶和具有依賴(lài)DNA的DNA聚合酶活性的酶的活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中使用本身具有RNA酶H活性的逆轉(zhuǎn)錄酶，從而代替以下3種酶，即具有依賴(lài)RNA的DNA聚合酶活性的酶、具有依賴(lài)DNA的DNA聚合酶活性的酶以及具有RNA酶H活性的酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中溫育溫度為35℃至大約45℃，優(yōu)選為大約37-41℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中加熱步驟在92-98℃的溫度進(jìn)行，優(yōu)選在大約95℃。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中使用在HBV不同基因型中保守的位點(diǎn)切割HBV DNA的限制性酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中限制位點(diǎn)位于HBV基因組中編碼表面抗原的部分內(nèi)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中限制位點(diǎn)為位于根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的核苷酸247-252的XbaI位點(diǎn)、位于根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的核苷酸253-258的BssSI位點(diǎn)或位于根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的核苷酸178-183的AvrII位點(diǎn)，并且所使用的限制性?xún)?nèi)切酶分別為XbaI、BssSI或AvrII限制性?xún)?nèi)切酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中限制性引物為含有10至大約35個(gè)且更優(yōu)選大約15至大約30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，這些核苷酸與HBV目標(biāo)雜交并含有在下列位點(diǎn)兩側(cè)的至少10個(gè)且優(yōu)選多于15個(gè)核苷酸位于根據(jù)EeoRI位點(diǎn)的核苷酸247-252的XbaI位點(diǎn)、位于根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的核苷酸253-258的BssSI位點(diǎn)或位于根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的核苷酸178-183的AvrII位點(diǎn)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中限制性引物具有SEQ ID No 8和SEQ ID No 9中所描繪的寡核苷酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中啟動(dòng)子或正向引物為包含與HBV目標(biāo)雜交的10至大約35個(gè)且更優(yōu)選大約15至大約30個(gè)核苷酸以及含有下列序列中的至少10個(gè)且優(yōu)選多于15個(gè)核苷酸[從切割位點(diǎn)算起]的寡核苷酸與限制性?xún)?nèi)切酶XbaI聯(lián)合時(shí)，SEQ ID No 10；或與BssSI聯(lián)合時(shí)，SEQ ID No 11；或與AvrII聯(lián)合時(shí)，SEQ ID No 12；該寡核苷酸連接于啟動(dòng)子序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中啟動(dòng)子寡核苷酸具有SEQ ID No1、SEQ ID No 2或SEQ ID No 3中所分別描述的核苷酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用雜交探針另外檢測(cè)所擴(kuò)增出的HBV核酸，該雜交探針含有包含10至大約35個(gè)且更優(yōu)選大約15至大約30個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列，這些核苷酸可與所擴(kuò)增出的HBV目標(biāo)雜交并含有SEQ ID No 13和SEQ ID No 14中的至少10個(gè)且優(yōu)選多于15個(gè)核苷酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中探針具有SEQ ID No 6和SEQID No 7的寡核苷酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中第二或反向引物為包含10至大約35個(gè)且更優(yōu)選大約15至大約30個(gè)核苷酸并含有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5中的至少10個(gè)且優(yōu)選多于15個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
19.具有選自從SEQ ID No 1至并包括SEQ ID No 14的核苷酸序列的寡核苷酸。
20.適合用于根據(jù)權(quán)利要求1擴(kuò)增HBV核酸的整套寡核苷酸引物，其含有根據(jù)權(quán)利要求14的啟動(dòng)子引物和根據(jù)權(quán)利要求18的反向引物。
21.適合根據(jù)權(quán)利要求1進(jìn)行HBV DNA的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增和檢測(cè)的測(cè)試試劑盒，其含有此處所描述的限制性?xún)?nèi)切酶；如此處所說(shuō)明的與所選限制性?xún)?nèi)切酶的切割位點(diǎn)相應(yīng)的正向引物，其和啟動(dòng)子序列、用于進(jìn)行基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)的其他試劑、用于檢測(cè)所擴(kuò)增出的HBVDNA的方法和使用說(shuō)明書(shū)一起提供。
全文摘要
本發(fā)明提供基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增目標(biāo)HBV核酸序列的方法，該方法從可選存在于樣品中的HBV DNA開(kāi)始，其包括下列步驟在擴(kuò)增緩沖液中溫育懷疑含有HBV的樣品，該溫育體系中含有一種或多種能夠在選擇出的限制位點(diǎn)切割HBV DNA的限制性?xún)?nèi)切酶，該限制性?xún)?nèi)切酶形成指定的此HBV DNA鏈的3′末端；該溫育體系中含有啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子引物具有包含被依賴(lài)DNA的RNA聚合酶所識(shí)別的啟動(dòng)子序列的5′區(qū)域和與指定的DNA鏈的3′末端互補(bǔ)的3′區(qū)域；該溫育體系中含有第二或反向引物，其具有與啟動(dòng)子引物相反的極性且含有該目標(biāo)序列的5′末端；且在HBV ssDNA作為目標(biāo)序列的情況下，該溫育體系中含有限制性引物；將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間，以進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶的消化；將如此獲得的樣品以一定的溫度和時(shí)間進(jìn)行加熱處理，該溫度和時(shí)間足以失活限制性?xún)?nèi)切酶和/或至少部分地導(dǎo)致雙鏈的單鏈化；向樣品中加入下列試劑，具有依賴(lài)RNA的DNA聚合酶活性的酶、具有依賴(lài)DNA的DNA聚合酶活性的酶、具有RNA酶H活性的酶、具有RNA聚合酶活性的酶；和將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間，以進(jìn)行擴(kuò)增。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1501983SQ02807389
公開(kāi)日2004年6月2日 申請(qǐng)日期2002年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月7日
發(fā)明者B·A·L·M·戴曼, I·M·弗蘭岑, A·M·W·斯特里杰普, B A L M 戴曼, W 斯特里杰普, 弗蘭岑 申請(qǐng)人:拜奧默里克斯有限公司