專利名稱：基于克魯斯假絲酵母的甘油生產工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種微生物發(fā)酵生產甘油技術領域的方法，具體是一種基于克魯斯假絲酵母的甘油生產工藝。
背景技術：
甘油，作為化學產品的重要副產品，又是其他化學產品的重要原料，主要用途有醫(yī)藥、化妝品、個人護理產品，香煙及食品。隨著我國國民經濟的不斷發(fā)展，作為國計民生重要化工產品的甘油市場需求量不斷增長，尤其是在食品、化妝品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的需求在逐年增加。因此，開發(fā)國內甘油的生產和應用，對我國社會的發(fā)展意義重大。甘油又名丙三醇，為無色粘稠液體，是重要的輕化工原料，用途很廣，常用于個人護理、牙膏、醫(yī)藥、化妝品、食品等品種中。目前甘油來源主要為制皂工業(yè)和生物柴油的副產物、化學合成甘油、發(fā)酵法生產甘油三方面。但由于制皂工業(yè)的萎縮，皂化甘油的產量也大幅度下降，且化學合成甘油由于工藝復雜，技術難度大及其應用范圍受限等因素制約其發(fā)展。隨著人民生活水平不斷的提高，各國對食品、日用品的安全限制和質量標準越來越高， 特別是幾年前美國“毒甘油”事件之后，全球都在致力于不斷的提高食品與藥品的質量和安全性。這種社會趨勢之下，發(fā)酵法生產甘油這種方法應該重新被人們認識和重視，發(fā)酵法生產甘油是以淀粉類物質作為原料，通過糖化后經微生物菌種發(fā)酵后提取制得。首先其原料來源廣泛、價格低廉，其次經微生物發(fā)酵生產過程中安全性比化學合成和皂化甘油更高，生產出的甘油產品應用面更廣，因此可以作為解決我國高品質甘油短缺狀況的一條重要的工藝路線。但近年來，發(fā)酵法生產的成品甘油質量普遍不高、且生產成本和污染較大，在市場中逐漸地失去了其應有的競爭力。主要為以下幾點首先，沒有穩(wěn)定的高產甘油菌株作為發(fā)酵生產的堅實基礎，現有發(fā)酵法生產甘油的菌種主要包括細菌、酵母、霉菌、原生動物和藻類等，已經被研究過的甘油生產菌株很多， 但酵母菌居多。亞硫酸鹽法發(fā)酵生產甘油的菌種為釀酒酵母S. cerevisiae，28°C發(fā)酵甘油轉化率為20% -25%，發(fā)酵液中亞硫酸鹽法含量高，使得甘油提取困難。堿性法發(fā)酵生產甘油使用的菌種為粉狀畢赤酵母Pichia farinosa，30°C發(fā)酵甘油轉化率38% -45%，發(fā)酵時間少于120h，發(fā)酵液中含鹽量多，影響甘油提取。耐高滲酵母法發(fā)酵生產甘油，耐高滲透壓假絲酵母發(fā)酵，甘油轉化率為40% -50%，發(fā)酵時間96h，發(fā)酵液中含鹽量少，利于甘油提取。除酵母菌之外，Rohr利用黑曲霉Aspergillus niger發(fā)酵甘油的轉化率僅為 6%。Neish報道枯草芽胞桿菌B. subtilis發(fā)酵生產甘油的轉化率為30%左右。Ben-Amotzl 報道利用藻類Dimalielle經光合作用藻內積累的甘油可達4. 4mol/L，但甘油很少向外分泌，生產角度并無優(yōu)勢。其次，甘油發(fā)酵過程中的較高能耗也一直是發(fā)酵法甘油成本居高不下的原因之一，主要表現在發(fā)酵過程中的動力系統(tǒng)和冷熱系統(tǒng)使用，動力系統(tǒng)包括壓縮空氣和攪拌系統(tǒng)的使用，發(fā)酵時間越長，動力系統(tǒng)的能耗越大。冷熱系統(tǒng)包括蒸汽和冷卻水的使用，發(fā)酵培養(yǎng)溫度要求越低，所使用的冷卻水越多，生產成本越高。再次，與其他甘油生產方法相比，發(fā)酵法生產的甘油發(fā)酵液中含有膠體物質、蛋白質、多糖及單糖等物質，使得減壓蒸餾過程中會出現嚴重結焦、變黑情況，成品甘油質量不高。其提取工藝一般是將成熟發(fā)酵液通過板框壓濾后，進行適當的濃縮得到粗甘油，進而減壓條件下進行蒸餾，脫色脫臭后得到成品甘油。此法得到的成品甘油質量一般只能達到工業(yè)甘油的質量標準。經過對現有技術的檢索發(fā)現，中國專利文獻號CN101658M3，
公開日2010_3_3，記載了一種用于調控牛羊圍產期能量代謝障礙的微生物飼料添加劑，該技術通過將無機硒源加入到菌劑生產培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中硒濃度為2 10mg/kg，將克魯斯假絲酵母、產朊假絲酵母和嗜熱鏈球菌種子液按13 1 2接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液與適量的玉米粉混合， 35 40°C烘干即得。但是該現有技術具有以下特點(1)在200g/L初糖的基礎上發(fā)酵后得甘油含量為67. 26g/L-71. 75g/L，發(fā)酵轉化率為34% -36%，糖甘轉化率較低，( 發(fā)酵培養(yǎng)溫度為 33°C，時間為120h，培養(yǎng)時間略顯較長，發(fā)酵過程中的水電成本較高，( 發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了 40g/L的NaCl，對提高甘油產量會有一定的幫助，但如需對甘油提純，則會嚴重影響甘油的提取收率，(4)此技術的最終產品并非成品甘油，發(fā)酵后甘油不需要提取，對甘油品質無要求。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現有技術存在的上述不足，提供一種基于克魯斯假絲酵母的甘油生產工藝，除提高發(fā)酵過程中甘油的轉化率及最終成品甘油的質量外，還可做到生產過程中節(jié)約能源消耗、減少污染物的排放，從而做到節(jié)能、減排地生產安全性更高的高品質甘油。本發(fā)明是通過以下技術方案實現的本發(fā)明涉及一種耐高溫的克魯斯假絲酵母菌株TS1008 (Candida krusei TS1008)，于2011年8月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No: M2011285。保藏地址為中國武漢大學430072。本發(fā)明涉及上述突變菌株的獲得方式，通過誘變與訓育方法的結合，經篩選得到。所述的誘變是指采用紫外燈照射進行誘變，具體步驟為將IOOmL種子培養(yǎng)基 /250mL三角瓶中，挑斜面培養(yǎng)基上保存的克魯斯假絲酵母菌1環(huán)，30-350C，90-120r/min培養(yǎng)16-20h，離心收集菌體，無菌生理鹽水洗滌數次，稀釋后備用，取4mL菌懸液，15-20W紫外燈功率，照射10-20s。所述的種子培養(yǎng)基的組分含量為葡萄糖30_45g/L，酵母10_16g/L，植物蛋白 12-22mL/L，余量為水，pH 4. 0-5. 5。所述的訓育是指將誘變后的菌懸液接入含400_500g/L葡萄糖和70_90g/L滲透劑的篩選培養(yǎng)基中，黑紙包皿，350C -45°C恒溫培養(yǎng)46-52h，重復3次。所述的篩選培養(yǎng)基的組分含量為400-500g/L葡萄糖或70_90g/L滲透劑，麥芽汁 200-300mL，瓊月旨 15_20g/L，余量為水，pH 5. 0-6. 5。所述的篩選是指挑選大菌落搖瓶發(fā)酵，測定生物量、糖甘轉化率、發(fā)酵時間以及殘?zhí)橇?，綜合篩選確定甘油高產突變菌株，用斜面培養(yǎng)基上進行菌種短期保藏。
4
所述的斜面培養(yǎng)基的組分含量為麥芽汁200_300mL/L，瓊脂15_20g/L，余量為水；本發(fā)明涉及上述耐高溫克魯斯假絲酵母突變菌株的甘油生產應用，通過將所述突變菌株好氧發(fā)酵得以實現。所述的好氧發(fā)酵是指通過培養(yǎng)突變菌株得到成熟發(fā)酵液后通過膜過濾系統(tǒng)逐級除去雜質，再使用反滲透進行脫水濃縮，得到粗甘油，經減壓蒸餾提取，脫味、脫色得到成品甘油。所述的培養(yǎng)是指將突變菌株接種于種子培養(yǎng)基中在35°C _45°C的環(huán)境下培養(yǎng) 16h得到種子液，然后轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中好氧發(fā)酵50-80h，得到成熟發(fā)酵液。所述的接種是指接種量8% -15% (ν/ν)。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分含量為葡萄糖200_400g/L，酵母6_12g/L，植物蛋白 200-300mL/L，余量為水，pH 4. 0-5. 5。所述的好氧發(fā)酵是指在20%-40%糖液濃度，通風比0. 5-l，35°C_45°C溫度下發(fā)酵 50-80h。所述的減壓蒸餾是指真空度為2mmHg-120mmHg的減壓蒸餾提取。本發(fā)明的有益效果主要體現在(1)本發(fā)明所使用菌種為耐高溫克魯斯假絲酵母 (Candidakrusei TS1008)，為獨立開發(fā)菌種，該菌種具有耐高溫、耐高滲透，在低糖的情況下對甘油的同化作用不強等優(yōu)良特性。(2)發(fā)酵工藝35°C _45°C溫度下發(fā)酵培養(yǎng)，不易發(fā)生染菌，發(fā)酵時間降低為50-80h，同時發(fā)酵過程有效的節(jié)約了用電量和冷卻水用量。成熟發(fā)酵液中甘油含量達到10%-16%，糖甘轉化率為45%-65%，殘?zhí)墙禐?.2%以下，甘油基本無同化現象出現。(3)后提取工段膜過濾濃縮過程無廢水排放，降低了環(huán)境成本；濃縮溫度為室溫，無化學反應，成熟發(fā)酵液殘?zhí)墙禐?.2%以下，減少了蒸餾結焦現象，對成品甘油品質有保障。成品甘油的質量符合美國和歐洲藥典級甘油標準(甘油含量不低于99.7%)， 較以往發(fā)酵法生產的甘油質量更高。


圖1傳代次數對TS1008生產甘油發(fā)酵性能的影響示意圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1 耐高溫克魯斯假絲酵母的獲得高產甘油突變菌株的篩選(1)菌懸液制備與誘變處理100mL種子培養(yǎng)基/250mL三角瓶中，挑斜面菌1環(huán)， 30-35 V，90-120r/min培養(yǎng)16_20h，離心收集菌體，無菌生理鹽水洗滌數次，稀釋后備用。 取4mL菌懸液，15-20W紫外燈功率，照射10_20s。(2)初篩與復篩將誘變后的菌懸液接入含400_500g/L葡萄糖和70_90g/L滲透劑的篩選培養(yǎng)基中，黑紙包皿，35°C _45°C恒溫培養(yǎng)46-52h，重復3次。挑選大菌落搖瓶發(fā)酵，測定生物量、糖甘轉化率、發(fā)酵時間以及殘?zhí)橇?，綜合篩選確定甘油高產突變菌株。(3)突變菌株的遺傳穩(wěn)定性對選擇出的突變株傳代10代，分別測定1、2、4、6、8、10代的糖甘轉化率、發(fā)酵時間以及殘?zhí)橇?，以確定其遺傳穩(wěn)定性。結果如圖1所示，Candida krusei TS1008的發(fā)酵性能
遺傳穩(wěn)定?？疾斐霭l(fā)菌株與突變菌株的生產甘油的發(fā)酵性能(糖甘轉化率、發(fā)酵時間及殘?zhí)橇?。結果如表1所示，突變株的產甘油能力要強于出發(fā)菌株，糖甘轉化率提高了 25%，且發(fā)酵時間大大降低，殘?zhí)橇恳步禐樾∮?. 5%。表1出發(fā)菌株與突變菌株發(fā)酵甘油性能比較
權利要求
1.一種克魯斯假絲酵母菌株TS1008 (Candida krusei TS1008)，其特征在于，于2011 年8月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No :M2011285。
2.一種根據權利要求1所述的耐高溫克魯斯假絲酵母菌株的制備方法，其特征在于， 通過誘變與訓育方法的結合，經篩選得到。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是，所述的誘變是指采用紫外燈照射進行誘變。
4.根據權利要求2或3所述的制備方法，其特征是，所述的誘變?yōu)閷OOmL種子培養(yǎng)基/250mL三角瓶中，挑斜面培養(yǎng)基上保存的克魯斯假絲酵母菌1環(huán)，30-350C，90-120r/min 培養(yǎng)16-20h，離心收集菌體，無菌生理鹽水洗滌數次，稀釋后備用，取4mL菌懸液，15-20W紫外燈功率，照射10-20s。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是，所述的訓育是指將誘變后的菌懸液接入含400-500g/L葡萄糖和70-90g/L滲透劑的篩選培養(yǎng)基中，黑紙包皿，35°C _45°C恒溫培養(yǎng)46-52h，重復3次。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征是，所述的篩選培養(yǎng)基的組分含量為 400-500g/L葡萄糖或70-90g/L滲透劑，麥芽汁200_300mL，瓊脂15_20g/L，余量為水，pH 5. 0-6. 5。
7.根據權利要求4所述的制備方法，其特征是，所述的種子培養(yǎng)基的組分含量為葡萄糖 30-45g/L，酵母 10-16g/L，植物蛋白 12_22mL/L，余量為水，pH 4. 0-5. 5。
8.根據權利要求4所述的制備方法，其特征是，所述的篩選培養(yǎng)基的組分含量為 400-500g/L葡萄糖或70-90g/L滲透劑，麥芽汁200_300mL，瓊脂15_20g/L，余量為水，pH 5. 0-6. 5。
9.根據權利要求4或5所述的制備方法，其特征是，所述的斜面培養(yǎng)基的組分含量為 麥芽汁200-300mL/L，瓊脂15_20g/L，余量為水。
10.一種根據上述任一權利要求所述耐高溫克魯斯假絲酵母突變菌株的應用，其特征在于，將該突變菌株用于甘油生產，通過將所述突變菌株好氧發(fā)酵得以實現。
11.根據權利要求10所述的應用，其特征是，所述的好氧發(fā)酵是指通過培養(yǎng)突變菌株得到成熟發(fā)酵液后通過膜過濾系統(tǒng)逐級除去雜質，再使用反滲透進行脫水濃縮，得到粗甘油，經減壓蒸餾提取，脫味、脫色得到成品甘油。
12.根據權利要求11所述的應用，其特征是，所述的培養(yǎng)是指將突變菌株接種于種子培養(yǎng)基中在35°C _45°C的環(huán)境下培養(yǎng)16h得到種子液，然后轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中好氧發(fā)酵 50-80h，得到成熟發(fā)酵液。
13.根據權利要求12所述的應用，其特征是，所述的接種是指接種量8%-15%(ν/ν) O
14.根據權利要求12所述的應用，其特征是，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分含量為葡萄糖 200-400g/L，酵母 6-12g/L，植物蛋白 200_300mL/L，余量為水，pH 4.0-5.5。
15.根據權利要求12所述的應用，其特征是，所述的好氧發(fā)酵是指在20%-40%糖液濃度，通風比0. 5-1, 350C _45°C溫度下發(fā)酵50_80h。
16.根據權利要求11所述的應用，其特征是，所述的減壓蒸餾是指真空度為 2mmHg-120mmHg的減壓蒸餾提取。
全文摘要
一種微生物甘油生產技術領域的基于克魯斯假絲酵母的甘油生產工藝，該克魯斯假絲酵母菌株TS1008(Candida krusei TS1008)于2011年8月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No.M2011285；本發(fā)明除提高發(fā)酵過程中甘油的轉化率及最終成品甘油的質量外，還可做到生產過程中節(jié)約能源消耗、減少污染物的排放，從而做到節(jié)能、減排地生產安全性更高的高品質甘油。
文檔編號C12N13/00GK102277307SQ20111025567
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權日2011年8月31日
發(fā)明者史其峰, 姜耀明 申請人:上海天源植物制品有限公司