促進(jìn)劑-dna組合疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種包含疫苗促進(jìn)劑和編碼用以引發(fā)抗原特異性抗體反應(yīng)的抗原的DNA構(gòu)建體的疫苗，其中所述疫苗促進(jìn)劑是Na/K泵抑制劑。相較于不含有所述疫苗促進(jìn)劑的其它疫苗，DNA進(jìn)入細(xì)胞得以加速。
【專利說(shuō)明】促進(jìn)劑-DNA組合疫苗
[0001]序列表
[0002]本申請(qǐng)含有已以ASCII格式提交且據(jù)此以引用的方式整體并入的序列表。于2011年9月22日創(chuàng)建的所述ASCII拷貝命名為VGXO127W.txt.。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及一種含有疫苗促進(jìn)劑和編碼抗原性肽的DNA的疫苗。所述疫苗可進(jìn)一步含有抗原性肽。
[0004]背景
[0005]許多疫苗依賴‘預(yù)測(cè)和產(chǎn)生(predict and produce) ’方法。舉例而言,流感疫苗是基于在流感季節(jié)期間最可能蔓延全球的病毒株的血凝素(hemagglutinin)和神經(jīng)氨酸苷酶(neuraminidase)序列而產(chǎn)生。然而，循環(huán)病毒的變化或其糖蛋白具有重大變化的大流行性病毒株的出現(xiàn)將致使所述疫苗無(wú)效。此外，當(dāng)前卵基流感疫苗(egg-based influenzavaccine)制造技術(shù)取決于流感病毒株在卵中復(fù)制的能力且會(huì)花費(fèi)至少6個(gè)月來(lái)制造足以用于季節(jié)性疫苗接種活動(dòng)的劑量。
[0006]當(dāng)前疫苗的生產(chǎn)能力據(jù)估計(jì)低于對(duì)目前全球人口接種疫苗所需的生產(chǎn)能力。此夕卜，疫苗(如DNA疫苗)已長(zhǎng)久遭受通過(guò)基于注射器的遞送對(duì)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染低效的缺點(diǎn)。因此，與用于增加疫苗劑量產(chǎn)生的手段有限相關(guān)的缺點(diǎn)以及缺乏用于增加疫苗轉(zhuǎn)染的新型技術(shù)已引起健康護(hù)理專業(yè)人員的關(guān)注。
[0007]不知如何增加DNA疫苗轉(zhuǎn)染。此外，不知如何設(shè)計(jì)用于抗原呈遞以使對(duì)適當(dāng)免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)最大化的抗原性表位或疫苗。更快且簡(jiǎn)化疫苗制造技術(shù)為流感和非流感相關(guān)疫苗策略所需以成為在未來(lái)大流行的情況下的可行解決方案。因此，對(duì)用于抗原基疫苗的更好抗原選擇和設(shè)計(jì)方法存在需要，所述方法可高效轉(zhuǎn)染宿主靶細(xì)胞且有效對(duì)抗各種疾病。
[0008]發(fā)明概述
[0009]本文提供一種包含疫苗促進(jìn)劑和編碼抗原性肽的DNA的疫苗。優(yōu)選地，疫苗促進(jìn)劑是Na/K泵抑制劑5- (N-乙基-N-異丙基_阿米洛利(amiloride) (EIPA)、苯扎明(benzamil)或阿米洛利，且更優(yōu)選是阿米洛利。疫苗也可含有抗原性肽。DNA可為環(huán)狀質(zhì)?；蜉d體，或它可為線性表達(dá)盒(LEC)。LEC可不具有磷酸骨架。疫苗可被電穿孔至有需要的受試者中。抗原可為例如M2、LACK、HBV、HIV、腫瘤相關(guān)抗原(TAA)、神經(jīng)氨酸苷酶、血凝素或其變體或其共有序列。DNA可包含啟動(dòng)子，如CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動(dòng)子或多角體蛋白(polyhedrin)啟動(dòng)子。LEC可為pcrNP或pcrM2。
[0010]本文也提供一種包括所述疫苗的疫苗接種試劑盒。所述試劑盒可進(jìn)一步包括電穿孔裝置。所述電穿孔裝置可為微創(chuàng)性電穿孔裝置。
[0011]本文也提供一種疫苗接種方法。所述方法可包括向有需要的受試者施用所述提供的疫苗。疫苗可通過(guò)電穿孔施用。電穿孔途徑可為皮內(nèi)或肌肉內(nèi)途徑。微創(chuàng)性電穿孔裝置可用于將疫苗電穿孔。
[0012]附圖簡(jiǎn)述
[0013]圖1.阿米洛利在體外加速質(zhì)粒進(jìn)入。在有或無(wú)ImM阿米洛利的情況下Cy5_pEGFP進(jìn)入細(xì)胞系被監(jiān)測(cè)為在第3天RAff264.7 (A, B、C)、JAffSII (D、E)和DC2.4(F、G)的2小時(shí)Cy5+%和EGFP+Cy5+%。添加 LipofactamineTM2000 (Lipo2000)作為陽(yáng)性對(duì)照。顯示的是具有類似結(jié)果的三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一。
[0014]圖2.阿米洛利在體內(nèi)加速質(zhì)粒進(jìn)入。在有或無(wú)阿米洛利的情況下，用Cy5_pEGFP在后足墊中皮下免疫首次接受試驗(yàn)的C57小鼠。在4小時(shí)之后，收集淋巴結(jié)以測(cè)試Cy5+細(xì)胞的比例⑶和亞型(C)。η = 3。B中的*，在所有組之間具有統(tǒng)計(jì)顯著性。
[0015]圖3.阿米洛利加速脂筏和胞膜窖依賴性質(zhì)粒進(jìn)入。脂筏抑制劑M β CD或胞膜窖抑制劑菲律賓菌素(fillipin)與阿米洛利一起添加來(lái)阻斷細(xì)胞系RAW264.7(A、B)、JAWSII (C、D)和DC2.4(E、F)的胞吞途徑。接著添加Cy5-pEGFP以測(cè)定2小時(shí)內(nèi)的進(jìn)入和3天內(nèi)的表達(dá)。顯示的是具有類似結(jié)果的三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一。
[0016]圖4.阿米洛利增強(qiáng)APC成熟和先天性細(xì)胞因子分泌。在有或無(wú)ImM阿米洛利的情況下將?ο μ g/ml PCD-S2添加至細(xì)胞培養(yǎng)物中以進(jìn)行刺激。在第3天測(cè)試RAW264.7 (A、B、C)、JAWSII (D、E)、DC2.4(F、G)、腹膜巨噬細(xì)胞(H、I)和脾DC(J、K)的表面成熟標(biāo)記物CD40、⑶80、⑶83、⑶86、MHC 1、MHC II以及分泌至上清液中的先天性細(xì)胞因子IL_6、TNF-α、IL-Ιβ、IFN-y。顯示的是具有類似結(jié)果的三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一。對(duì)于腹膜巨噬細(xì)胞和脾DC，n = 3。*和**，在+/-阿米洛利之間具有統(tǒng)計(jì)顯著性。
[0017]圖5.阿米洛利增強(qiáng)針對(duì)HBV S2的適應(yīng)性免疫。Α，免疫常規(guī)程序。B，抗S2IgG抗體滴度。C，在用Iyg sAg在后足墊中皮下再刺激24小時(shí)之后的延遲過(guò)敏(DTH)反應(yīng)。添加PBS作為陰性對(duì)照。*，在所有組之間具有統(tǒng)計(jì)顯著性。D和E，體外(D)和體內(nèi)(E)HBVS208-215特異性溶解，*，在+/_阿米洛利之間具有統(tǒng)計(jì)顯著性。F和G，體外(F)和體內(nèi)(G)HBVAlbl轉(zhuǎn)基因小鼠肝溶解。A-G, η = 3。
[0018]圖6.阿米洛利增加IFN- Y +穿孔素+粒酶B+⑶8Τ細(xì)胞的比例。來(lái)自pcD_S2+/-阿米洛利免疫的小鼠的脾細(xì)胞用10 μ g/ml S208-215體外再刺激12小時(shí)(A-C)或用10 μ g/ml sAg體外再刺激24小時(shí)(D)，接著進(jìn)行多色細(xì)胞內(nèi)染色。添加PMA和離子霉素作為陽(yáng)性對(duì)照。A，CD8T細(xì)胞中的IFN-Y、穿孔素或粒酶B陽(yáng)性細(xì)胞被計(jì)算為反應(yīng)性細(xì)胞。B，在+/-阿米洛利之間，反應(yīng)性⑶8T細(xì)胞中的細(xì)胞因子表達(dá)樣式。C，阿米洛利劑量對(duì)IFN- Y +穿孔素+粒酶B+細(xì)胞的比例的影響。D，響應(yīng)于sAg再刺激的IFN- Y +穿孔素+粒酶B+細(xì)胞的比例。E和F，與腹膜巨噬細(xì)胞(E)或脾DC(F)共培養(yǎng)，接著用S208-215再刺激，且染色的⑶8T細(xì)胞中的IFN-Y +穿孔素+粒酶B+。n>3。
[0019]圖7.盡管是IFN- Y -/-受損的CTL，但阿米洛利仍然增加雙陽(yáng)性細(xì)胞和CTL。特異性溶解被計(jì)算為體外(A)和體內(nèi)(B)S208-215涂布的初始脾細(xì)胞(靶細(xì)胞)對(duì)初始脾細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞)、或體外(C)和體內(nèi)(D)Albl肝細(xì)胞(靶細(xì)胞)對(duì)初始C57肝細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞)，其中WT或IFN- Y -/-小鼠用pcD-S2+/_阿米洛利免疫作為效應(yīng)CTL。計(jì)算所有組之間或+/-阿米洛利之間的差異。η = 3。E，WT與IFN- Y -/-之間的反應(yīng)性⑶8T細(xì)胞比例。F，在S208-215再刺激之后的IFN-Y-/-小鼠細(xì)胞因子樣式。G，在HBsAg再刺激之后的穿孔素+粒酶B+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例。η = 3。
[0020]圖8.顯示編碼流感核蛋白(“NP”)和M2抗原的質(zhì)粒表達(dá)載體以及相應(yīng)線性表達(dá)盒的圖。線性表達(dá)盒pcrNP或pcrM2含有CMV啟動(dòng)子、用于拼接的內(nèi)含子、具有終止密碼子和聚腺苷酸化信號(hào)的NP或M2的全長(zhǎng)基因。
[0021]詳述
[0022]本
【發(fā)明者】已驚人地發(fā)現(xiàn)基于促進(jìn)劑的DNA疫苗可向有需要的受試者高效遞送抗原以實(shí)現(xiàn)免疫刺激?？赏ㄟ^(guò)施用疫苗促進(jìn)劑與編碼抗原的DNA的組合來(lái)使受試者的免疫系統(tǒng)針對(duì)特定抗原而加以高效誘導(dǎo)。優(yōu)選地，疫苗促進(jìn)劑是Na/K泵抑制劑5- (N-乙基-N-異丙基_阿米洛利(EIPA)、苯扎明或阿米洛利，且更優(yōu)選是阿米洛利?？珊芯幋a抗原的環(huán)狀質(zhì)?；蚓€性核酸的DNA疫苗在高效遞送至受試者中時(shí)可引發(fā)抗原特異性抗體反應(yīng)，相較于基于質(zhì)粒的疫苗，所述反應(yīng)可維持更長(zhǎng)時(shí)期。疫苗可進(jìn)一步含有可為肽的抗原。
[0023]本文所述的疫苗可向受試者施用以提供由受試者群體良好耐受的較長(zhǎng)久持續(xù)的抗原特異性免疫反應(yīng)。本發(fā)明也涉及可自DNA表達(dá)的許多抗原。
[0024]1.定義
[0025]本文所用的術(shù)語(yǔ)僅是出于描述特定實(shí)施方案的目的而并不旨在限制。如在說(shuō)明書和隨附權(quán)利要求中所用，除非上下文另外明確規(guī)定，否則單數(shù)形式“一個(gè)(a/an)”和“所述(the) ”包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物。
[0026]a.共有或共有序列
[0027]如本文所用的“共有”或“共有序列”可指基于對(duì)特定抗原的多個(gè)亞型的比對(duì)的分析而構(gòu)建的合成核酸序列或相應(yīng)多肽序列。序列可用于誘導(dǎo)針對(duì)特定抗原的多個(gè)亞型或血清型的廣泛免疫性。合成抗原，如融合蛋白，可操作為共有序列(或共有抗原)。
[0028]b.變體
[0029]如本文所用的“變體”可指因氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列方面不同，但保留至少一種生物活性的肽或多肽?！吧锘钚浴钡拇硇詫?shí)例包括由特異性抗體結(jié)合的能力或促進(jìn)免疫反應(yīng)的能力。變體也可指氨基酸序列大致上與具有某一氨基酸序列的參照蛋白相同的保留至少一種生物活性的蛋白質(zhì)。氨基酸的保守性取代，即，用具有類似性質(zhì)(例如，親水性、帶電區(qū)域的程度和分布)的不同氨基酸置換某一氨基酸，在本領(lǐng)域中被認(rèn)為通常涉及微小變化。這些微小變化可部分地通過(guò)考慮如本領(lǐng)域中所了解的氨基酸的親疏水性指數(shù)來(lái)鑒定。Kyte等，J.Mol.B1l.157:105-132 (1982)。氨基酸的親疏水性指數(shù)是基于對(duì)它的疏水性和電荷的考慮。本領(lǐng)域已知的是具有類似親疏水性指數(shù)的氨基酸可被取代且仍然保留蛋白質(zhì)功能。在一個(gè)方面，親疏水性指數(shù)為土 2的氨基酸被取代。氨基酸的親水性也可用于揭示將產(chǎn)生保留生物功能的蛋白質(zhì)的取代。在肽的情形下考慮氨基酸的親水性允許計(jì)算該肽的最大局部平均親水性，這是已報(bào)道與抗原性和免疫原性良好關(guān)聯(lián)的適用度量。美國(guó)專利號(hào)4，554，101以引用的方式完全并入本文。如本領(lǐng)域中所了解，取代具有類似親水性值的氨基酸可產(chǎn)生保留生物活性，例如免疫原性的肽?？捎糜H水性值在彼此的土2內(nèi)的氨基酸進(jìn)行取代。氨基酸的疏水性指數(shù)與親水性值兩者均受該氨基酸的特定側(cè)鏈影響。與那個(gè)觀察一致的是，可與生物功能相容的氨基酸取代被理解為取決于所述氨基酸的相對(duì)類似性，且特別是那些氨基酸的側(cè)鏈的相對(duì)類似性，如通過(guò)疏水性、親水性、電荷、大小及其它性質(zhì)所揭示。
[0030]關(guān)于對(duì)本文數(shù)值范圍的敘述，明確涵蓋在其之間的具有相同精度的各插入數(shù)值。舉例而言，對(duì)于范圍6-9，除6和9之外也涵蓋數(shù)值7和8，且對(duì)于范圍6.0-7.0,明確涵蓋數(shù)值 6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9 和 7.0。
[0031]2.疫苗
[0032]本文提供包含疫苗促進(jìn)劑和編碼抗原的DNA的疫苗。優(yōu)選地，疫苗促進(jìn)劑是Na/K泵抑制劑5- (N-乙基-N-異丙基_阿米洛利(EIPA)、苯扎明或阿米洛利，且更優(yōu)選是阿米洛利。靶細(xì)胞由DNA高效轉(zhuǎn)導(dǎo)，借此疫苗誘導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)。疫苗可進(jìn)一步包含呈肽形式的抗原。
[0033]a.鈉(Na) /鉀(K)泵抑制劑_
[0034]本文提供一種在體外和在體內(nèi)促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞中的化合物。該化合物可為鈉(Na)/鉀⑷泵抑制劑。Na/K泵抑制劑化合物可為3，4 二氯苯扎明鹽酸鹽、3，4，5，6-四羥基氧雜蒽酮(3,4, 5，6-tetrahydroxxanthone)、巴伐洛霉素(bafilomycin)、布美他尼(bumetanide)、刀豆素 A(concanamycin A)、二氫烏本箭毒苷(dihydroouabain)、埃索美拉唑(esomeprazole)、呋塞米(furosemide)、蘭素拉唑(lansoprazole)、奧美拉唑(omeprazole)、烏本箭毒苷八水合物(ouabain octahydrate)、泮托拉唑鈉(pantoprazolesodium)、鹽酸丙胺卡因(prilocaine hydrochloride)、氯化血根喊(sanguinarinechloride)、甜菊苷水合物(stev1side hydrate)、托塞米(torsemide)、5_ (N-乙基-N-異丙基_阿米洛利(EIPA)、苯扎明或阿米洛利。優(yōu)選地，疫苗促進(jìn)劑是5-(N-乙基-N-異丙基_阿米洛利(EIPA)、苯扎明或阿米洛利，且更優(yōu)選是阿米洛利。化合物可為阿米洛利，其常用于管理高血壓和充血性心臟衰竭。阿米洛利具有以下結(jié)構(gòu):
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種能夠引發(fā)針對(duì)所需癌癥或感染性疾病的免疫反應(yīng)的疫苗制劑，所述制劑包含疫苗促進(jìn)劑和編碼抗原性肽的DNA，其中所述疫苗促進(jìn)劑是Na/K泵抑制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗促進(jìn)劑是包括5-(N-乙基-N-異丙基_阿米洛利(EIPA)、苯扎明或阿米洛利。
3.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗促進(jìn)劑是阿米洛利。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的疫苗，所述疫苗進(jìn)一步包含所述抗原性肽。
5.如權(quán)利要求4所述的疫苗，其中所述DNA是環(huán)狀質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求4所述的疫苗，其中所述DNA是線性表達(dá)盒。
7.如權(quán)利要求6所述的疫苗，其中所述線性表達(dá)盒不具有磷酸骨架。
8.如權(quán)利要求5至6中任一項(xiàng)所述的疫苗，其中所述疫苗能夠被電穿孔至有需要的受試者中。
9.如權(quán)利要求5至6中任一項(xiàng)所述的疫苗，其中所述抗原選自由以下組成的組:M2、LACK、HBV、神經(jīng)氨酸苷酶、血凝素、其變體及其共有序列。
10.如權(quán)利要求5至6中任一項(xiàng)所述的疫苗，其中所述DNA進(jìn)一步包含選自由以下組成的組的啟動(dòng)子:CMV、SV40早期啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒啟動(dòng)子和多角體蛋白啟動(dòng)子。
11.如權(quán)利要求6所述的疫苗,其中所述線性表達(dá)盒選自由pcrNP和pcrM2組成的組。
12.—種疫苗接種試劑盒，所述試劑盒包括如權(quán)利要求5至6中任一項(xiàng)所述的疫苗。
13.如權(quán)利要求12所述的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包括電穿孔裝置。
14.如權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中所述電穿孔裝置是微創(chuàng)性電穿孔裝置。
15.—種疫苗接種方法,所述方法包括向有需要的受試者施用如權(quán)利要求5至6中任一項(xiàng)所述的疫苗。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述疫苗是通過(guò)電穿孔來(lái)施用。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述電穿孔途徑選自由皮內(nèi)途徑和肌肉內(nèi)途徑組成的組。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述疫苗是用微創(chuàng)性電穿孔裝置來(lái)電穿孔。
【文檔編號(hào)】C12N15/51GK104168912SQ201180074728
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月10日
【發(fā)明者】王賓, 耿爽 申請(qǐng)人:北京艾棣維欣生物技術(shù)有限公司