專利名稱：一種生產(chǎn)l-乳酸的方法及其專用芽孢桿菌屬菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種生產(chǎn)L-乳酸的方法及其專用芽孢桿菌屬菌株。
背景技術(shù)：
乳酸(Lactic acid)又名二羥基丙酸，是世界三大有機(jī)酸之一。作為一種傳統(tǒng)的多用途精細(xì)化學(xué)品，乳酸可作為酸味劑、芳香劑、防腐劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、生物可降解性材料、藥物和農(nóng)藥等，應(yīng)用于食品、制藥、釀造、制革、紡織、環(huán)保和農(nóng)業(yè)中。乳酸是一種手性分子，可分為L(zhǎng)-乳酸、D-乳酸和DL-乳酸。L-乳酸是生產(chǎn)聚L-乳酸的原料。利用L-乳酸聚合產(chǎn)生的聚L-乳酸，以其良好的生物可降解性和優(yōu)良的使用特性，被公認(rèn)為是取代傳統(tǒng)塑料的理想的生物可降解塑料之一。L-乳酸的光學(xué)純度對(duì)于聚L-乳酸的合成至關(guān)重要，聚DL-乳酸是以一種無定形態(tài)存在而不能得到工業(yè)應(yīng)用。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品安全性高，而且能專一性的得到光學(xué)純?nèi)樗?，是大?guī)模生產(chǎn)乳酸的主要方法。目前主要應(yīng)用的發(fā)酵菌株為乳酸細(xì)菌以及一些真菌。乳酸發(fā)酵過程中，由于不斷生產(chǎn)產(chǎn)物而使發(fā)酵液的酸度逐漸上升，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸都受到嚴(yán)重的抑制，為此要加入碳酸鈣等中和劑進(jìn)行中和。在乳酸的提取和純化過程中，要加入硫酸對(duì)乳酸鈣進(jìn)行酸化，從而生成乳酸和不溶性的硫酸鈣。目前，每生產(chǎn)一頓乳酸就會(huì)產(chǎn)生一頓的乳酸鈣廢棄物。碳酸鈣作為中和劑的發(fā)酵工藝增加了分離提取的困難，而且影響產(chǎn)品質(zhì)量，并且造成嚴(yán)重的環(huán)境問題和經(jīng)濟(jì)浪費(fèi)。在離子交換技術(shù)與膜技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的電滲析法是一種乳酸提取純化新工藝。該工藝降低了勞動(dòng)強(qiáng)度，更重要的是避免了碳酸鈣的生成，減少了環(huán)境污染。在下游的乳酸提取純化過程中，商業(yè)化的雙極性電滲析膜可以使水電離出的H+和0H_分別與乳酸根和金屬陽(yáng)離子結(jié)合，生成乳酸和堿，堿可被重復(fù)利用。但是，這種雙極性的膜對(duì)二價(jià)離子如Ca2+和Mg2+不耐受，因?yàn)槎r(jià)離子會(huì)形成不可溶的堿從而破壞電滲析膜結(jié)構(gòu)。為了利用這種環(huán)保節(jié)能的新技術(shù)，乳酸發(fā)酵過程中需要用一價(jià)離子的堿性物質(zhì)作為中和劑，而NaOH就是這樣一種理想的中和劑。事實(shí)上，電滲析技術(shù)研究過程中，都是以NaOH與乳酸中和的產(chǎn)物乳酸鈉作為研究對(duì)象的。但是鑒于Na+對(duì)菌株的毒性，目前國(guó)內(nèi)外利用NaOH作為中和劑進(jìn)行的L-乳酸發(fā)酵都未能達(dá)到理想的效果。嗜堿微生物是一類最適pH在9.0以上的微生物類群。嗜堿菌除了能適應(yīng)堿性環(huán)境外，對(duì)鹽環(huán)境尤其是一價(jià)鹽離子環(huán)境具有很好的耐受性。這樣的生理性質(zhì)可以降低乳酸發(fā)酵過程中的污染機(jī)率。更重要的是，對(duì)于嗜堿乳酸菌來說，NaOH可以代替CaCOJt為中和劑來維持發(fā)酵過程中的pH，從而 避免產(chǎn)生不溶性鈣鹽。鑒于在乳酸發(fā)酵方面的這些優(yōu)勢(shì)，嗜堿菌被認(rèn)為是乳酸發(fā)酵方面的優(yōu)秀潛力菌株。目前，中國(guó)專利中沒有涉及以嗜堿菌作為L(zhǎng)-乳酸發(fā)酵菌株的報(bào)道。國(guó)外只有一篇利用嗜堿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的報(bào)道(Calabia et al., Biotechnol.Lett.,2011,33:1429-1433)，但是該報(bào)道中，L-乳酸產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度分別只有65.8克/升，83%和98.8%，達(dá)不到工業(yè)化要求。申請(qǐng)?zhí)枮?00510119041.3的中國(guó)專利公開了一種采用中性菌干釀乳桿菌改組菌株(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)_Lc_F34 發(fā)酵生產(chǎn) L-乳酸的方法，該菌株以葡萄糖和酵母抽提物為發(fā)酵基質(zhì)，搖瓶補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，產(chǎn)生177.6克/升的乳酸；以玉米漿和葡萄糖為發(fā)酵基質(zhì)，30升發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，產(chǎn)生154.6克/升的L-乳酸。L-乳酸的生產(chǎn)成本是制約L-乳酸應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。因此，尋找能夠低成本生產(chǎn)L-乳酸的技術(shù)成為研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供芽孢桿菌屬菌株(Bacillus Sp.)WL_S20。本發(fā)明提供的芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.) WL-S20，其保藏號(hào)為CGMCCN0.5634。上述的芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL_S20 CGMCC N0.5634在制備L-乳酸中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)L-乳酸的方法。本發(fā)明提供的方法，是發(fā)酵芽孢桿菌屬菌株(BaciIIus sp.) WL-S20 CGMCCN0.5634，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到L-乳酸。在上述方法中，所述發(fā)酵用的發(fā)酵培養(yǎng)基按照如下方法制備:將碳源、氮源、MgSO4.7H20、K2HPO4.3H20、CH3COONa、MnSO4.H2O 和水混合，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；所述碳源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為60克/升-150克/升，所述氮源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為10克/升-50克/升，所述MgSO4.7H20在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O克/升-0.4克/升，K2HPO4.3H20在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O克/升-4克/升，CH3COONa在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O克/升-5克/升，MnSO4 -H2O在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O克/升-0.06g克/升；所述MgSO4.7H20、所述K2HPO4.3H20、所述CH3C00Na、所述MnSO4.H2O在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度均不為O克/升。在上述方法中，所述碳源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為80克/升-130克/升；所述氮源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20克/升；所述碳源具體為葡萄糖(初糖)，所述氮源具體為花生柏。在上述方法中，在所述發(fā)酵前還包括將所述發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行如下處理的步驟:向所述發(fā)酵培養(yǎng)基加入終濃度為0.10克/升-0.30克/升的中性蛋白酶在pH7.0、45°C條件下預(yù)處理6小時(shí)-10小時(shí)。在上述方法中，所述發(fā)酵的pH為9.0-10.0，所述調(diào)節(jié)發(fā)酵pH的中和劑為IOM的NaOH水溶液；所述發(fā)酵的溫度為35°C _45°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為112小時(shí)-216小時(shí)。在上述方法中，所述發(fā)酵的通氣條件為前12小時(shí)以0.5升/分鐘通氣，然后停止通氣直到發(fā)酵結(jié)束。在上述方法中，所述發(fā)酵采用的攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)半徑為48mm。在上述方法中， 所述發(fā)酵采用補(bǔ)加葡萄糖水溶液的方式保持發(fā)酵的體系中葡萄糖濃度不低于20-50克/升；所述葡萄糖水溶液的濃度為800-1000克/升。
上述補(bǔ)加葡萄糖水溶液的補(bǔ)料方式:可采用多次脈沖補(bǔ)料方式，也可采用單次脈沖補(bǔ)料方式。多次脈沖補(bǔ)料方式具體為，初始葡萄糖濃度為60-100克/升，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖的濃度低于20克/升時(shí)，則一次加入800-1000克/升葡萄糖溶液40-60ml，在整個(gè)發(fā)酵過程中，需要多次補(bǔ)料操作。單次脈沖補(bǔ)料方式具體為，發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖初始濃度為100-150克/升，在發(fā)酵過程中，當(dāng)葡萄糖濃度低于50克/升時(shí)，一次性加入800-1000克/升葡萄糖溶液100-130ml，只需一次補(bǔ)料操作。因此上述菌株WL-S20為芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)，已于2011年12月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱06110:，地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCCN0.5634，其分類命名為芽孢桿菌Bacillus sp.。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了一株芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL-S20 CGMCC N0.5634，其可以用來生產(chǎn)L-乳酸，以葡萄糖為底物，在45 °C條件下以98.6% -99.3%的轉(zhuǎn)化率高效發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純度將近100%的L-乳酸，其中L-乳酸濃度最高可達(dá)225克/升。另外，本發(fā)明利用芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL_S20 CGMCCN0.5634生產(chǎn)L-乳酸，以花生柏為氮源，降低了發(fā)酵成本，以NaOH作為中和劑，可以簡(jiǎn)化后期處理過程且減少環(huán)境污染。


圖1為芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.) WL-S20 CGMCC N0.5634發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸發(fā)酵過程曲線。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL_S20的分離、鑒定1、WL-S20 的分離篩選培養(yǎng)基(克/升):葡萄糖10.0，酵母粉5.0，聚蛋白胨5.0，Κ2ΗΡ04.3Η20 1.0,MgSO4.7Η20 0.2，NaCl 50，蒸餾水900ml，115°C高溫滅菌20分鐘后加入高溫滅菌的10%(w/v) Na2CO3 100ml。固體培養(yǎng)基則還需加入0.1-0.2克/升瓊脂。從內(nèi)蒙古鄂爾多斯鹽堿湖湖邊取得泥樣。稱取5g泥樣于250ml三角瓶中，加入IOOml篩選培養(yǎng)基，充分混勻后用篩選培養(yǎng)基稀釋10，000倍涂布于固體篩選培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)3天，將長(zhǎng)出的單菌落接種入裝有4ml篩選培養(yǎng)基的試管，在37°C條件下靜置培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，取發(fā)酵液，6，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心半徑為36mm，離心5分鐘，取上清液。測(cè)定上清液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和L-乳酸的光學(xué)純度。得到一株L-乳酸產(chǎn)量較高、L-乳酸光學(xué)純度接近100%、轉(zhuǎn)化率在95%以上的菌株，即WL-S20。檢測(cè)方法如下:葡萄糖的測(cè)定方法為將上述上清液用去離子水稀釋100-500倍，采用生物傳感分析儀SBA-40E(山東省科學(xué)院生物研究所)測(cè)定。

L-乳酸濃度的測(cè)定方法為，將上述I得到的上清液用去離子水稀釋100-500倍，采用生物傳感分析儀SBA-40E(山東省科學(xué)院生物研究所)測(cè)定。
生物傳感分析儀SBA-40E是以固定化酶為傳感器的分析儀器，L-乳酸與氧氣、水在L-乳酸氧化酶的催化下生成丙酮酸和雙氧水，葡萄糖與氧氣、水在葡萄糖氧化酶的催化下生成葡萄糖酸和雙氧水。反應(yīng)放出的雙氧水與白金一銀電極接觸，并產(chǎn)生電流信號(hào)，該電流信號(hào)與葡萄糖或L-乳酸濃度成線性比例關(guān)系，通過測(cè)定電流信號(hào)強(qiáng)度可得出葡萄糖或L-乳酸濃度。L-乳酸純度采用Agillent 1100液相色譜分析儀(安捷倫科技有限公司)測(cè)定，MCI GEL CRSlOW手性分析柱，二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流動(dòng)相5mM CuSO4，流速
0.5ml/分鐘，柱溫25°C，進(jìn)樣量10μ I。L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，貨號(hào)為L(zhǎng)1750。D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，貨號(hào)為貨號(hào)為L(zhǎng)0625。L-乳酸光學(xué)純度計(jì)算方法:L-乳酸光學(xué)純度(％) =L-乳酸濃度(克/升)/[L-乳酸濃度(克/升)+D-乳酸濃度(克/升)]X 100%轉(zhuǎn)化率計(jì)算方法:轉(zhuǎn)化率(％ ) = L-乳酸濃度(克/升)/葡萄糖消耗量(克/升)X 100%2、WL_S20的生理生化鑒定將WL-S20菌株在上述I中所述的固體篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-2天，觀察菌落形態(tài)，并用相差顯微鏡(ZESSI)觀察菌體形態(tài)。分別以20克/升葡萄糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和淀粉為碳源，培養(yǎng)基其他成分相同，為I克/升酵母粉、3克/升多聚蛋白胨、I 克 / 升 K2HPO4.3Η20、0.2 克 / 升 MgSO4.7Η20、0.005 克 / 升 MnSO4.H20,5 克/升CH3COONa和50克/升NaCl，以10%體積比的接種量接種于裝有IOOml上述培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在45°C條件下靜置培養(yǎng)12h。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，取發(fā)酵液，6，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心半徑為36mm，離心5分鐘，取上清液，測(cè)定L-乳酸的濃度。測(cè)定方法與上述I中相同。結(jié)果如下:WL_S20菌落形態(tài)無規(guī)則，邊緣不齊，表面干燥。細(xì)胞為桿狀，產(chǎn)內(nèi)生芽孢。WL-S20菌株可利用葡萄糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、蔗糖和麥芽糖為碳源產(chǎn)生乳酸，產(chǎn)量分別為18.3克/升、13.7克/升、14.7克/升、8.0克/升、8.7克/升、18.0克/升和9克/升，WL-S20菌株不能利用乳糖和淀粉作為碳源產(chǎn)生乳酸。上述菌株WL-S20初步鑒定為芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)，已于2011年12月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCCN0.5634，其分類命名為芽孢桿菌Bacillus sp.。實(shí)施例2、芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL_S20 CGMCC N0.5634的應(yīng)用方法一:1、發(fā)酵該實(shí)施例 中所用的培養(yǎng)基的組成如下:種子培養(yǎng)基(克/升):葡萄糖10.0，酵母粉5.0，聚蛋白胨5.0，Κ2ΗΡ04.3Η20 1.0,MgSO4.7Η20 0.2，NaCl 50，蒸餾水900ml，115°C高溫滅菌20分鐘后加入高溫滅菌的10%(w/V) Na2CO3IOOml。發(fā)酵培養(yǎng)基(克/升):葡萄糖80，花生柏(北京康明威培養(yǎng)基技術(shù)有限責(zé)任公司)20, MgSO4.7H20 0.35，K2HPO4.3H20 2，CH3COONa 1，MnSO4.H2O 0.03。115°C條件下滅菌20分鐘。
本發(fā)明發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟:I)、活化培養(yǎng):將保存的芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL-S20 CGMCC N0.5634甘油菌液以體積比為4%接種量接種入裝液量為4ml的試管往復(fù)式搖床，200轉(zhuǎn)/分鐘，溫度37°C，培養(yǎng)12小時(shí)；2)、種子培養(yǎng):將步驟I)的液體培養(yǎng)物，在無菌條件下接種于裝有IOOml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，40°C靜置培養(yǎng)8小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；3)、發(fā)酵培養(yǎng):瑞士 Infors HT公司Multifors 1.4升發(fā)酵罐中加入700ml發(fā)酵培養(yǎng)基，以0.15克/升的終濃度加入過濾滅菌的中性蛋白酶(EC 3.4.24.28)，在pH7.0，45°C條件下處理花生柏8h。以10% (體積比)接種量接入上述種子液，發(fā)酵過程中，當(dāng)發(fā)酵液葡萄糖濃度低于20克/升時(shí)，補(bǔ)加50ml 800克/升的葡萄糖一次，整個(gè)過程共補(bǔ)加4次。前12小時(shí)通氣0.5升/分鐘，然后停止通氣直到發(fā)酵結(jié)束，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)半徑為48mm。利用IOM NaOH維持恒定pH9.0，45°C培養(yǎng)216小時(shí)結(jié)束發(fā)酵。每 隔4小時(shí)取一次發(fā)酵液，6，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心半徑為36mm，離心5分鐘，取上清液。2、檢測(cè)檢測(cè)方法與實(shí)施例1中所述相同。實(shí)驗(yàn)共設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖1A所示，上述I最終得到的發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為O克/升，L-乳酸濃度225克/升，轉(zhuǎn)化率99.3%, L-乳酸光學(xué)純度100% (未檢測(cè)出D-乳酸)。方法二、1、發(fā)酵該實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下:種子培養(yǎng)基同方法一。發(fā)酵培養(yǎng)基(克/ 升):葡萄糖 130，花生柏 20，MgSO4.7H20 0.35，K2HPO4.3H202，CH3COONa I, MnSO4.H2O 0.03。115°C條件下滅菌 20 分鐘。本發(fā)明發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟:I)活化培養(yǎng):同方法一；2)種子培養(yǎng):同方法一；3)發(fā)酵培養(yǎng):瑞士 Infors HT公司Multifors 1.4升發(fā)酵罐中加入700ml發(fā)酵培養(yǎng)基，以0.15克/升的終濃度加入過濾滅菌的中性蛋白酶(EC 3.4.24.28)，在pH7.0，45°C條件下處理花生柏8h。以10% (體積比)接種量接入上述種子液，發(fā)酵過程中，當(dāng)發(fā)酵液葡萄糖濃度低于50克/升時(shí)，補(bǔ)加IOOml 800克/升的葡萄糖一次，整個(gè)過程只補(bǔ)加I次。前12小時(shí)通氣0.5升/分鐘，然后停止通氣直到發(fā)酵結(jié)束，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘。利用IOMNaOH維持恒定pH9.0，45°C培養(yǎng)112小時(shí)結(jié)束發(fā)酵。每隔4小時(shí)取一次發(fā)酵液，6，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心半徑為36mm，離心5分鐘，取上清液。2、檢測(cè)檢測(cè)方法與實(shí)施例1中所述相同。實(shí)驗(yàn)共設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖1B所示，上述I最終得到的發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為O克/升，L-乳酸濃度180克/升，轉(zhuǎn)化率98.6%, L-乳酸光學(xué)純度100% (未檢測(cè)出D-乳酸)。
權(quán)利要求
1.芽孢桿菌屬菌株(Bacillussp.)WL_S20，其保藏號(hào)為CGMCC N0.5634
2.權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌屬菌株(Bacillussp.)WL_S20 CGMCC N.5634在制備L-乳酸中的應(yīng)用。
3.一種生產(chǎn)L-乳酸的方法，是發(fā)酵芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL_S20 CGMCCN0.5634，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到L-乳酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于: 所述發(fā)酵用的發(fā)酵培養(yǎng)基按照如下方法制備:將碳源、氮源、MgSO4.7Η20、K2HPO4.3Η20、CH3COONa、MnSO4.H2O和水混合，得到發(fā)酵培養(yǎng)基； 所述碳源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為60克/升-150克/升，所述氮源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為10克/升-50克/升，所述MgSO4.7Η20在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O克/升-0.4克/升，K2HPO4.3Η20在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O克/升-4克/升，CH3COONa在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O克/升-5克/升，MnSO4 -H2O在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O克/升-0.06g克/升；所述MgSO4.7H20、所述K2HPO4.3H20、所述CH3C00Na、所述MnSO4.H2O在所述發(fā) 酵培養(yǎng)基中的濃度均不為O克/升。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于: 所述碳源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為80克/升-130克/升； 所述氮源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20克/升； 所述碳源具體為葡萄糖，所述氮源具體為花生柏。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于: 在所述發(fā)酵前還包括將所述發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行如下處理的步驟:向所述發(fā)酵培養(yǎng)基加入終濃度為0.10克/升-0.30克/升的中性蛋白酶在pH7.0、45°C條件下預(yù)處理6小時(shí)-10小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的方法,其特征在于: 所述發(fā)酵的PH為9.0-10.0，所述調(diào)節(jié)發(fā)酵pH的中和劑為IOM的NaOH水溶液； 所述發(fā)酵的溫度為35°C _45°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為112小時(shí)-216小時(shí)。
所述發(fā)酵的通氣條件為前12小時(shí)以0.5升/分鐘通氣，然后停止通氣直到發(fā)酵結(jié)束。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵采用的攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，所述發(fā)酵的旋轉(zhuǎn)半徑為48mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求3-8中任一所述的方法，其特征在于: 所述發(fā)酵采用補(bǔ)加葡萄糖水溶液的方式保持發(fā)酵的體系中葡萄糖濃度不低于20-50克/升； 所述葡萄糖水溶液的濃度為800-1000克/升。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)L-乳酸的方法及其專用芽孢桿菌屬菌株。本發(fā)明所提供的芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL-S20，其保藏號(hào)為CGMCC NO.5634。上述的芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL-S20 CGMCC NO.5634在制備L-乳酸中的應(yīng)用。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了一株芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL-S20 CGMCC NO.5634，其可以用來生產(chǎn)L-乳酸，以葡萄糖為底物，在45℃條件下以98.6％-99.3％的轉(zhuǎn)化率高效發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純度將近100％的L-乳酸，其中L-乳酸濃度最高可達(dá)225克/升。
文檔編號(hào)C12P7/56GK103194402SQ201210004678
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者馬延和, 孟瑩, 薛燕芬, 于波 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所