專利名稱：家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種家蠶質(zhì)型多角體病毒(BmCPV)熒光定量PCR檢測(cè)方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
家香質(zhì)型多角體病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus, BmCPV) 屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)，是危害養(yǎng)蠶業(yè)的主要病原物之一，給生產(chǎn)上造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。BmCPV病毒粒子直徑約為50-65nm，形狀呈正二十面體，具有獨(dú)特的單層衣殼結(jié)構(gòu)。 基因組由10節(jié)段雙鏈RNA分子組成，目前把質(zhì)型多角體病毒按照電泳遷移率的不同分成14 個(gè)電泳型，BmCPV屬I型。其宿主域主要是鱗翅目，雙翅目，膜翅目和鞘翅目等昆蟲。BmCPV 專一性感染家蠶中腸上皮細(xì)胞，感染了 BmCPV的家蠶中腸上皮細(xì)胞的主要細(xì)胞器均發(fā)生顯著病變。家蠶表現(xiàn)為發(fā)育不良、體形瘦弱、行動(dòng)呆滯。隨著病程的推進(jìn)，在中腸后部可看到白色的褶皺，這是家蠶質(zhì)型多角體病的典型病癥之一。中腸乳白色的病變是家蠶質(zhì)型多角體病肉眼診斷的重要依據(jù)之一。目前對(duì)家蠶質(zhì)型多角體病的防治尚未取得突破性進(jìn)展，生產(chǎn)上主要以預(yù)防為主。 家蠶病毒病的診斷技術(shù)相對(duì)落后，主要通過(guò)對(duì)典型癥狀的肉眼判斷為主。雖然，也有學(xué)者嘗試?yán)闷渌T如血清學(xué)方法、酶聯(lián)抗體-ELISA法、膠乳凝集反應(yīng)和單克隆抗體法用于家蠶病毒病的診斷，但這些檢測(cè)方法有的準(zhǔn)確性低、有的無(wú)法定量，有的操作煩瑣等，均沒(méi)有形成體系化、穩(wěn)定化的檢測(cè)方法，很難在實(shí)際診斷中推廣應(yīng)用。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有發(fā)明專利檢索發(fā)現(xiàn)， 劉吉平等(專利號(hào)CN1021M522A，2011年)采用常規(guī)PCR方法檢測(cè)BmCPV。常規(guī)PCR方法擴(kuò)增后需電泳檢測(cè)，易造成PCR產(chǎn)物污染及環(huán)境污染，不能定量，且不適合高通量檢測(cè)。熒光定量PCR將常規(guī)PCR和熒光檢測(cè)相結(jié)合，儀器自動(dòng)分析，高通量，無(wú)后續(xù)處理，具有高靈敏性、高特異性、重現(xiàn)性好，且可以對(duì)樣品中的病毒含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量，已成為病毒檢測(cè)的重要方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量 PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明檢測(cè)靈敏度可達(dá)IO1個(gè)數(shù)量級(jí)拷貝的病毒分子，具有靈敏性高、穩(wěn)定性高、可以定量，特異性好，假陽(yáng)性低等特點(diǎn)。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)，步驟如下步驟一，以家蠶質(zhì)型多角體蛋白基因的保守序列為靶目標(biāo)，利用I^rimer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增目的基因片斷(SEQ ID No :1)。所述特異性引物為正向引物5‘ ATACAAGGTTGGCATTTCAGA 3，，反向引物5'ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT 3，。步驟二，構(gòu)建含目的基因片斷的定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，所用載體為pGEM-T Easy ；步驟三，提取樣品RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；步驟四，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。PCR反應(yīng)體系為95°C預(yù)變性3min ；95°C 15s，60°C lmin，共 40 個(gè)循環(huán)。本發(fā)明的有益效果為與RT-PCR相比，本發(fā)明的方法無(wú)需擴(kuò)增后電泳分析，避免了 PCR產(chǎn)物污染及制膠過(guò)程中的健康損害；本發(fā)明的方法具有靈敏性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、特異性好及可以準(zhǔn)確定量等特點(diǎn)；本發(fā)明可同時(shí)進(jìn)行大批量樣品的檢測(cè)，具有高通量性；本發(fā)明方法檢測(cè)范圍廣，在IO1-IO7拷貝范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)范圍可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)。


圖1家蠶質(zhì)型多角體病毒絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖2家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法或按照制造廠商所建議的條件；所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明， 為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實(shí)施例步驟一，設(shè)計(jì)特異性引物從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索獲得家蠶質(zhì)型多角體蛋白基因序列(登錄號(hào)為AB003361)， 利用I^rimer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)得到一條特異性引物，目的擴(kuò)增片段為118bp (SEQ ID NO :1)。設(shè)計(jì)的引物序列為正向引物5'ATACAAGGTTGGCATTTCAGA 3，，(SEQ ID NO 2)反向引物5'ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT 3，。(SEQ ID NO 3)步驟二，定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建以提取的家蠶質(zhì)型多角體病毒RNA為模板，應(yīng)用I^rimer script RT reagent kit (購(gòu)自TaKafci公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系共20 μ L，其中，5 XI^rimer script Buffer 4 μ L, Primer script RT Enzyme Mix I 1 μ L, Oligo dT Primer 1 μ L, Random 6mers 1 μ L，Total RNA(1 μ g) 2 μ L，RNase-free 水 11 μ L。反應(yīng)條件為37 °C 15min， 85°C 5s0以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用正向引物(SEQ ID NO 2)和反向引物(SEQ ID NO :3)擴(kuò)增目的基因片斷，PCR反應(yīng)體系為10XPCR Buffer (Mg2+)2. 5μ L, dNTP(各 10mM)0. 5μ L,正向引物(10 μ mol/L) 0. 6 μ L，反向引物(10 μ mol/L) 0. 6 μ L，cDNA 模板 1· 0 μ L，Taq (5U/ μ L) 0· 5 μ L，ddH20 19. 3 μ L，終體積 25 μ L。反應(yīng)條件為94 "C 2min ； 94°C 30s，58°C 40s，72°C 40s，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，取 5yL PCR 產(chǎn)物在 1 %的瓊脂糖凝膠上電泳分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，通過(guò)膠回收純化目的片段，然后將目的片段與PGEM-T Easy載體連接，將其轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。陽(yáng)性質(zhì)粒用堿裂解法進(jìn)行提純，根據(jù)紫外分光光度計(jì)測(cè)定0擬60/280值計(jì)算質(zhì)粒濃度，并換算為質(zhì)?？截悢?shù)。質(zhì)?？截悢?shù)=質(zhì)粒濃度(μ g/μ L) X6. 02X 1023mol/1000M, M 代表質(zhì)粒分子量。步驟三，病毒樣品RNA的提取
采用Trizol法提取待檢樣本的RNA。具體步驟如下(1)將待檢樣品放入處理好的研缽中，用研杵迅速將樣品砸碎并磨成粉末，分裝到 RNase-free 的 1. 5mLEppendorf 管中，每 0. Ig 組織加 ImL Trizol，樣品體積應(yīng)小于 Trizol 體積的10% ；(2)振蕩混勻，室溫溫育約lOmin，12000g，4°C離心IOmin ；(3)將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新的離心管中，每mL加入0.2mL氯仿(1/5體積)，劇烈搖動(dòng)15s，室溫放置5min，12000g，4°C離心15min ；混合物分成下層的紅色苯酚-氯仿相，中間的蛋白質(zhì)沉淀和上層無(wú)色水相。RNA即位于上清液；(4)將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈離心管中，等體積加入預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻， 室溫靜置lOmin，12000g，4°C離心lOmin，留下RNA沉淀，棄上清；(5)加入 75% 乙醇，ImL Trizol 加 ImL 75% 乙醇，渦旋混勻，7500g，4°C離心 5min，
棄上清；(6)自然控干RNA沉淀約5-lOmin，用30-40 μ L的RNase-free水常溫溶解RNA ；(7)取1 μ L稀釋100倍后，5 μ L用于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，剩余用于分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和純度，_80°C保存?zhèn)溆?。樣品RNA的反轉(zhuǎn)錄同步驟二中的反轉(zhuǎn)錄。步驟四，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。將步驟2中的定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋至1.0X107、1. 0X106、1. 0X105、1. 0X104、 i.oxio3、i. ox Io^loxio1U. ox 10°拷貝/y l，以稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)液為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。其中，1. OX IO7 1. OX IO3拷貝/μ L用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；1. O X IO2U. O X IO1, 1.0X10°拷貝/yL作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)檢測(cè)PCR反應(yīng)的靈敏性。兩個(gè)家蠶品種(P50和意 16)的未感染中腸cdna及滅菌水作為陰性對(duì)照的模板。每個(gè)反應(yīng)作3個(gè)平行樣，進(jìn)行組內(nèi)的重復(fù)性檢驗(yàn)。反應(yīng)體系為:2XSYBR Premix Ex Taq 10 μ L，正向引物(10 μ mol/L) O. 4 μ L， 反向引物(10ymol/L)0. 4yL，模板lyL，ddH20 8. 2 μ L，終體積20 μ L。反應(yīng)條件為95°C 預(yù)變性:3min ;95°C 15s,60°C lmin，40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)結(jié)束后，熒光PCR儀自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 (圖1)。本檢測(cè)方法靈敏度可達(dá)到10個(gè)拷貝，在1. O X IO7 1. O X IO1拷貝/ μ L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)范圍可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)。步驟五，重復(fù)性分析每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液均檢測(cè)3個(gè)平行樣，進(jìn)行重復(fù)性分析，通過(guò)檢測(cè)其CT值的變異系數(shù)進(jìn)行重復(fù)性評(píng)價(jià)，下表結(jié)果顯示，變異系數(shù)均小于0. 5%，表明本檢測(cè)方法重復(fù)性很好， 穩(wěn)定性強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.一種家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)、以家蠶質(zhì)型多角體蛋白基因的保守序列(SEQ ID No:l)為靶目標(biāo)，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增目的基因片斷；O)、利用步驟(1)所得片斷構(gòu)建定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒； (3)、提取樣品RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；G)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的家蠶質(zhì)型多角體病毒含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征是，步驟 ⑴和步驟⑷中，擴(kuò)增時(shí)所用引物為正向引物5 ‘ ATACAAGGTTGGCATTTCAGA 3 ’， 反向引物5 ‘ ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT 3 ’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征是，步驟 (2)中所述質(zhì)粒使用的是pGEM-T Easy0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征是，步驟中，PCR反應(yīng)體系為95°C預(yù)變性:3min ;95°C 15s，60°C lmin，共40個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法包括標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建、特異性引物的設(shè)計(jì)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立、感染病毒樣本的RNA提取及cDNA的制備及其檢測(cè)結(jié)果的判定。本發(fā)明靈敏性高、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)，可以定量，適用于病毒感染的批量檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102559929SQ20121000470
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者吳萍, 李龍, 郭錫杰, 陳濤 申請(qǐng)人:江蘇科技大學(xué)