專利名稱：一種乙型肝炎病毒基因分型pcr檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病病原體基因檢測技術(shù)，尤其涉及一種乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)是嚴(yán)重危害人類健康的肝炎病毒之一， 是重要的肝臟疾病致病因子。世界上有20億人感染過HBV，目前全世界慢性HBV感染患者至少有3. 8億，其中慢性HBV攜帶者75%分布在東南亞和次撒哈拉地區(qū)，而我國就占了 I. 5 億，其中有2000萬人為慢性乙肝患者，每年因此病死亡的人有近50萬。估計全球每年有 100-200萬人直接死于HBV持續(xù)感染。HBV屬于嗜肝DNA病毒科，是一種DNA病毒，其基因組由長3. 2kb的部分雙鏈DNA 組成，共有四個開放讀碼框(Open Readin Frame, ORF) :S、C、P、X,他們編碼至少8個不同蛋白表面抗原蛋白，DNA多聚酶蛋白，核心抗原蛋白，X蛋白等。HBV具有病毒復(fù)制產(chǎn)量高 (1012—13病毒粒/天)和突變率高(101°-11個點(diǎn)突變/天)的特征，高突變是由于高復(fù)制，尤其是由于基因組復(fù)制，需先轉(zhuǎn)錄為RNA中間體，但聚合酶缺乏校正功能所致。根據(jù)HBV全基因核苷酸序列異源性大于8%或S基因區(qū)核苷酸序列異源性大于4. 1%，可將HBV分為A、 B、C、D、E、F、G、H8 個基因型。HBV基因型呈一定的地域性分布在世界不同地區(qū)基因型分布不同，A型為全世界分布，B型、C型主要分布在亞洲，D型分布在南歐、美、澳大利亞和中東，E型分布在非洲，F(xiàn) 型分布在美洲土著人和波利尼西亞，G型分布在美洲、歐洲，H型在美國發(fā)現(xiàn)。目前我國HBV 分布主要以B型和C型為主，兼有少量的A型和D型，在香港、廣州等南部地區(qū)有少部分D 型分布，另外，華北、新疆地區(qū)有A型存在。研究證實，乙肝病毒基因型與乙肝發(fā)病機(jī)制、轉(zhuǎn)歸、抗病毒療效均有密切關(guān)系。不同的基因型其臨床感染特點(diǎn)和致病性也不完全相同。因此，對患者血清中HBV-DNA基因型的測定，對于指導(dǎo)臨床醫(yī)生根據(jù)不同的基因型及臨床表現(xiàn)制定不同的治療方案和預(yù)后判斷有著積極的作用。國內(nèi)外對HBV進(jìn)行基因分型的方法可分為全基因序列比對和片段基因序列比對兩大類。全基因序列比對是以生物系統(tǒng)發(fā)生學(xué)中的基因同源性為基礎(chǔ)的，它主要是通過HBV 全基因序列測定來進(jìn)行基因分型，另外，也可應(yīng)用對HBV全基因進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(RFLP)。片段基因序列比對是利用HBV中的代表性片段的序列類型來反映全基因序列的類型，主要技術(shù)類型有片段基因序列測定、PCR-RFLP、型特異引物(SSP)擴(kuò)增法和型特異探針(SSO)檢測法等。序列測定雖然結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是由于其技術(shù)復(fù)雜、實驗流程長、實驗條件要求高、耗時長和費(fèi)用昂貴難以作臨床常規(guī)使用，目前只作為實驗室研究使用；RFLP技術(shù)相對簡單，但是酶切位點(diǎn)易受基因變異影響，且遇混合感染或酶切不完全，會出現(xiàn)復(fù)雜條帶，影響分型結(jié)果判斷；應(yīng)用SSP法進(jìn)行PCR擴(kuò)增需要多個擴(kuò)增管，使用常規(guī)的 PCR后產(chǎn)物電泳的方法也容易污染，其靈敏性比特異性探針低；應(yīng)用SSO法可通過對單管的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測來分型，因此具有操作相對簡單和費(fèi)用較低等特點(diǎn)，具有實用價值。實時熒光PCR反應(yīng)是利用熱穩(wěn)定DNA聚合酶5’ 一 3’外切酶活性，在一對特異性引物之外，加入一條和模版互補(bǔ)的基因特異性探針(Taqman探針)，探針上5’端和3’端分別標(biāo)記了一個報告熒光基團(tuán)(供體)和一個淬滅熒光基團(tuán)(受體)，在反應(yīng)初始(探針完整)時系統(tǒng)激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光信號被臨近的淬滅基團(tuán)吸收，所以此時檢測不到供體熒光信號；而當(dāng)PCR反應(yīng)過程中，隨著鏈的延伸，Taq酶沿著DNA模板移動到熒光標(biāo)記探針的結(jié)合位置，由于它的5’ 一 3’外切核酸酶活性，將熒光探針切斷，釋放出報告熒光基團(tuán)的熒光信號，每合成一條新生鏈，就有一個報告基團(tuán)的信號釋放，被釋放的激離報告熒光基團(tuán)的數(shù)目和PCR產(chǎn)物是一對一的關(guān)系。通過熒光PCR儀定時動態(tài)監(jiān)測每一循環(huán)，可以得到樣品實際擴(kuò)增曲線，找到PCR擴(kuò)增的對數(shù)期，可以對樣本作定性定量檢測。突光PCR的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)靈敏、特異性聞具有|旲版序列特異的Taqman探針在引物特異的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高的PCR的專一性；每擴(kuò)增一個特異產(chǎn)物只釋放一個分子的熒光染料，儀器檢測的是特異擴(kuò)增的結(jié)果，非特異產(chǎn)物對檢測信號沒有影響，有效提高檢測的專一性。有多種不同波長的熒光基團(tuán)對可供選擇，使得Taqman探針法可以實現(xiàn)在同一管內(nèi)檢測多重PCR，降低成本也提高效率和準(zhǔn)確性避免了熒光染料對PCR反應(yīng)的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的充分利用了 Taqman探針技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，針對HBV各基因型設(shè)計特異探針，各探針標(biāo)記不同的熒光染料，在不同波長檢測，從而達(dá)到分型的目的。本發(fā)明技術(shù)方案為提供一種乙型肝炎病毒基因分型PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括B/C型PCR反應(yīng)液和D型PCR反應(yīng)液； 所述B/C型PCR反應(yīng)液包括特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒B和C型基因片段的引物Y1，所述Yl堿基序列如SEQ ID NO 1所示；特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒B和C型基因片段的的引物Y2，所述Y2堿基序列如SEQ ID NO 2 所示；用于檢測乙型肝炎病毒B型基因片段的探針Y5，所述Y5堿基序列如SEQ ID NO 5所示；用于檢測乙型肝炎病毒B型基因片段的探針Y6，所述Y6堿基序列如SEQ ID NO 6所示；用于檢測乙型肝炎病毒C型基因片段的探針Y7，所述Y7堿基序列如SEQ ID NO 7所示；用于檢測乙型肝炎病毒C型基因片段的探針Y8，所述Y8堿基序列如SEQ ID NO 8所示；所述D型PCR反應(yīng)液包括特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒D型基因片段的的引物Y3，所述Y3堿基序列如SEQ ID NO 3所示；特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒D型基因片段的的引物Y4，所述Y4堿基序列如SEQ ID NO 4所示；
用于檢測乙型肝炎病毒D型基因片段的探針Y9，所述Y9堿基序列如SEQ ID NO 9所示；所述探針5’端用熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記。優(yōu)選的，所述熒光染料選自FAM、JOE或HEX，所述淬滅熒光染料選自BHQ、Eclipse 或 TAMRA。優(yōu)選的，所述探針Y5、Y6和Y9的5’端用FAM標(biāo)記，3’端用TAMRA標(biāo)記；探針Y7 和Y8的5’端用HEX標(biāo)記，3’端用TAMRA標(biāo)記，優(yōu)選的，所述引物的濃度為IOii M，所述探針的濃度為10iiM。優(yōu)選的，所述B/C型PCR反應(yīng)液還包括純水、10XPCR buffer,25mM MgCl2, 20mM dNTP、Taq 酶、UNG 酶，所述 D 型 PCR 反應(yīng)液還包括純水、10XPCR buffer,25mM MgCl2, 20mM dUTP、Taq 酶和 UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP 和 dCTP。優(yōu)選的，所述試劑盒包括DNA提取液、陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品和靈敏度參考品。本發(fā)明的有益效果為本品采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)結(jié)合Taqman熒光探針技術(shù)， 檢測樣品中B、C和D型乙型肝炎病毒，可檢測B、C和D型單獨(dú)感染和混合感染。采用雙色探針，F(xiàn)AM波長檢測B (或D)型乙型肝炎病毒，HEX波長檢測C型乙型肝炎病毒。本品的優(yōu)點(diǎn)在于一次實驗同時檢測B、C和D型乙型肝炎病毒，操作簡單。試劑盒中使用dUTP和 UNG酶，能夠有效消除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物對檢測結(jié)果的干擾。本發(fā)明在大量分析現(xiàn)有已分型的 HBV-DNA序列的基礎(chǔ)上，找出HBV基因型的型特異性堿基的分布規(guī)律，采取了特異性引物和特異性探針結(jié)合的熒光PCR檢測方法，既提高了分型靈敏度、準(zhǔn)確度，又延續(xù)了熒光PCR檢測方法的快速簡便性能，實現(xiàn)了本項目的目的。


圖I.陽性參考品P1-P7的PCR擴(kuò)增曲線；圖2.陰性參考品N1-N3的PCR擴(kuò)增曲線；圖3.精密度參考品Pl重復(fù)10次的PCR擴(kuò)增曲線；圖4.靈敏度參考品S-I到S-6的PCR擴(kuò)增曲線。
具體實施例方式實時熒光PCR是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。實時熒光PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。原材料的選取和制備一、找出HBV基因型的各型特異性堿基分布規(guī)律，根據(jù)HBV各型特異序列，設(shè)計引物和探針。I、引物乙型肝炎病毒(HBV)基因結(jié)構(gòu)包括4個部分重疊的開放讀碼框(ORF)，即前S/S區(qū)、前C/C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)，其中S區(qū)基因差異是HBV基因分型的依據(jù)，而P區(qū)則集中了核苷類似物耐藥基因突變位點(diǎn)，S區(qū)短于P區(qū)并與之完全重疊。據(jù)此，查閱GenBank數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)登錄的HBV基因組全序列，其中B、C、D基因型HBV序列均在30例以上，進(jìn)行比對分析設(shè)計引物。引物擴(kuò)增片段必須包括HBV-B、C、D基因型區(qū)別位點(diǎn)。引物(Y1、Y2)可同時擴(kuò)增HBV B/C型基因片段，引物(Υ3、Υ4)可擴(kuò)增HBV D型基因片段。引物序列如表一(注 堿基簡并Y = C/To )所示。表 I
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒基因分型PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括B/C型 PCR反應(yīng)液和D型PCR反應(yīng)液；所述B/C型PCR反應(yīng)液包括特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒B和C型基因片段的引物Y1，所述Yl堿基序列如SEQ ID NO: I所示；特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒B和C型基因片段的的引物Y2，所述Y2堿基序列如SEQ ID NO 2所示；用于檢測乙型肝炎病毒B型基因片段的探針Y5，所述Y5堿基序列如SEQ ID NO :5所示；用于檢測乙型肝炎病毒B型基因片段的探針Y6，所述Y6堿基序列如SEQ ID NO :6所示；用于檢測乙型肝炎病毒C型基因片段的探針Y7，所述Y7堿基序列如SEQ ID NO :7所示；用于檢測乙型肝炎病毒C型基因片段的探針Y8，所述Y8堿基序列如SEQ ID NO :8所示；所述D型PCR反應(yīng)液包括特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒D型基因片段的的引物Y3，所述Y3堿基序列如SEQ ID NO 3所示；特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒D型基因片段的的引物Y4，所述Y4堿基序列如SEQ ID NO 4所示；用于檢測乙型肝炎病毒D型基因片段的探針Y9，所述Y9堿基序列如SEQ ID NO :9所示；所述探針5’端用熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的乙型肝炎病毒基因分型PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光染料選自FAM、JOE或HEX，所述淬滅熒光染料選自BHQ、Eclipse或TAMRA。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因分型PCR檢測試劑盒，其特征在于，探針Y5、Y6和Υ9的 5’端用FAM標(biāo)記，3’端用TAMRA標(biāo)記；探針Υ7和Υ8的5’端用HEX標(biāo)記，3’端用TAMRA標(biāo)記。
4.按權(quán)利要求I所述的乙型肝炎病毒基因分型PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述引物的濃度為10 μ Μ,所述探針的濃度為10 μ M0
5.按權(quán)利要求I所述的乙型肝炎病毒基因分型PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述B/ C 型 PCR 反應(yīng)液還包括純水、10 XPCR buffer,25mMMgCl2,20mM dNTP、Taq 酶和 UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP 和 dCTP。
6.按權(quán)利要求I所述的乙型肝炎病毒基因分型PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括DNA提取液、陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品和靈敏度參考品。
全文摘要
本發(fā)明的目的充分利用了Taqman探針技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，針對HBV各基因型設(shè)計特異探針，各探針標(biāo)記不同的熒光染料，在不同波長檢測，從而達(dá)到分型的目的。本發(fā)明試劑盒針對HBV各基因型設(shè)計引物和特異探針，檢測樣品中B、C和D型乙型肝炎病毒，可檢測B、C和D型單獨(dú)感染和混合感染。采用雙色探針，F(xiàn)AM波長檢測B(或D)型乙型肝炎病毒，HEX波長檢測C型乙型肝炎病毒。本試劑盒的優(yōu)點(diǎn)在于一次實驗同時檢測B、C和D型乙型肝炎病毒，操作簡單，試劑盒中使用dUTP和UNG酶，能夠有效消除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物對檢測結(jié)果的干擾。
文檔編號C12Q1/70GK102586473SQ20121000956
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月12日
發(fā)明者陽衛(wèi)超, 陳寧 申請人:泰普生物科學(xué)(中國)有限公司