多重分型檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒(hcmv)的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物領(lǐng)域，尤其設(shè)及多重分型檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒（HCMV)的試劑盒及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人巨細(xì)胞病毒（Human切tomegalovirus, HCMV),也稱人瘤疹病毒5型，屬于瘤疹 病毒科β亞科。HCMV感染在人群感染普遍，其抗體陽性率高達(dá)40%~100%。HCMV是一 種終身感染病毒，一經(jīng)感染，人體宿主終身攜帶。在人體的感染過程中，分為原發(fā)感染、激活 感染和位于兩者之間的潛伏感染。HCMV是一個(gè)弱致病因子，多W潛伏形式存在于人體多種 細(xì)胞中，在免疫系統(tǒng)正常的人體中，潛伏感染并不致病。但多種誘因均可使?jié)摲牟《颈患?活，從而引發(fā)明顯的臨床癥狀和嚴(yán)重危害。
[0003] HCMV感染在孕婦和嬰幼兒W及免疫功能低下的人群如器官移植、艾滋病、惡性腫 瘤等則可導(dǎo)致包括致死在內(nèi)的嚴(yán)重后果。妊娠期婦女由于其內(nèi)分泌及免疫狀態(tài)的改變而 更易發(fā)生HCMV的原發(fā)感染，也可使既往體內(nèi)潛伏的病毒被激活，而發(fā)生激活感染，通過母 嬰垂直傳播給胎兒，導(dǎo)致死胎、早產(chǎn)、流產(chǎn)、智力低下、生長發(fā)育遲緩及多種崎形，嚴(yán)重者可 引起胎兒全身性感染綜合征。HCMV感染在我國的育齡女性HCMV感染率高達(dá)95. 3%。孕婦 HCMV原發(fā)感染者，引起胎兒先天性感染的發(fā)病率高達(dá)40 %，先天性HCMV感染胎兒的死亡率 為10% -30%，存活者中90%W上可遺留不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。此外，自身免疫病 病人，免疫抑制治療，肝、腎、屯、臟等器官移植，化療和放療的腫瘤及骨髓移植，艾滋病人等 極易通過感染而發(fā)病，產(chǎn)生廣泛的HCMV激活感染，引起活動(dòng)性HCMV致病表現(xiàn)，如移植失敗、 CMV相關(guān)肝炎甚至肝衰竭、視網(wǎng)膜炎、肺炎、大腸炎等。
[0004] 肥MV的濁基因編碼濁糖蛋白，又稱化55。濁基因雖高度保守，但在一定區(qū)域內(nèi) 存在變異。在濁的裂解區(qū)（核巧酸2075-2390,氨基酸453-472)表現(xiàn)出序列的高度差異。 根據(jù)對(duì)臨床HCMV病毒株的濁的裂解區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增及序列分析可將HCMV劃分為四個(gè)基 因型：HCMV-I、II、III、IV型。研究表明HCMV感染病人如感染多型W上的病毒，其疾病的 預(yù)后較單型感染更差。運(yùn)對(duì)臨床治療與監(jiān)測(cè)有重要意義。
[0005] 目前HCMV基因分型為的常用檢測(cè)方法是利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)，文獻(xiàn)報(bào)道的 方法無一例外是分別設(shè)計(jì)四套引物與探針-分別實(shí)施4個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增相對(duì)應(yīng)的基因型。 運(yùn)種單個(gè)基因擴(kuò)增的方法勞動(dòng)強(qiáng)度大、檢測(cè)通量低、工作效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了彌補(bǔ)W上領(lǐng)域的不足，本發(fā)明提供了一種多重分型檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒的試劑 盒。
[0007] 本發(fā)明所提供的多重分型檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒的試劑盒，包含W下引物序列和探針 序列： 陽00引用于HCMV病毒I型檢測(cè)的引物序列是：
[0009] HCMV-PIFPI :5' -TAACACCATGGCTGACCGTTT-3';
[0010] HCMV-PIRPI :5' -CGTGGAACTTCTGCTACTCACA-3,； W11] 用于肥MV病毒I型檢測(cè)的探針序列是： 陽01引 5' -巧光素-ACTGAACCGGATCGAGAGTGAGCAG-澤滅劑-3' ；和 陽01引用于HCMV病毒II、ΙΠ和IV型檢測(cè)的引物序列是：
[0014] HCMV-P2FP2 :5> -TGAACTGCAGCTGAGCGT-3> ;
[0015] HCMV-P2RP2 :5' -GGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAA-3';
[0016] 用于肥MV病毒II型檢測(cè)的探針序列是：
[0017] 5' -巧光素-AGTGATATTCAGACTGGATCGATTGGCCAAAC-澤滅劑-3,； 陽01引用于HCMV病毒III型檢測(cè)的探針序列是：
[0019] 5' -巧光素-CGTACTTCTCTTGGTTCTACGCGTGGAGTTCA-澤滅劑-3' ；
[0020] 用于HCMV病毒IV型檢測(cè)的探針序列是：
[0021] 5'-巧光素-AACCAGAAGAAGTACAGATGGCACCAATGT-澤滅劑-3，。
[0022] 所述試劑盒還包含W下用于擴(kuò)增陽性內(nèi)參的引物序列和內(nèi)參探針序列：
[0023] 用于擴(kuò)增陽性內(nèi)參的引物序列是：
[0024] HCMV-ICFP3 :5, -AGCTCGCCTCGTATCTGATG-3,； 陽0巧]HCMV-ICRP3 :5, -CTCCTGCGCCTCTGATTCAT-3,；
[0026] 內(nèi)參換針序列是：
[0027]5,-巧光素-ACTCGAGAGCGTACTACATATCCGTCCT-澤滅劑-3,。 陽02引所述用于HCMV病毒I型檢測(cè)的引物序列和所述用于HCMV病毒I型檢測(cè)的探針序 列與所述用于HCMV病毒II型檢測(cè)的引物序列和所述用于HCMV病毒II型檢測(cè)的探針序列W 及所述用于擴(kuò)增陽性內(nèi)參的引物序列和探針序列獨(dú)立包裝；和
[0029] 所述用于HCMV病毒III型檢測(cè)的引物序列和所述用于HCMV病毒III型檢測(cè)的探針序 列與所述用于HCMV病毒IV型檢測(cè)的引物序列和所述用于HCMV病毒IV型檢測(cè)的探針序列W 及所述用于擴(kuò)增陽性內(nèi)參的引物序列和探針序列獨(dú)立包裝。
[0030] 所述多重分型檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒的試劑盒在制備檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒試劑中的應(yīng) 用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0031] 所述多重分型檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒的試劑盒在制備對(duì)人巨細(xì)胞病毒進(jìn)行基因分型 的試劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0032] 本發(fā)明所提供的多重分型檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒（HCMV)的試劑盒，具有高靈敏度、高 特異性、通量高等特點(diǎn)，可更好地滿足臨床精確快速診斷的需求。
【附圖說明】 陽03引 圖1為HCMV陽性標(biāo)準(zhǔn)品DNA系列稀釋后擴(kuò)增曲線分析結(jié)果。
[0034] 圖2為肥MV陽性標(biāo)準(zhǔn)品DNA多重PCR擴(kuò)增結(jié)果。 陽03引 圖3為含有陽性內(nèi)參的肥MV陽性標(biāo)準(zhǔn)品DNA多重PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中A為檢測(cè)I、 II型及陽性內(nèi)參反應(yīng)管的擴(kuò)增結(jié)果巧為檢測(cè)III、IV型及陽性內(nèi)參反應(yīng)管的擴(kuò)增結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 實(shí)施例1、多重分型檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒（HCMV)的試劑盒
[0037] 一、HCMV病毒四個(gè)基因型的濁基因裂解區(qū)序列的克隆
[0038] 按肥MV濁基因型I、II、III、IV每型共有序列分別人工合成基因，并將合成 產(chǎn)物連接到線形化質(zhì)粒載體pGEMT-easy上進(jìn)行克隆（委托北京奧科鼎盛公司合成），制 備成質(zhì)粒利用pGEMT-easy通用測(cè)序引物驗(yàn)證所合成的序列正確，并利用微量分光光度 計(jì)測(cè)定質(zhì)粒溶液濃度，所得到的質(zhì)粒（統(tǒng)稱為pGEMT-easy-CMV-濁，每一型克隆產(chǎn)物稱為 pGEMT-eas}f-CMV-濁 1、pGEMT-eas}f-CMV-濁2、pGEMT-eas}f-CMV-濁3、pGEMT-eas}f-CMV-濁4) 作為HCMV病毒核酸分型的標(biāo)準(zhǔn)品。四型HCMV濁基因裂解區(qū)的插入序列見序列表序列12、 序列13、序列14、序列15。
[0039] 二、HCMV病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0040]將pGEMT-eas廠CMV-濁 4 型質(zhì)粒（pGEMT-eas廠CMV-濁 1、pGEMT-eas廠CMV-濁2、 pGEMT-easy-CMV-濁3、pGEMT-easy-CMV-濁4)分別溶解到高壓滅菌TE緩沖液中得到濃度 為l〇6copy/L的標(biāo)準(zhǔn)品。用滅菌TE緩沖液10倍連續(xù)稀釋樣品，每個(gè)PCR反應(yīng)中加入10μL DNA，其每個(gè)PCR反應(yīng)DM的拷貝數(shù)分別為：1〇6、1〇5、1〇4、1〇3、1〇2、1〇1。再將i〇ic〇py/l〇yL 的稀釋物進(jìn)行再稀釋，其DM濃度為5拷貝/反應(yīng)用于檢測(cè)下限。
[0041] Ξ、HCMV病毒基因型的每型單獨(dú)基因擴(kuò)增檢測(cè) 陽0創(chuàng)用于肥MV病毒基因分型檢測(cè)的反應(yīng)體系如下：10XPCRbuffer4yL，25mM MgClzA.8μL，lOmMdNTPs0.8μL，0.6M上游引物 1. 2μL，0.6M下游引物 1. 2μL，0. 3M探針 分別為0.6μLTaq酶抓/μL0. 4μL模板DNAIOμL其余為無核酸酶高純水，終體積為 40μL。PCR擴(kuò)增程序：95°C預(yù)變性2min;95°C變性15秒，60°C退火35秒，共45循環(huán)。在擴(kuò) 增的同時(shí)實(shí)時(shí)采集FAM通道巧光信號(hào)。每個(gè)基因型檢測(cè)PCR反應(yīng)的引物、探針的組合如下 表所示（所有探針均在5'端FAM標(biāo)記，3'端TAMRA標(biāo)記）：
[0043]
W44]HCMV陽性標(biāo)準(zhǔn)品DNA系列稀釋后實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線結(jié)果見圖1。陽性樣品DNA系列稀 釋倍數(shù)分別為1:1，1:10,1:1〇2,1: 1〇3,1:104,1: 1〇5;其對(duì)應(yīng)Ct值如下表所示：
[0045]
[0046] 在所實(shí)驗(yàn)的HCMV模板的量的范圍內(nèi)，與巧光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系。其可靠分型 檢測(cè)下限為5拷貝/反應(yīng)。
[0047] 四、多重（多聯(lián)）分型檢測(cè)HCMV病毒基因的方法