一種高通量檢測人乳頭癌病毒分型的基因芯片及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本申請公開了一種高通量檢測人乳頭癌病毒分型的基因芯片及試劑盒。本申請的基因芯片，包括芯片基片和固定于芯片基片上的探針，探針包括分別與人乳頭癌病毒61、70、72、81和83型的核苷酸雜交的特異性檢測探針。本申請的高通量檢測人乳頭癌病毒分型的基因芯片，能夠?qū)ι鲜鑫宸N型別的人乳頭癌病毒進(jìn)行平行檢測，并且，在本申請的優(yōu)選方案中，將這五種HPV分型的特異性檢測探針與之前設(shè)計的二十九種HPV分型檢測探針組合在一張基因芯片上，使得基因芯片可以實現(xiàn)三十四種HPV分型的平行檢測，進(jìn)一步完善了現(xiàn)有的HPV分型檢測體系，為HPV的分型檢測提供了一種快速、靈敏、高通量的新的檢測途徑。
【專利說明】
-種高通量檢測人乳頭癌病毒分型的基因巧片及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本申請設(shè)及人乳頭癌病毒檢測領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種高通量檢測人乳頭癌病毒分 型的基因忍片及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭瘤病毒化Uman化ppillomavi;rus，HPV)是一類感染人類皮膚粘膜上皮細(xì)胞 DNA的病毒，到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大約100多種HPV型，其中有40多種型別可感染人類的泌 尿生殖道。根據(jù)HPV基因組E6、E7和Ll區(qū)開放閱讀框核巧酸順序同源性不超過90%的定義， 一些型別根據(jù)上述區(qū)域同源性在90%-98%，而不超過98%還可進(jìn)一步分為不同的亞型。
[0003] HPV可W引起人全身各部位的皮膚或者粘膜感染，導(dǎo)致多種上皮組織疾病，例如皮 膚尋常痛、扁平痛和外生殖器的尖銳濕痛等。宮頸上皮組織長期感染的某些型別的HPV可能 引起基因突變，導(dǎo)致感染部位發(fā)生癌變。沒有HPV感染不可能導(dǎo)致宮頸癌，而有HPV感染不一 定會導(dǎo)致疾病和宮頸癌。因為HPV感染大多數(shù)是一過性感染，即在感染后短期內(nèi)靠自身免疫 力恢復(fù)轉(zhuǎn)歸，不會導(dǎo)致疾病。只有少數(shù)轉(zhuǎn)為持續(xù)性感染，也只有少數(shù)可能存在反復(fù)性的感 染。據(jù)統(tǒng)計，80%的女性一生有可能至少感染HPV-次。目前根據(jù)導(dǎo)致宮頸癌風(fēng)險的高低將 運些HPV分為高危型HPV和低危型HPV，前者被認(rèn)為具有引發(fā)婦女發(fā)生宮頸癌的型別，主要包 括 HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、67、69、73、82 等。低危性 HPV 主要引起尖銳濕痛，包括 HPV6、11、40、42、43、44、54、55、57、61、71、81、83 等。
[0004] 由于HPV目前還不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，免疫學(xué)的抗體檢測缺乏可靠一致的結(jié)果，HPV 的檢測主要依賴于細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的基因檢測方法。目前基于PCR對多種型別HPV的檢 測方法，主要是反向點雜交法，在一張較大的約幾個厘米至十多厘米的膜條或其他基質(zhì)上 附著HPV檢測的DNA探針，運種方法無法做到對更多型別的多指標(biāo)大樣本量進(jìn)行平行的高通 量的快檢測。
[0005] 生物忍片(biochip或bioarray)是采用能夠并行處理生物樣本中的多個信息的微 處理單元形成的集合體，根據(jù)生物分子間特異相互作用的原理，將生物分子分析過程集成 于忍片表面，從而實現(xiàn)對DNA、RNA、多膚、蛋白質(zhì)W及其他生物成分的高通量快速檢測。狹義 的生物忍片概念是指通過不同方法將生物分子，如寡核巧酸、cDNA、genomic DNA、多膚、抗 體、抗原等，固著于娃片、玻璃片、玻璃珠、塑料片、塑料珠、凝膠、尼龍膜等固相遞質(zhì)上形成 的生物分子點陣?；蛉唐虳NA微陣列技術(shù)是生物忍片的一個種類，采用W陣列方式設(shè)定 在平面基質(zhì)載體上，形成能夠并行處理生物樣本中多個基因信息的微處理單元，它具有微 型化和并行處理的特征，點陣排布點直徑在500皿W內(nèi)，相鄰兩個點的中屯、點間距在1000皿 W內(nèi)。微陣列忍片體積小，點徑為微米級別，可實現(xiàn)對更多型別、更多指標(biāo)及大樣本量進(jìn)行 平行的高通量的快檢測。
[0006] 目前針對高危型HPV和低危型HPV已經(jīng)有多個試劑盒，其中已獲得授權(quán)的 CN103409553A專利披露了檢測29種高危型HPV和低危型冊V的基因忍片和相關(guān)試劑。但是， 如前面提到，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約100多種HPV型中可感染人類的泌尿生殖道有大約40多種型 另Ij;因此，僅針對29種高危型HPV和低危型HPV的檢測試劑盒或試劑已經(jīng)不能滿足實際檢測 和研究的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本申請的目的是提供一種新的高通量檢測人乳頭癌病毒分型的基因忍片及試劑 盒。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本申請采用了 W下技術(shù)方案：
[0009] 本申請公開了一種高通量檢測人乳頭癌病毒分型的基因忍片，包括忍片基片，和 固定于忍片基片上的探針，探針包括分別與人乳頭癌病毒61、70、72、81和83型的核巧酸雜 交的特異性檢測探針，與人乳頭癌病毒61型雜交的特異性檢測探針為Seq ID No.1所示序 列和/或Seq ID No. 2所示序列，與人乳頭癌病毒70型雜交的特異性檢測探針為Seq ID No.3所示序列和/或Seq ID No.4所示序列，與人乳頭癌病毒72型雜交的特異性檢測探針為 Seq ID No.5所示序列和/或Seq ID No.6所示序列，與人乳頭癌病毒81型雜交的特異性檢 測探針為Seq ID No.7所示序列和/或Seq ID No.8所示序列，與人乳頭癌病毒83型雜交的 特異性檢測探針為Seq ID No.9所示序列和/或Seq ID No. 10所示序列。
[0010] 需要說明的是，本申請針對CN103409553A專利中記載的29種高危型HPV和低危型 HPVW外的其它人乳頭瘤病毒(縮寫HPV)型別進(jìn)行研究，特別設(shè)計了冊￥61、70、72、81、83(即 MM7)等五種型別人乳頭瘤病毒的特異性雜交探針，并研制出了針對運五種型別的高通量檢 測基因忍片?？蒞理解，本申請的五種型別的探針彼此之間W及與CN103409553A專利所述 29種高危型HPV和低危型HPV不會有交叉反應(yīng)，并且具有很好的一致性，因此可W制備到一 張基因忍片上，實現(xiàn)人乳頭瘤病毒=十四種型別的高通量檢測；同樣的，根據(jù)不同的需要， 運些探針也可W分開使用，例如針對某個型別或某幾個型別的基因忍片上，可W只采用些 探針中的某條或某幾條，運都屬于本申請的保護(hù)范圍，在此不做具體限定。
[0011] 還需要說明的是，本申請在經(jīng)過設(shè)計和篩選，HPV61、70、72、81、83 (MM7)每個型別 獲得了兩條特異性檢測探針，例如HPV61型Seq ID No. 1所示序列的探針和Seq ID No.2所 示序列的探針都可W用于其特異性檢測，因此，在使用時，本申請的基因忍片中可W單獨使 用Seq ID No.1所示序列或Seq ID No.2所示序列的特異性檢測探針，也可W同時使用兩條 探針，W保障HPV61型別檢測的準(zhǔn)確性。HPV70型可W同時使用Seq ID No. 3所示序列和Seq ID No.4所示序列的特異性檢測探針，也可W單獨使用其中一條。HPV 72型可W同時使用 Seq ID No.5所示序列和Seq ID No.6所示序列的特異性檢測探針，也可W單獨使用其中一 條。HPV 81型可W同時使用Seq ID No.7所示序列和Seq ID No.8所示序列的特異性檢測探 針，也可W單獨使用其中一條。HPV83型可W同時使用Seq ID No.9所示序列和Seq ID No. 10所示序列的特異性檢測探針，也可W單獨使用其中一條。在此不做具體限定。
[0012] 優(yōu)選的，探針還包括陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針和PCR內(nèi)對照探針；陽性質(zhì)控探 針為Seq ID No.11所示序列，陰性質(zhì)控探針為Seq ID No.12所示序列，PCR內(nèi)對照探針為 Seq ID No. 13所示序列。
[001引優(yōu)選的，述忍片基片分為冊V檢測區(qū)、陽性質(zhì)控區(qū)、陰性質(zhì)控區(qū)、PCR內(nèi)對照區(qū)和定 位區(qū);HPV檢測區(qū)固定有樣品檢測的人乳頭瘤病毒特異性檢測探針，陽性質(zhì)控區(qū)含有至少S 個并排重復(fù)的陽性質(zhì)控探針的檢測點，定位區(qū)含有至少=個并排重復(fù)的定位顯色點，陰性 質(zhì)控區(qū)含有至少S個并排重復(fù)的陰性質(zhì)控探針的檢測點，PCR內(nèi)對照區(qū)含有至少S個并排 重復(fù)的PCR內(nèi)對照探針的檢測點。其中，陽性質(zhì)控探針(縮寫PC)和雜交質(zhì)控品為互補的核巧 酉《序列，選自Arabidopsis thaliana homeobox-leucine zipper protein HATlmRNA基因。
[0014] 需要說明的是，本申請的基因忍片采用特殊的微陣列結(jié)構(gòu)設(shè)計，將=個重復(fù)的定 位點設(shè)計在一個定位區(qū)里面，與CN103409553A專利的在忍片基片的右上角、右下角和左上 角分別設(shè)置一個定位點的結(jié)構(gòu)相比，本申請的設(shè)計結(jié)構(gòu)更為合理。本申請的基因忍片對一 個指標(biāo)提供3次重復(fù)檢測，提高了準(zhǔn)確性;增加質(zhì)控點，包括陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控，如果陽性 質(zhì)控檢測結(jié)果為陰性，可W判斷雜交陰性檢測結(jié)果無效，避免假陰性產(chǎn)生;如果陰性質(zhì)控檢 測結(jié)果為陽性，可W判斷雜交陽性檢測結(jié)果無效，可W避免假陽性產(chǎn)生。
[0015] 本申請的另一面公開了一種高通量檢測人乳頭癌病毒分型的基因忍片，包括忍片 基片，和固定于忍片基片上的檢測探針，檢測探針包括分別與34種型別的人乳頭癌病毒核 巧酸雜交的型特異性雜交檢測探針，其中，型特異性雜交檢測探針為Seq ID No.1所示序列 和/或Seq ID No. 2所示序列的特異性雜交探針、Seq ID No. 3所示序列和/或Seq ID No.4 所示序列的特異性雜交探針、Seq ID No.5所示序列和/或Seq ID No.6所示序列的特異性 雜交探針、Seq ID No.7所示序列和/或Seq ID No.8所示序列的特異性雜交探針、Seq ID No.9所示序列和/或Seq ID No. 10所示序列的特異性雜交探針，W及Seq ID No. 14所示序 列至Seq ID No.42所示序列的特異性雜交探針。
[0016] 需要說明的是，本申請是在發(fā)明人之前研究的高通量分型檢測人乳頭瘤病毒基因 忍片的基礎(chǔ)上深入研究而成的，之前研究的高通量分型檢測人乳頭瘤病毒基因忍片詳細(xì)記 載于CN103409553A專利中，其中記載了人乳頭癌病毒化PV16、18、31、33、35、39、45、51、52、 56、58、59、68、6、11、26、40、42、43、44、53、54、55、57、66、67、69、73、82)共計二十九個型別的 人乳頭癌病毒分型檢測所需的二十九條特異性雜交探針和內(nèi)對照探針，即本申請的Seq ID No. 14所示序列至Seq ID No.42所示序列的特異性雜交探針和本申請的內(nèi)對照探針Seq ID 13。因此，在本申請的一種方案中，除了可W將此次研究的五種分型單獨制成基因忍片W 夕h還將此次研究的五種分型的特異性雜交探針和之前研究的二十九條特異性雜交探針一 起整合到一張基因忍片上，從而可W實現(xiàn)人乳頭瘤病毒=十四種分型的同時檢測，真正實 現(xiàn)了人乳頭瘤病毒的高通量分型檢測。
[0017] 同樣的，在檢測；十四種分型的基因忍片中，也包含有陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探 針和PCR內(nèi)對照探針等。
[0018] 本申請的另一面公開了一種用于高通量分型檢測人乳頭癌病毒的試劑盒，該試劑 盒中包含有本申請的基因忍片。
[0019] 可W理解，本申請的基因忍片可W是新研究的五種型別的人乳頭癌病毒分型檢測 的基因忍片，也可W是包含之前的二十九種型別的可分型檢測=十四種人乳頭癌病毒的基 因忍片。
[0020] 同樣的，試劑盒中還包含有對各人乳頭癌病毒分型的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物。
[0021] 需要說明的是，引物的作用是對各HPV分型的核巧酸進(jìn)行擴(kuò)增，W實現(xiàn)信號放大， 方便后續(xù)的基因忍片雜交檢測?？蒞理解，凡是能夠?qū)Ω鱄PV分型進(jìn)行PCR擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段 包含本申請的特異性檢測探針的引物都可W用于本申請。本申請的優(yōu)選方案中，所有引物 都引用自CN103409553A專利。
[0022] 同樣的，試劑盒中還包含有人乳頭癌病毒DNA提取試劑、PCR擴(kuò)增試劑、雜交試劑和 顯色試劑?？蒞理解，為了方便使用，可W在本申請的試劑盒中配置基因忍片整個過程相關(guān) 的試劑，運些相關(guān)試劑同樣引用自CN103409553A專利。
[0023] 優(yōu)選的，試劑盒中還包含陽性對照品、陰性對照品和雜交質(zhì)控品；陽性對照品和陰 性對照品均含有人基因組DNA，雜交質(zhì)控品為5'-Biotin標(biāo)記的人工合成核巧酸片段，雜交 質(zhì)控品為Seq ID No.54所示序列。
[0024] 本申請的另一面公開了一種用于高通量檢測人乳頭癌病毒分型的探針，探針包括 分別與34種型別的人乳頭癌病毒核巧酸雜交的特異性雜交探針，探針包括Seq ID No. 1所 示序列和/或Seq ID No.2所示序列的特異性雜交探針、Seq ID No.3所示序列和/或Seq ID No.4所示序列的特異性雜交探針、Seq ID No.5所示序列和/或Seq ID No.6所示序列的特 異性雜交探針、Seq ID No.7所示序列和/或Seq ID No.8所示序列的特異性雜交探針、Seq ID No.9所示序列和/或Seq ID No. 10所示序列的特異性雜交探針，W及Seq ID No. 14所示 序列至Seq ID No.42所示序列的特異性雜交探針。
[0025] 需要說明的是，第一，本申請的探針可W對S十四種HPV型別進(jìn)行高通量檢測，可 W作為整體一起使用，也可W單獨使用。第二，本申請的探針雖然是針對基因忍片而設(shè)計 的，但是，可W理解，由于其特異性W及彼此之間的一致性，其它的如斑點雜交、液相忍片等 技術(shù)同樣可W使用本申請的探針，只是針對不同的技術(shù)在探針的末端分別進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)記 或修飾而已，在此不做具體限定。
[0026] 本申請的再一面公開了一種用于高通量檢測人乳頭癌病毒分型的試劑盒，該試劑 盒中含有本申請的探針，W及對各人乳頭癌病毒分型的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物。
[0027] 可W理解，本申請的基因忍片可W單獨存在于試劑盒中使用，而本申請針對基因 忍片設(shè)計的探針，由于其特異性和各探針的一致性，同樣可W單獨存在于試劑盒中，例如斑 點雜交就可W直接采用本申請的探針進(jìn)行，在此不做具體限定。
[0028] 由于采用W上技術(shù)方案，本申請的有益效果在于：
[0029] 本申請的高通量檢測人乳頭癌病毒分型的基因忍片，能夠?qū)訴61、70、72、81、83 (MM7)五種人乳頭瘤病毒進(jìn)行平行的分型檢測，進(jìn)一步完善了現(xiàn)有的HPV分型檢測體系。并 且，在本申請的優(yōu)選方案中，將運五種HPV分型的特異性檢測探針與之前設(shè)計的二十九種 HPV分型檢測探針組合在一張基因忍片上，使得基因忍片可W實現(xiàn)S十四種HPV分型的平行 檢測，為HPV的分型檢測提供了一種快速、靈敏、高通量的新的檢測途徑。
【附圖說明】
[0030] 圖1是本申請實施例中忍片基片的質(zhì)控結(jié)構(gòu)示意圖；
[0031] 圖2是本申請實施例中的一種檢測S十四種HPV型別的微陣列結(jié)構(gòu)示意圖；
[0032] 圖3是本申請實施例中忍片的點樣流程圖；
[0033] 圖4是本申請實施例中試劑盒陰性對照品的顯色模式圖；
[0034] 圖5是本申請實施例中試劑盒陰性對照品對照的實際檢測結(jié)果圖；
[0035] 圖6是本申請實施例中陽性對照品的顯色模式圖；
[0036] 圖7是本申請實施例中陽性對照品的實際檢測結(jié)果圖；
[0037] 圖8是本申請實施例中樣品中含有HPV33和HPV44兩個混合型的結(jié)果圖；
[0038] 圖9是本申請實施例中樣品中含有HPV16和HPV35兩個混合型的結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0039] 本申請的目的在于結(jié)合核酸擴(kuò)增、DNA分子雜交和基因忍片技術(shù)形成一種高通量 檢測多種HPV型別的基因忍片和試劑盒。通過設(shè)計特異性核酸探針，將各探針點樣在很小面 積的平面載體上形成基因忍片微陣列;運用DNA分子雜交和信號放大技術(shù)，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 與探針在基因忍片上雜交，然后通過顯色和基因忍片閱讀分析儀檢測忍片給出的信號，可 W檢測多種HPV型，包括個別型的亞型，達(dá)到快速、靈敏和高通量的檢測效果。本申請的一種 實現(xiàn)方式中，將基因忍片至于微孔板裝置的孔內(nèi)進(jìn)行分子雜交，利用96孔微孔板做96個微 孔反應(yīng)池，每個孔放入一個微陣列忍片，每個孔單獨進(jìn)行顯色信號放大，然后通過顯色和基 因忍片閱讀分析儀檢測忍片給出的信號;實現(xiàn)大批量樣品的平行檢測。
[0040] 本申請?zhí)峁┝擞糜跈z查人乳頭瘤病毒五種型別和個別亞型的基因忍片，針對人乳 頭瘤病毒，針對不同的HPV型別設(shè)計特異性的探針，在特定雜交條件下和在微型化的基因忍 片陣列上進(jìn)行DNA分子雜交;補充并進(jìn)一步完善了現(xiàn)有的HPV分型檢測體系，為HPV分型的深 入研究奠定了基礎(chǔ)。
[0041] 在本申請的實施例中，將本申請設(shè)計的10條特異性檢測探針，任意選擇其中5條與
【申請人】之前的專利CN103409553A中的29條HPV分型特異性檢測探針一起整合到一張基因忍 片中使用?？蒞理解，運34條探針可W-起整合到一張基因忍片上，在特殊的使用需求中， 也可W單獨將本申請設(shè)計的10條特異性檢測探針或者其中部分單獨制成基因忍片，基因忍 片的制備和檢測方法與本申請實施例相同。
[0042] 本申請是在專利CN103409553A基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究而提出的，因此專利 CN103409553A的全部內(nèi)容引用至本申請中，包括其具體的試驗材料和試驗方法等。
[0043] 可W理解，本申請實際上就是另外設(shè)計了五種HPV型別的特異性檢測探針，并且， 在本申請的實施例中，將運五種探針加入到了專利CN103409553A的基因忍片中，所不同的 是，本申請另外對基因忍片的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改進(jìn)，其余例如DNA樣品提取、基因忍片制備、PCR 反應(yīng)、雜交、信號檢測和分析、試劑盒等都可W參考專利CN103409553A。包括W下實施例中 省略記載的部分內(nèi)容都參見專利CN103409553A。
[0044] 下面通過具體實施例和附圖對本申請作進(jìn)一步詳細(xì)說明。W下實施例僅對本申請 進(jìn)行進(jìn)一步說明，不應(yīng)理解為對本申請的限制。
[0045] 實施例一基因忍片及其制備
[0046] 1、材料
[0047] 1.1主要試劑和儀器
[004引試劑:忍片基片、特異性雜交探針、引物、DNA提取試劑盒、忍片點樣試劑、PCR擴(kuò)增 試劑、忍片雜交試劑等。
[0049]儀器:移液器、PCR儀、Heath Digit2003生物忍片點樣儀、基因忍片閱讀分析儀、無 菌工作臺、恒溫箱等。
[(K)加]1.2樣品采集及其DNA提取
[0051]采用棉簽試子或?qū)Ｓ妹⒐稳m頸脫落細(xì)胞樣本，或者直接采用宮頸組織切片， 采用煮沸裂解法提取DNA，備用。本例分別提取了 HPV61、70、72、81和83 (MM7)五個分型的DNA 作為測試對象。并提取了專利申請?zhí)枮?01310041615.4的專利申請中記載的29種高危型 HPV 和低危型 HPV 的 DNA，分別為 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、6、11、26、 40、42、43、44、53、54、55、57、66、67、69、73、82。同時，提取了人基因組0魁作為對照。內(nèi)對照 采用人珠蛋白基因的Ll片段重組質(zhì)粒DNA，陰性對照為提取的未感染人乳頭癌病毒的人全 基因組DNA。
[0化2] 1.3引物和探針設(shè)計
[0化3] 本例冊V61、70、72、81和83(MM7)五個分型的基因組L1區(qū)的引物，W及人珠蛋白基 因引物都參考專利CN10：3409553A，HPV正向引物有四條，分別為Seq ID No.43、Seq ID No.44、Seq ID No.45、Seq ID No.46所示序列，HPV反向引物有五條分別為Seq ID No.47、 569 10齡.48、569 10齡.49、569 10齡.50、569 10齡.51所示序列，產(chǎn)生的？0?產(chǎn)物根據(jù) 各個型別的基因組序列，在164-173bp之間。人珠蛋白基因引物皿正向引物和皿反向引物分 別為Seq ID No.52和Seq ID No.53所示序列，詳見表1。
[0054] 本例的五個分型由于是在專利CN103409553A的基礎(chǔ)上繼續(xù)研究的，因此，沿用了 HPV基因組DNA的Ll區(qū)域保守區(qū)，針對該區(qū)域設(shè)計10條探針，每個分型各兩條探針，而引物則 沿用專利CN103409553A的PCR擴(kuò)增引物。同樣的，在所有反向引物的5'末端分別進(jìn)行生物素 標(biāo)記，探針的5 '端帶有氨基修飾。
[0化日]HPV61的兩條探針分別為Seq ID No.1所示序列和Seq ID No.2所示序列，HPV70的 兩條探針分別為Seq ID No.3所示序列和Seq ID No.4所示序列，HPV72的兩條探針分別為 Seq ID No.5所示序列和Seq ID No.6所示序列，HPV81的兩條探針分別為Seq ID No.7所示 序列和Seq ID No. 8所示序列，HPV83的兩條探針分別為Seq ID No. 9所示序列和Seq ID No. 10所示序列。
[0化6] 同時，合成了專利CN103409553A中記載的29種高危型HPV和低危型HPV的特異性檢 測探針。具體的，HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、6、11、26、40、42、43、44、 53、54、55、57、66、67、69、73、82共計二十九個分型的探針依序分別為SeqIDNo.l4所示序 列至Seq ID No.42所示序列。
[0化7] 此外，本例還合成了PCR內(nèi)對照探針皿probe、陰性質(zhì)控探針NC probe和陽性質(zhì)控 探針PC probe,PC probe為Seq ID No. 11 所示序列，NCprobe為Seq ID No. 12所示序列，皿 probe為Seq ID No. 13所示序列。
[0化引化值的計算使用Primer Express 3.0軟件，設(shè)計各探針的化值在55°C左右。
[0059] 表1引物及探針
[00621
[0063] 2、試驗方法
[0064] 2.1基因忍片制備 [00化]2.1.1微陣列設(shè)計
[0066] 本例的忍片基片結(jié)構(gòu)圖1所示，忍片基片分為HPV檢測區(qū)1、陽性質(zhì)控區(qū)2、陰性質(zhì)控 區(qū)3、PCR內(nèi)對照區(qū)4和定位區(qū)5。人乳頭瘤病毒特異性檢測探針固定于HPV檢測區(qū)1，陽性質(zhì)控 區(qū)2含有至少S個重復(fù)的陽性質(zhì)控探針PC probe的檢測點，定位區(qū)5含有至少S個重復(fù)的定 位點GP5,陰性質(zhì)控探針NC probe固定于陰性質(zhì)控區(qū)3，PCR內(nèi)對照探針皿probe固定于PCR 內(nèi)對照區(qū)4。每個樣品重復(fù)=個檢測點。在本例的一種實現(xiàn)方式中，在陰性質(zhì)控區(qū)3并排設(shè)置 若干個VE-空白質(zhì)控。本例的VE-空白質(zhì)控是直接點不含探針的點樣緩沖液，點樣緩沖液與 含探針的點樣緩沖液組分相同。
[0067] 本例的具體樣品排列矩陣采用34樣品（即34種HPV型別）陣列，如圖2所示，34種HPV 型別是專利CN103409553A中記載的29種高危型HPV和低危型HPV，加本例設(shè)計的5個型別的 HPV探針，共計34種人乳頭瘤病型別探針的樣品陣列。34種人乳頭瘤病具體包括HPV 16、18、 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、6、11、26、40、42、43、44、53、54、55、57、66、67、69、73、 82，^及冊￥61、70、72、81、83(匪7)。矩陣：（3義4)^0，行距:400皿，不同探針點間距:400^ m，S連點間距:400皿，點樣誤差:<200皿，點直徑：150皿。忍片寬度為:6400皿?；蛉唐?上角有3個重復(fù)點的陽性質(zhì)控點PC與右下角的3個重復(fù)點的定位點GP5為合格忍片必須顯色 點。VE-空白質(zhì)控及陰性質(zhì)控點NC為合格忍片不顯色點。PCR內(nèi)對照皿為判斷核酸擴(kuò)增PCR是 否正常的顯色點。
[006引 2.1.2點樣
[0069]按照圖2的設(shè)計，點樣制備％樣品陣列基因忍片，忍片的點樣流程如圖3所示，將 Pall Biodyne C膜剪裁為適當(dāng)大小，用抓C進(jìn)行前處理后，用O. IM的憐酸緩沖液(pH7.4)分 別配制569 10齡.1、569 10齡.3、569 10齡.5、569 10齡.7、569 10齡.9所示序列的探 針點樣液，W及專利CN103409553A中記載的29種高危型HPV和低危型HPV的29條探針的點樣 液，探針濃度在〇.2iiM-5iiM，使用化ath Digit2003生物忍片點樣儀將探針按照圖2的陣列和 要求進(jìn)行噴點，點樣液使用黃色染料來跟蹤判斷忍片矩陣每個探針點是否完整，沒有漏點。
[0070] 2.2PCR 擴(kuò)增
[0071] 本例的PCR反應(yīng)體系為，HPVPCR反應(yīng)液27.6化、Taq/UNG混合液0.化UDNA樣品化L。 HPVPCR反應(yīng)液中含有1沖CR Buffer、0.2測HPV正向引物、0.4測HPV反向引物。其中，HPV正 向引物即Seq ID No.43至Seq ID No.46所示序列的引物，HPV反向引物即Seq ID No.47至 Seq ID No.51所示序列的引物。
[0072] PCR反應(yīng)條件為，5〇1：2111111、95°(：1〇111111，然后進(jìn)入40個循環(huán)：951：3〇3日。、521： 45sec、65°C30sec，循環(huán)完成后 65°C5min。
[0073] 2.3基因忍片檢測
[0074] 2.3.1基因忍片雜交
[0075] 使用前將雜交質(zhì)控品加入變性液中，與變性液按1:30的稀釋配制。雜交質(zhì)控品是 與陽性質(zhì)控探針互補的5'-Biotin標(biāo)記人工合成DNA片段，雜交質(zhì)控品DNA片段為Seq ID No.54所示序列，可與陽性質(zhì)控探針特異性雜交結(jié)合，并在其后的顯色步驟中顯色。取PCR產(chǎn) 物加入30化含雜交質(zhì)控品的堿變性液中，進(jìn)行堿變性，變性時間為10分鐘;變性結(jié)束后加入 100化雜交中和液，雜交中和液為含6 X SSC、0.02M PB緩沖液、0.5 % BSA和0.5 % SDS的溶液； 雜交反應(yīng)在55 °C進(jìn)行30分鐘。
[0076] 2.3.2酶標(biāo)反應(yīng)和信號檢測
[0077] 本例采用的信號放大的方法包括（1)辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素介導(dǎo)的酶底物 放大反應(yīng)，作為酶底物的可W是TMB或POD; (2) W及由辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素介導(dǎo)的 化學(xué)發(fā)光信號放大系統(tǒng)，發(fā)光底物為魯米諾化uminol); (3)還包括堿性憐酸酶標(biāo)記的親和 素介導(dǎo)的底物放大反應(yīng)，所采用的底物為4-MUP或pNPP底物。具體內(nèi)容參見專利 CN10：M09553A。
[0078] 3、結(jié)果分析
[0079] 檢查確認(rèn)忍片孔內(nèi)基因忍片均為正位，用HPV分型基因忍片檢測閱讀系統(tǒng)對基因 忍片檢測并分析。本實施例的W3個點的信號同時判斷檢測結(jié)果，如果有一個點信號超限 (outlier),則舍棄該點，取另外2個點的平均值，如果S個點的信號沒有一個超限值，則取3 個點的信號平均值。
[0080] 檢測結(jié)果中，陽性質(zhì)控區(qū)2即PC點應(yīng)顯色，PCR內(nèi)對照區(qū)4即皿點應(yīng)顯色，定位區(qū)5即 GP5點應(yīng)顯色，陰性質(zhì)控區(qū)3即NC點應(yīng)不顯色，VE-空白質(zhì)控點應(yīng)不顯色。訓(xùn)月性對照品進(jìn)行 檢測，本例中，陰性對照品含有人基因組DNA，不含有任何型別的人乳頭癌病毒DNA，因此，除 PC、皿、GP5顯色W外，其它都不應(yīng)顯色，如圖4所示，圖4是試劑盒陰性對照品檢測的模擬圖； 檢測結(jié)果如圖5所示，圖5是試劑盒陰性對照品實際檢測的結(jié)果圖，可見，圖5所示的實際檢 測結(jié)果與預(yù)期的模擬圖4相符。W陽性對照品進(jìn)行檢測，本例中，陽性對照品含有HPV16型別 人乳頭癌病毒DNA和人基因組DNA，因此除PC、皿、GP5和HPV16顯色W外，其它都不應(yīng)顯色，如 圖6所示，圖6是試劑盒陽性對照品檢測的模擬圖;檢測結(jié)果如圖7所示，圖7是試劑盒陽性對 照品實際檢測的結(jié)果圖，可見，圖7所示的實際檢測結(jié)果與預(yù)期的模擬圖6相符。如果檢測結(jié) 果不符合上述質(zhì)控要求，則該次檢測結(jié)果無效。
[0081 ] 檢測結(jié)果INS的參考值為11.0。參考值的確定方法：統(tǒng)計HPV陰性標(biāo)本的檢測INS 值，按平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差確定參考值。HPV分型基因忍片檢測閱讀系統(tǒng)可自動檢測INS值，并 分析和報告結(jié)果，報告結(jié)果如下：
[0082] 1)INS<11.0:HPV 陰性；
[0083] 2)INS> 11.0:HPV 陽性
[0084] 并報告HPV型別，即本例的34種分型的檢測結(jié)果。
[0085] 檢測結(jié)果顯示，各個HPV分型DNA對應(yīng)的特異性檢測探針有信號反應(yīng)，而其它探針 則沒有信號反應(yīng)，可見34條探針沒有交叉反應(yīng)，并且具有良好的特異性。
[00化]此外，本例對HPV分型61、70、72、81、83(匪7)的另外五條探針也進(jìn)行了相應(yīng)的檢 ，結(jié)果顯示，本例的10條探針都能夠很好的用于HPV分型檢測，具有良好的特異性，并且與 其他探針沒有交叉反應(yīng)。
[0087] 本例按照圖2的微陣列結(jié)構(gòu)點樣后，另外，對多個分型的檢測進(jìn)行了試驗，例如將 多個樣品混合后一起進(jìn)行忍片雜交檢測。部分檢測結(jié)果如圖8和圖9所示，圖8為HPV 33和 HPV44兩個混合型別樣品的檢測結(jié)果圖，可見，在相應(yīng)的位置處都有明顯的顯色。圖9為 HPV16和HPV35兩個混合型別樣品的檢測結(jié)果圖，同樣的，在忍片點樣的16和35處可W看到 明顯的顯色。
[0088] 實施例二人乳頭癌病毒分型檢測試劑盒
[0089] 【產(chǎn)品名稱】通用名:人乳頭瘤病毒分型檢測試劑盒基因忍片法
[0090] 【包裝規(guī)格】48測試/盒
[0091] 【檢驗原理】
[0092] 本試劑盒采用基因忍片檢測技術(shù)。利用微量點樣技術(shù)，將HPV分型特異性檢測探針 點樣于基因忍片基片上，制成基因忍片;經(jīng)過對樣本中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、雜交和顯色，通 過HPV分型基因忍片檢測閱讀系統(tǒng)自動采集圖像并分析和報告檢測結(jié)果。試劑盒所采用的 基因忍片為實施例一所制備的34樣品陣列基因忍片。試劑盒的主要成份和檢測過程舉例如 下：
[0093] 【主要組成成份】
[0094] 本試劑盒由A盒和B盒組成，如表2所示;A盒包括5種PCR相關(guān)組份，B盒包括9種雜交 顯色相關(guān)組份。在有效期內(nèi)不同批號試劑盒中各組份可W互換。HPV的PCR反應(yīng)液中包含四 條HPV正向引物，即Seq ID No.43至Seq ID No.46所示序列，五條冊V反向引物，即Seq ID No.47至Seq ID No.51所示序列。正向引物和反向引物的比例為1:2(0.2測:0.4山〇為最佳， 能提高5'-Biotin標(biāo)記PCR產(chǎn)物的比率。利用簡并引物的原理，適當(dāng)降低復(fù)性溫度至52°C，使 所有34個型別HPV都能夠產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，從而能夠被實施例一所制備的基因忍片檢測。A盒還 包含雜交質(zhì)控品，為與陽性質(zhì)控探針互補的人工合成DNA片段，可與陽性質(zhì)控探針特異性結(jié) 合，并顯色。
[00M]表2試劑盒主要組成成份
[0096]
[0097]
[0098] 【儲存條件及有效期】
[0099] 1.儲存條件
[0100] A 盒-20°C 保存，B盒 2-8°C 保存。
[0101] A盒組份應(yīng)避免反復(fù)凍融，B盒內(nèi)的顯色液B應(yīng)避光保存。
[0102] 2.有效期
[0103] 未開封產(chǎn)品有效期為12個月。
[0104] 已開封產(chǎn)品建議1個月內(nèi)用完。
[0105] 【適用儀器】
[0106] 普通PCR擴(kuò)增儀，HPV分型基因忍片檢測閱讀系統(tǒng)。
[0107] 【樣本要求】
[0108] 標(biāo)本類型生殖道脫落細(xì)胞，如宮頸口、尿道口等部位脫落細(xì)胞。
[0109] 將采樣棉拭子或?qū)m頸刷浸入盛有ImL無菌生理鹽水的樣本管中，充分漂洗。將棉拭 子或?qū)m頸刷貼壁擠干后丟棄，立即送檢。
[0110] 標(biāo)本保存采集的標(biāo)本應(yīng)盡快送檢，建議標(biāo)本4 °C保存不超過24小時，-20°c保存不 超過6個月，需要長期保存的標(biāo)本應(yīng)置于-70°C保存，避免多次凍融。
[0111] 已經(jīng)提取好的樣本DNA，可直接進(jìn)入如下2.1的步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0112] 【檢驗方法】
[0113] 1.樣本處理
[0114] 1.1標(biāo)本預(yù)處理
[0115] 取出待處理標(biāo)本，振蕩混勻；置離屯、機中W13 0(K)rpm離屯、5分鐘；棄上清，保留沉 淀物。-20°C保存的標(biāo)本，應(yīng)置室溫自然解凍后再使用。
[0116] 1.2DNA 提取
[0117] 1.2.1準(zhǔn)備2個離屯、管，分別加入陰性對照和陽性對照各化1。
[011引 1.2.2分別向上述對照品管及1.1項標(biāo)本管加入SOiil HPV DNA提取液，振蕩混勻； 然后沸水浴或干浴10分鐘。
[0119] 1.2.3將上述樣本管置離屯、機中，13 OOOrpm離屯、10分鐘，保留上清液(DNA樣品）， 備用。
[0120] 1.3DNA樣品保存
[0121] 建議DNA樣品立即用于PCR檢測，否則4°C保存；當(dāng)天不檢測的樣品，-20°C保存。
[0122] 2. PCR 擴(kuò)增
[0123] 2. IPCR反應(yīng)混合液配制
[0124] 根據(jù)待檢測總樣本數(shù)，包括對照品和臨床標(biāo)本，表3，配制PCR反應(yīng)混合液。
[0125] 實際計算用量時應(yīng)計入損耗量。
[01%]將PCR反應(yīng)混合液混勻并短暫離屯、后，按每管2祉1分裝至各PCR反應(yīng)管中。
[0127]表3 PCR反應(yīng)混合液配制 「rnool LOl 29 J 2.2 加巧
[0130] 取化1待測DNA樣品分別加至上述PCR反應(yīng)管中。蓋緊管蓋，混勻并短暫離屯、，立即 用于檢測。-20°C保存的DNA樣品，應(yīng)在用前取出，置室溫自然解凍并混勻后，13 O(K)巧m離屯、 1分鐘，取上清用于檢測。
[0131] 2.3PCR 擴(kuò)增
[0132] 將待檢測反應(yīng)管小屯、置于PCR擴(kuò)增儀中，按表4要求設(shè)置PCR擴(kuò)增參數(shù)。
[0133] 表4 PCR擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置
[0134]
[0135] 3. DNA雜交
[0136] 3.1準(zhǔn)備
[0137] 3.1.1準(zhǔn)備試劑
[013引將雜交中和液及洗液B置55 °C預(yù)熱。
[0139] 3.1.2準(zhǔn)備濕盒
[0140]建議制作方法：用適當(dāng)大小，不小于20cm X 15cm X IOcm,的帶蓋塑料盒，內(nèi)置吸水 紙，加水浸濕，W無流動水為宜，55°C預(yù)熱。
[0141] 注意:在基因忍片的溫育操作中必須用濕盒保濕，切忌濕盒干燥。
[0142] 3.1.3基因忍片定位
[0143] 小屯、轉(zhuǎn)移基因忍片至96孔板內(nèi)，按正位擺放在忍片孔內(nèi)。正位指忍片水平放置、定 位點正對孔內(nèi)左下角。忍片孔指已定位忍片的孔位。轉(zhuǎn)移忍片時應(yīng)避免器械接觸忍片中屯、 區(qū)及污損忍片。
[0144] 3.2預(yù)雜交
[0145] 向各忍片孔中加入10化L洗液B，55 °C溫育15分鐘;吸干孔內(nèi)液體。
[0146] 3.3 變性
[0147] 使用前將雜交質(zhì)控品加入變性液中，雜交質(zhì)控品與變性液按1:30的比例稀釋配 審Ij。取30iiL含有雜交質(zhì)控品的變性液加至PCR產(chǎn)物管中，輕微搖動混勻，靜置10分鐘。
[014引 3.4中和與雜交
[0149] 向各忍片孔中分別加入10化L雜交中和液和變性的PCR產(chǎn)物，約60化，輕微搖動混 勻。55 °C溫育30分鐘，吸干孔內(nèi)液體。
[0150] 3.5 清洗
[0151] 向各忍片孔中加入15化L洗液B，輕微搖動漂洗3分鐘，吸干孔內(nèi)液體;重復(fù)2次。
[0152] 注意:應(yīng)使忍片孔內(nèi)溫度不低于20°C，否則影響清洗效果。
[0153] 4.顯色
[0154] 4.1準(zhǔn)備試劑
[0155] 4.1.1將洗液A和顯色液B置37 °C預(yù)熱。
[0156] 4.1.2配制酶標(biāo)工作液
[0157] 按表5要求，用洗液A將酶標(biāo)原液稀釋為酶標(biāo)工作液，配制方法見表5。
[0158] 實際計算用量時應(yīng)計入損耗量。
[0159] 表5配制酶標(biāo)工作液
[0160]
[0161]
[0162] 4.2 酶標(biāo)
[01創(chuàng)取100化酶標(biāo)工作液，加至3.5項的忍片孔內(nèi)，37 °C溫育30分鐘;吸干孔內(nèi)液體。
[0164] 4.3 清洗
[0165] 加入15化L洗液A，輕微搖動漂洗3分鐘，吸干孔內(nèi)液體;重復(fù)1次。加入15化L洗液C， 輕微搖動漂洗3分鐘，吸干孔內(nèi)液體。
[0166] 應(yīng)使忍片孔內(nèi)溫度不低于20°C，否則影響清洗效果。
[0167] 4.4 顯色
[0168] 分別加入50化顯色液A和50化顯色液B，輕微搖動混勻，室溫顯色5分鐘。吸干孔內(nèi) 液體，加入15化L洗液C，靜置約1分鐘，吸干孔內(nèi)液體。
[0169] 4.5 風(fēng)干
[0170] 45 °C風(fēng)干。注意:請確認(rèn)風(fēng)干后檢測。
[0171] 5.檢測與分析
[0172] 檢查確認(rèn)忍片孔內(nèi)基因忍片均為正位，用HPV分型基因忍片檢測閱讀系統(tǒng)對基因 忍片檢測并分析。
[0173] 【參考值】
[0174] 檢測結(jié)果(INS)的參考值為11.0。
[0175] 參考值的確定方法:統(tǒng)計HPV陰性標(biāo)本的檢測INS值，按平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差確定參 考值。
[0176] 【檢驗結(jié)果的解釋】
[0177] 1.質(zhì)量控制
[017引1.1基因忍片點陣說明
[0179] 基因忍片的探針點陣共包括117個點。點陣模式圖見圖2,基因忍片點陣說明見表 6。
[0180] 表6基因忍片點陣說明 [01811
「01821
[0183] 1.2質(zhì)控品檢測結(jié)果
[0184] 1)試劑盒陰性對照品檢測結(jié)果應(yīng)為HPV陰性并且3個皿點陽性，3個PC點顯色，3個 GP5點顯色；
[0185] 2)試劑盒陽性對照品結(jié)果應(yīng)為冊V16型陽性并且3個皿點陽性，3個PC點顯色，3個 GP5點顯色；
[0186] 如果檢測結(jié)果不符合上述要求，則本次檢測結(jié)果無效。
[0187] 1.3質(zhì)控品異常分析及處理
[0188] 1)3個陽性質(zhì)控點（PC)中一個或多個缺失或者不顯色，檢測結(jié)果無效，應(yīng)重新檢 測。
[0189] 2)標(biāo)本的檢測結(jié)果中，如果3個PC點和3個定位點正常而皿點和所有HPV檢測點均 為陰性，表明樣本中可能含有PCR抑制成分，應(yīng)將原DNA樣品適當(dāng)稀釋后再檢測。
[0190] 3)如試劑盒陰性對照品或陽性對照品的檢測結(jié)果不符合1.2的質(zhì)控要求，應(yīng)檢查 操作或試劑是否正常。
[0191] 2.結(jié)果判斷
[0192] HPV分型基因忍片檢測閱讀系統(tǒng)可自動檢測INS值，并分析和報告結(jié)果，報告結(jié)果
[0193] 如下；
[0194] 1)INS<11.0:HPV 陰性；
[0195] 2)INSM1.0:HPV 陽性，并報告 HPV 型別。
[0196] W上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本申請所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本申 請的具體實施只局限于運些說明。對于本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫 離本申請構(gòu)思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本申請的保護(hù) 范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種高通量檢測人乳頭癌病毒分型的基因芯片，其特征在于:包括芯片基片，和固定 于芯片基片上的探針，所述探針包括分別與人乳頭癌病毒61、70、72、81和83型的核苷酸雜 交的特異性檢測探針，與人乳頭癌病毒61型雜交的特異性檢測探針為Seq ID No.1所示序 列和/或Seq ID No. 2所示序列，與人乳頭癌病毒70型雜交的特異性檢測探針為Seq ID No.3所示序列和/或Seq ID No.4所示序列，與人乳頭癌病毒72型雜交的特異性檢測探針為 Seq ID No.5所示序列和/或Seq ID No.6所示序列，與人乳頭癌病毒81型雜交的特異性檢 測探針為Seq ID No.7所示序列和/或Seq ID No.8所示序列，與人乳頭癌病毒83型雜交的 特異性檢測探針為Seq ID No.9所示序列和/或Seq ID No. 10所示序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于:所述探針還包括陽性質(zhì)控探針、陰性 質(zhì)控探針和PCR內(nèi)對照探針;所述陽性質(zhì)控探針為Seq ID No.11所示序列，所述陰性質(zhì)控探 針為Seq ID No. 12所示序列，所述PCR內(nèi)對照探針為Seq ID No. 13所示序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因芯片，其特征在于：所述芯片基片分為HPV檢測區(qū)（1 )、陽 性質(zhì)控區(qū)（2)、陰性質(zhì)控區(qū)⑶、PCR內(nèi)對照區(qū)⑷和定位區(qū)（5);所述HPV檢測區(qū)（1)固定有用 于樣品檢測的人乳頭瘤病毒特異性檢測探針，所述陽性質(zhì)控區(qū)（2)含有至少三個并排重復(fù) 的陽性質(zhì)控探針的檢測點，所述定位區(qū)（5)含有至少三個并排重復(fù)的定位點，所述陰性質(zhì)控 區(qū)（3)含有至少三個并排重復(fù)的陰性質(zhì)控探針的檢測點，所述PCR內(nèi)對照區(qū)（4)含有至少三 個并排重復(fù)的PCR內(nèi)對照探針的檢測點。4. 一種高通量檢測人乳頭癌病毒分型的基因芯片，其特征在于:包括芯片基片，和固定 于芯片基片上的檢測探針，所述檢測探針包括分別與34種型別的人乳頭癌病毒核苷酸雜交 的型特異性雜交檢測探針，所述型特異性雜交檢測探針為Seq ID No. 1所示序列和/或Seq ID No.2所示序列的特異性雜交探針、Seq ID No.3所示序列和/或Seq ID No.4所示序列的 特異性雜交探針、Seq ID No.5所示序列和/或Seq ID No.6所示序列的特異性雜交探針、 Seq ID No.7所示序列和/或Seq ID No.8所示序列的特異性雜交探針、Seq ID No.9所示序 列和/或Seq ID No. 10所示序列的特異性雜交探針，以及Seq ID No. 14所示序列至Seq ID No. 42所示序列的特異性雜交探針。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因芯片，其特征在于:所述探針還包括陽性質(zhì)控探針、陰性 質(zhì)控探針和PCR內(nèi)對照探針;所述陽性質(zhì)控探針為Seq ID No.11所示序列，所述陰性質(zhì)控探 針為Seq ID No. 12所示序列，所述PCR內(nèi)對照探針為Seq ID No. 13所示序列。6. -種用于高通量檢測人乳頭癌病毒分型的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中包含 有權(quán)利要求1-5任一項所述的基因芯片。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還包含有人乳頭癌病毒 DNA提取試劑、PCR擴(kuò)增試劑、雜交試劑和顯色試劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還包含陽性對照品和陰性 對照品，以及雜交質(zhì)控品，所述陽性對照品和陰性對照品均含有人基因組DNA，所述雜交質(zhì) 控品為5'-Biotin標(biāo)記的人工合成核苷酸片段，所述雜交質(zhì)控品為Seq ID No.54所示序列。9. 一種用于高通量檢測人乳頭癌病毒分型的探針，其特征在于:所述探針包括分別與 34種型別的人乳頭癌病毒核苷酸雜交的特異性雜交探針，所述探針包括Seq ID No.1所示 序列和/或Seq ID No.2所示序列的特異性雜交探針、Seq ID No.3所示序列和/或Seq ID No.4所示序列的特異性雜交探針、Seq ID No.5所示序列和/或Seq ID No.6所示序列的特 異性雜交探針、Seq ID No.7所示序列和/或Seq ID No.8所示序列的特異性雜交探針、Seq ID No.9所示序列和/或Seq ID No. 10所示序列的特異性雜交探針，以及Seq ID No. 14所示 序列至Seq ID No.42所示序列的特異性雜交探針。10. -種用于高通量檢測人乳頭癌病毒分型的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中含有 權(quán)利要求9所述的探針。
【文檔編號】C12N15/11GK105861750SQ201610309281
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月11日
【發(fā)明人】黃明輝, 黃鶴, 李勐, 趙雷
【申請人】港龍生物技術(shù)（深圳）有限公司