專利名稱：一種從發(fā)酵液中快速提取飼用抗菌肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物抗菌肽的快速分離制備方法，尤其是涉及一種利用麩皮做為吸附劑和飼用載體從微生物的發(fā)酵液中提取抗菌肽的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗菌肽(Antimicrobial peptide,AMP)是生物產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，多數(shù)具有安全性高、抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性高的特點。近年來，微生物來源的抗菌肽受到人們的極大關(guān)注，特別是乳酸菌、芽孢桿菌和側(cè)孢短芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽對食源性的致病菌和腐敗菌有高效的抗菌活性，可以被人體消化道蛋白酶分解，是對人體無毒的天然生物防腐劑，已廣泛應(yīng)用于食品和飼料工業(yè)。低成本的大規(guī)模提取方法是實現(xiàn)抗菌肽工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵，也是目前制約抗菌肽市場競爭力的主要因素。從發(fā)酵液中提取抗菌肽的傳統(tǒng)方法有硫酸銨沉淀、有機溶劑沉淀和真空濃縮等手段，如細菌素提取的第一步普遍使用硫酸銨沉淀，但是這些傳統(tǒng)方法通常存在回收率低、時間長、污染大等缺點，很難實現(xiàn)大規(guī)模制備。因此，自1944年在乳酸乳球菌的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)乳酸鏈菌肽(Nisin)以來，人們一直努力尋找從微生物發(fā)酵液中提取抗菌肽的可行方法。近年來，國內(nèi)外的研究者們積極探索用吸附劑吸附提取抗菌肽的方法進行抗菌肽的大規(guī)模制備。1992年，美國懷俄明大學(xué)Yang等人報道了一種簡便的細菌素分離純化方法，該方法先將發(fā)酵液PH調(diào)至5. 5，部分抗菌肽吸附到菌體細胞上，然后降低pH使抗菌肽從菌體細胞上解離。然而，研究者陸續(xù)報道僅僅使用菌體本身來進行吸附和解吸，吸附和解吸效率都很低，如乳酸鏈球菌肽總收率只有10%。1996年，Coventry等人用商品名“Micro-Cel”的硅酸鈣抗粘劑從乳酸菌的發(fā)酵液中吸附抗菌肽，但是該方法得到的抗菌肽-吸附復(fù)合物解吸附非常困難，即使在PHI. 0-12. 0的范圍內(nèi)都不能將抗菌肽解離下來， 只有的十二烷基磺酸鈉(SDQ可以解吸附。然而，SDS是一種去垢劑，用此法制備的抗菌肽不宜在食品中使用。1998年，Janes等人用硅酸和稻殼灰作為吸附劑從乳酸菌的發(fā)酵液中提取并濃縮抗菌肽，同樣，使用硅酸作為吸附劑得到的吸附復(fù)合物解吸附也非常困難， 實際他們采用的技術(shù)路線是，濃縮這一步驟是通過冷凍干燥達到的。而冷凍干燥步驟之前是采用了 22100g的低溫高速離心除菌，其解吸附過程又必須在4°C以下攪拌過夜，該方法的主要缺陷在于技術(shù)要求苛刻，成本較高，不適宜用于大規(guī)模的生產(chǎn)。國內(nèi)關(guān)于抗菌肽的后提取研究工作中，還連棟等人2003年專利報道先將乳酸鏈球菌肽發(fā)酵液高溫滅活菌體后用硅藻土等吸附劑進行吸附，然后用聚乙二醇和氯化鈉水溶液進行解吸，但該專利沒有報道解吸附后如何去除表面活性劑聚乙二醇的方法。莊緒亮等人2006年專利報道了一種解吸并回收乳酸鏈球菌肽的新方法，它將表面活性劑解吸和納濾方法相結(jié)合，即先調(diào)節(jié)吸附混合液的PH、裝解吸柱、表面活性劑解吸附、然后采用納濾的方法將溶液中的表面活性劑SDS去除，在去除SDS的同時將含有Msin的溶液濃縮，濃縮液再采用噴霧干燥方法制成干粉，最終回收生物防腐劑乳酸鏈球菌肽。
另一方面，采用的策略是將發(fā)酵液中的抗菌肽吸附在食品級吸附劑表面，不進行解吸附而直接應(yīng)用于食品保藏。如1996年曾報道將抗菌肽吸附在食品級表面；2010年曾有報道將細菌素吸附在兩種食品級的吸附劑上。然而，食品級吸附劑價格較為昂貴，難以規(guī)?；a(chǎn)，到目前為止國內(nèi)外還沒有報道采用吸附劑將抗菌肽吸附在飼料上。綜上所述，當(dāng)前使用的吸附-解吸附制備方法沒有涉及將抗菌肽吸附在飼用載體上直接發(fā)揮抗菌作用并延長保藏期，吸附提取抗菌肽的方法較為繁瑣，成本較高，或產(chǎn)品中含有不易去除的化學(xué)物質(zhì)，從而難以大規(guī)模推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用麩皮作為載體從微生物發(fā)酵液中快速分離提取抗菌肽的方法。針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究和實驗，創(chuàng)造出本發(fā)明的技術(shù)方案。發(fā)明人尋找到具有吸附能力的飼用載體，研究了抗菌肽與飼用載體的吸附作用及抗菌活性。本發(fā)明的技術(shù)方案為采用殺菌釋放抗菌肽、麩皮吸附、過濾、干燥以及包裝的技術(shù)路線，從而實現(xiàn)從微生物發(fā)酵液中快速提取出抗菌肽。本發(fā)明提供的一種從微生物發(fā)酵液中快速提取飼用抗菌肽的方法，包含以下步驟1)對發(fā)酵液進行處理，殺菌釋放抗菌肽；2)加入麩皮，以麩皮為吸附劑和載體進行麩皮吸附；3)過濾，收集過濾物即得飼用抗菌肽。還包括將過濾物干燥，真空包裝。其中步驟1)所述的發(fā)酵液處理是將發(fā)酵液用酸調(diào)pH至3-6，121 °C加熱 15-30min,殺死產(chǎn)生菌并使抗菌肽完全從菌體釋放到發(fā)酵液中。其中步驟2)所述加入麩皮的量為發(fā)酵液體積的4% -10%，吸附溫度30-50°C， 100-200r/min攪拌15-60min，使抗菌肽充分吸附在麩皮表面，制成抗菌肽-麩皮的復(fù)合物。步驟幻所述的過濾為用紗布或濾網(wǎng)過濾，棄去液體，收集抗菌肽-麩皮復(fù)合物。所述濾網(wǎng)為50目。所述的干燥是將抗菌肽-麩皮復(fù)合物平鋪后進行干燥，采用自然晾干或40-70°C 熱風(fēng)干燥。本發(fā)明提供的一種從微生物發(fā)酵液中快速提取飼用抗菌肽的方法由以下步驟組成(1)對發(fā)酵液進行處理，釋放出抗菌肽將微生物發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液用酸調(diào)PH至 3-6，121°C加熱15min，殺死產(chǎn)生菌并使抗菌肽完全從菌體釋放到發(fā)酵液中；(2)麩皮吸附加入發(fā)酵液體積4% -10%的麩皮進行吸附，吸附溫度30-50°C， 100-200r/min攪拌15-60min，使得抗菌肽充分吸附在麩皮表面，制成抗菌肽_麩皮的復(fù)合物；(3)過濾用紗布或濾網(wǎng)過濾，棄去液體，收集抗菌肽-麩皮復(fù)合物；(4)干燥將抗菌肽-麩皮復(fù)合物平鋪后進行干燥，采用自然晾干或40_70°C熱風(fēng)干燥；(5)真空包裝將干燥后的麩皮復(fù)合物進行真空包裝，即得到吸附態(tài)的飼料級抗菌肽產(chǎn)品。本發(fā)明的吸附劑為麩皮，類型有大片或小片狀。利用本發(fā)明的提取抗菌肽的方法從側(cè)芽孢桿菌(Brevihcillus laterosporu)發(fā)酵液中提取到飼料級的抗菌肽。本發(fā)明提供的方法所得到的抗菌肽能夠用于制備生物防腐劑。本發(fā)明提供的方法所得到的抗菌肽能夠用于制備飼料。 本發(fā)明提供的方法所得到的抗菌肽能夠用于制備飼料添加劑。本發(fā)明提供的從發(fā)酵液中快速提取抗菌肽的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)的弊端，使用低成本的吸附劑麩皮，將抗菌肽直接吸附在麩皮上，其吸附率高達80% _90%，達到利用廉價的吸附劑從微生物發(fā)酵液中制備抗菌肽的目的，在獲得抗菌肽高回收率的同時實現(xiàn)高抗菌活力和延長了保藏期。本發(fā)明方法提取工藝簡單、綠色環(huán)保、成本低廉、縮短時間，該方法制備出安全、穩(wěn)定的固態(tài)抗菌肽產(chǎn)品，可廣泛應(yīng)用于飼料工業(yè)，為抗菌肽的大規(guī)模制備提供了一種新方法，具有更廣泛及實用的經(jīng)濟效果。


圖1是本發(fā)明工藝流程示意圖；圖2是本發(fā)明產(chǎn)品的抗菌活性圖，圖中1為麩皮，2為抗菌肽-麩皮復(fù)合物；左圖為4°C條件下保藏7天的抗菌活性實驗，右圖為4°C條件下保藏42天的抗菌活性實驗。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段， 實施例中，加入的各原料除特別說明外，均為市售。實施例1從側(cè)孢短芽孢桿菌ASl. 2738的發(fā)酵液中提取抗菌肽，獲得飼料級抗菌肽產(chǎn)品，步驟如下(1)殺菌釋放抗菌肽將微生物發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液用酸調(diào)pH至3，121 °C加熱 15min，殺死產(chǎn)生菌、滅活蛋白酶、沉淀雜蛋白并使抗菌肽完全從菌體釋放到發(fā)酵液中。(2)麩皮吸附加入發(fā)酵液體積4%的麩皮進行吸附，吸附溫度30°C，100r/min攪拌15min，使得抗菌肽充分吸附在麩皮表面，制成抗菌肽-麩皮的復(fù)合物。(3)過濾50目濾網(wǎng)過濾，棄去液體，收集抗菌肽-麩皮復(fù)合物。(4)干燥將抗菌肽-麩皮復(fù)合物平鋪后進行干燥，可采用自然晾干或40°C熱風(fēng)干
O(5)真空包裝將干燥后的麩皮復(fù)合物進行真空包裝，即得到吸附態(tài)的飼料級抗菌肽產(chǎn)品。
本發(fā)明的方法中，對實施例1流程中麩皮吸附抗菌肽的吸附率進行測定，結(jié)果顯示吸附率為80%。實施例2從側(cè)飽短芽孢桿菌ASl. 2739的發(fā)酵液中提取抗菌肽，獲得飼料級抗菌肽產(chǎn)品，具體步驟如下(1)殺菌釋放抗菌肽將微生物發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液用酸調(diào)pH至5，121 °C加熱 30min，殺死產(chǎn)生菌、滅活蛋白酶、沉淀雜蛋白并使抗菌肽完全從菌體釋放到發(fā)酵液中。(2)麩皮吸附加入發(fā)酵液體積7%的麩皮進行吸附，吸附溫度40°C，150r/min攪拌30min，使得抗菌肽充分吸附在麩皮表面，制成抗菌肽-麩皮的復(fù)合物。(3)過濾用紗布或濾布過濾，棄去液體，收集抗菌肽-麩皮復(fù)合物。(4)干燥將抗菌肽-麩皮復(fù)合物平鋪后進行干燥，可采用自然晾干或55°C熱風(fēng)干
O(5)真空包裝將干燥后的麩皮復(fù)合物進行真空包裝，即得到吸附態(tài)的飼料級抗菌肽產(chǎn)品。本發(fā)明的方法中，對實施例1流程中麩皮吸附抗菌肽的吸附率進行測定，結(jié)果顯示吸附率為90%。實施例3從側(cè)孢短芽孢桿菌ASl. 864的發(fā)酵液中提取抗菌肽，獲得飼料級抗菌肽產(chǎn)品，步驟如下(1)殺菌釋放抗菌肽將微生物發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液用酸調(diào)pH至6，121 °C加熱 20min，殺死產(chǎn)生菌、滅活蛋白酶、沉淀雜蛋白并使抗菌肽完全從菌體釋放到發(fā)酵液中。(2)麩皮吸附加入發(fā)酵液體積10%的麩皮進行吸附，吸附溫度50°C，200r/min攪拌60min，使得抗菌肽充分吸附在麩皮表面，制成抗菌肽-麩皮的復(fù)合物。(3)過濾用紗布或濾布過濾，棄去液體，收集抗菌肽-麩皮復(fù)合物。(4)干燥將抗菌肽-麩皮復(fù)合物平鋪后進行干燥，可采用自然晾干或70°C熱風(fēng)干
O(5)真空包裝將干燥后的麩皮復(fù)合物進行真空包裝，即得到吸附態(tài)的飼料級抗菌肽產(chǎn)品。本發(fā)明的方法中，對實施例1流程中麩皮吸附抗菌肽的吸附率進行測定，結(jié)果顯示吸附率為接近97%。實施例4抗菌肽的確定采用國際公認的“蛋白酶敏感法”，將實施例1-3獲得的發(fā)酵液分別進行如下處理l、10000rpm離心15min去除菌體得到上清液，然后經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾除確保去除菌體；2、將上清液pH調(diào)至6. 5以排除有機酸的作用；3、取等量樣液，分別與IOmg/ mL的蛋白酶(胃蛋白酶、蛋白酶E、胰蛋白酶、蛋白酶K)溶液1 1體積混合，在37°C恒溫水浴鍋中反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后100°C沸水浴中煮沸5min滅酶；4、分別取蛋白酶處理前后的樣品，用瓊脂擴散法測定抑菌圈直徑，并進行比較。結(jié)果表明發(fā)酵液對蛋白酶E和胃蛋白酶敏感，抑菌圈直徑分別減小至8. 0和14. 0mm，特別是經(jīng)蛋白酶E處理后抑菌活性完全損失，這表明實施例1-3制得的該物質(zhì)為抗菌肽。
實施例5保藏期實驗將實施例1-3制得的飼用抗菌肽分別在4°C條件下保藏6周，在保藏第7天和第 42天分別取出0. 05g麩皮態(tài)產(chǎn)品，采用瓊脂擴散法檢測其抑菌活性，37°C恒溫靜置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，觀察抑菌圈變化情況。，結(jié)果見附圖2所示，保藏42天的產(chǎn)品和保藏第7天相比，抑菌圈直徑基本相同，可見麩皮態(tài)抗菌肽的抗菌效果未見明顯下降。因此，本發(fā)明獲得的飼用抗菌肽產(chǎn)品不僅有較高的抗菌活性，并且能夠保持較長的保藏期。實施例6抑菌效果實驗將實施例3制得的飼料級抗菌肽進行抑菌實驗，采用瓊脂擴散法測定抗菌肽產(chǎn)品的抑菌譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的飼用抗菌肽產(chǎn)品——麩皮吸附態(tài)抗菌肽具有較高的抗菌活性，不僅能抑制革蘭氏陽性菌，如金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、單核增生李斯特氏菌、 藤黃微球菌、乳酸乳球菌等，而且對革蘭氏陰性菌如沙門氏菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌其均有較好的抑菌效果。實驗結(jié)果證明本發(fā)明獲得的飼用抗菌肽產(chǎn)品具有較高的抗菌活性， 對多種食源性腐敗菌和致病菌有顯著的抑菌效果。表1麩皮吸附態(tài)抗菌肽的抑菌譜
_指示菌_抑菌效果
金黃色葡萄球菌++++
蠟樣芽孢桿菌++++
藤黃微球菌++++乳酸乳球菌+++
單核細胞增生李斯特菌 ++++ 沙門氏菌 ++++ 大腸桿菌 +++ 銅綠假單胞菌_++++注“++++”表示抑菌圈直徑大于20mm ;“+++”表示抑菌圈直徑大于15mm小于 20mmo實施例7飼用效果實驗將實施例1-3制得的飼用抗菌肽用于肉雞的飼養(yǎng)，添加方法見表2所示，結(jié)果表明肉雞飼喂30天后，添加抗菌肽產(chǎn)品的低劑量組和高劑量組和沒有添加抗菌肽的對照組相比，存活率分別提高5%、10% ；體重普遍增加，并且高劑量組大于低劑量組(和對照相比， 低劑量組平均增重69g，增重率為5. 高劑量組平均增重210g，增重率為15. 95% )。這表明飼用抗菌肽安全性高，并且對肉雞有促生長的效果。表2飼用抗菌肽用于肉雞飼料的添加方法
權(quán)利要求
1.一種從微生物發(fā)酵液中快速提取飼用抗菌肽的方法，其特征在于包含以下步驟1)對發(fā)酵液進行處理，使抗菌肽從菌體中釋放出來；2)加入麩皮，以麩皮為吸附劑和載體進行麩皮吸附；3)過濾，收集過濾物即得飼用抗菌肽。
2.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，還包括將過濾物干燥，真空包裝。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的發(fā)酵液處理是將發(fā)酵液用酸調(diào)PH至3-6，121°C加熱15-30min，殺死產(chǎn)生菌并使抗菌肽完全從菌體釋放到發(fā)酵液中。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟2)所述加入麩皮的量為發(fā)酵液體積的4% -10%,吸附溫度30-50°C，100-200r/min攪拌15-60min，使抗菌肽充分吸附在麩皮表面，制成抗菌肽-麩皮的復(fù)合物。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的過濾為用紗布或濾網(wǎng)過濾，棄去液體，收集抗菌肽-麩皮復(fù)合物。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的干燥是將抗菌肽-麩皮復(fù)合物平鋪后進行干燥，采用自然晾干或40-70°C熱風(fēng)干燥。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，由以下步驟組成(1)對發(fā)酵液進行處理，釋放出抗菌肽將微生物發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液用酸調(diào)pH至3-6，121°C加熱15min，殺死產(chǎn)生菌并使抗菌肽完全從菌體釋放到發(fā)酵液中；(2)麩皮吸附加入發(fā)酵液體積4-10%的麩皮進行吸附，吸附溫度30-50°C，100-200r/min攪拌15-60min，使得抗菌肽充分吸附在麩皮表面，制成抗菌肽_麩皮的復(fù)合物；(3)過濾用紗布或濾網(wǎng)過濾，棄去液體，收集抗菌肽-麩皮復(fù)合物；(4)干燥將抗菌肽-麩皮復(fù)合物平鋪后進行干燥，采用自然晾干或40-70°C熱風(fēng)干燥；(5)真空包裝將干燥后的麩皮復(fù)合物進行真空包裝，即得到吸附態(tài)的飼料級抗菌肽女口廣 PFt ο
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的方法所得到的抗菌肽。
9.權(quán)利要求8所述的抗菌肽在制備生物防腐劑中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求8所述的抗菌肽在制備飼料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從發(fā)酵液中快速分離制備飼用抗菌肽的方法，采用殺菌釋放抗菌肽、麩皮吸附、過濾、干燥以及包裝的方法，從微生物的發(fā)酵液中快速提取抗菌肽，獲得飼料級抗菌肽生物防腐劑產(chǎn)品。本發(fā)明利用廉價的麩皮作為吸附劑或載體，提取快速，回收率高，且可同時實現(xiàn)高抗菌活性和長保藏期，工藝簡單、成本低廉、快速省時，制備出安全、穩(wěn)定的飼用抗菌肽生物防腐劑。
文檔編號A23L3/3526GK102558294SQ20121001995
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月21日
發(fā)明者李興峰, 王志新, 賈英民 申請人:河北科技大學(xué)