一種蠅蛆抗菌肽、編碼基因、載體、工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗菌肽及其應(yīng)用，特別涉及一種蠅蛆抗菌肽、表達(dá)抗菌肽的食品 級(jí)重組乳酸菌及其制備抗菌添加劑中的應(yīng)用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 抗菌肽(antibacterial peptides)是生物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類(lèi)抵抗外界病原體 感染的多肽，它除具有非特異性的抵抗細(xì)菌、真菌、病毒等病原體外，還有抗腫瘤細(xì)胞的作 用，特別對(duì)多重耐藥菌和腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，而不破壞人體的正常細(xì)胞，是一類(lèi)具有巨大 發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕帯？咕倪@類(lèi)活性多肽具有免疫原性小、熱穩(wěn)定性好、水溶性好、抗 菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)。已有研究表明，在動(dòng)物日糧中添加抗菌肽能夠提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能和飼料 利用率、改善動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)動(dòng)物的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，提高動(dòng)物的免疫機(jī)能 與抗病力。此外，在飼料中添加抗菌肽，可以取代抗生素，消除抗生素的過(guò)度使用導(dǎo)致致病 菌產(chǎn)生耐藥性和農(nóng)產(chǎn)品抗生素殘留的問(wèn)題。
[0003] 蠅及幼蟲(chóng)蛆主要生長(zhǎng)在腐物、糞便和垃圾等含有大量細(xì)菌的惡劣環(huán)境中，其體表 帶有許多病原菌，能傳播多種疾病，但其自身卻不會(huì)因?yàn)楦腥静≡鹚劳?，這說(shuō)明蠅 應(yīng)該對(duì)病原微生物有強(qiáng)大的免疫力，并能產(chǎn)生強(qiáng)效抗菌物質(zhì)。這種物質(zhì)就是蠅蛆抗菌肽。 [0004]蠅蛆抗菌肽是蠅蛆經(jīng)過(guò)病原菌誘導(dǎo)后而產(chǎn)生的一系列具有抗菌活性的弱酸性多 肽物質(zhì)，熱穩(wěn)定高，其分子量通常在5-10kDa。蠅蛆抗菌肽不僅具有殺滅細(xì)菌的功能，還具有 抵抗真菌等微生物的功能，甚至病毒、真菌、藻類(lèi)、原蟲(chóng)及寄生蟲(chóng)，甚至腫瘤等都具有抑制或 殺滅作用。
[0005] 蠅蛆抗菌肽是一系列多種抗菌肽的混合物，單獨(dú)純化其中一種抗菌肽極其困難。 目前其生產(chǎn)和提取主要依賴(lài)天然蠅蛆中提取總抗菌肽，產(chǎn)率低，而且抗菌活性不穩(wěn)定。同時(shí) 由于蠅蛆生長(zhǎng)環(huán)境含有大量病原細(xì)菌，因此抗菌肽提取生產(chǎn)過(guò)程要嚴(yán)格注意衛(wèi)生防護(hù)，否 則產(chǎn)品用于飼料添加用途容易造成病害傳播和擴(kuò)散。蠅蛆抗菌肽距離規(guī)?；a(chǎn)，還有較 長(zhǎng)的技術(shù)差距。
[0006] 腸道病原菌是家畜和家禽養(yǎng)殖業(yè)造成死亡的主要原因之一。養(yǎng)殖業(yè)對(duì)抗生素的長(zhǎng) 期使用，造成耐藥菌的泛濫。據(jù)統(tǒng)計(jì)，從豬腸道分離的56株腸道病原菌，85%的菌株對(duì)諾氟 沙星、環(huán)丙沙星、青霉素、氨芐西林和頭孢噻吩均有耐藥性?？股剡^(guò)度使用還造成水產(chǎn)品 中抗生素殘留量過(guò)高的嚴(yán)重問(wèn)題，對(duì)消費(fèi)者的健康造成嚴(yán)重威脅。土霉素，氯霉素等常見(jiàn)水 產(chǎn)用抗生素在市售魚(yú)蝦蟹類(lèi)產(chǎn)品中屢有檢出，甚至出口產(chǎn)品也屢遭檢出。
[0007] 抗菌肽作為飼料添加劑，可以完全替代抗生素的使用，而且抗菌范圍廣，無(wú)耐藥性 和抗生素殘留的問(wèn)題。但是抗菌肽的天然來(lái)源匱乏和提取成本過(guò)高是限制其使用的主要障 礙。
[0008] 采用基因工程技術(shù)，利用微生物細(xì)胞工廠，導(dǎo)入抗菌肽基因，獲得重組表達(dá)抗菌肽 的工程菌。利用工業(yè)化發(fā)酵技術(shù)，規(guī)模化生產(chǎn)重組抗菌肽是可行的技術(shù)路線(xiàn)。很多重組藥物 蛋白使用大腸桿菌，畢赤酵母，芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)。
[0009]乳酸菌是美國(guó)FDA認(rèn)證的可用于食品生產(chǎn)的安全微生物，常見(jiàn)用途之一為飼料添 加的益生菌劑，具有改善腸道微生態(tài)體系，維持腸道平衡和機(jī)能，提高宿主免疫力的功效。 乳酸菌是宿主腸道天然共生菌，能夠在消化道內(nèi)黏附和定植，長(zhǎng)期發(fā)揮益生作用。利用乳酸 菌作為宿主，表達(dá)重組蠅蛆抗菌肽，抗菌肽分泌或者展示于重組乳酸菌的細(xì)胞壁表面。重組 活性乳酸菌作為益生菌添加入飼料，飼喂動(dòng)物。重組乳酸菌在宿主腸道內(nèi)定殖，不斷分泌抗 菌肽，殺滅腸道病原菌，促進(jìn)宿主免疫應(yīng)答，兼具發(fā)揮抗菌和益生菌功效，具有巨大應(yīng)用潛 力。
[0010]乳酸菌重組表達(dá)載體是乳酸菌應(yīng)用中的關(guān)鍵技術(shù)之一，但是作為穿梭載體，很多 都帶有抗生素抗性基因作為篩選標(biāo)記，這些抗性基因如果跟隨菌體進(jìn)入宿主，可能會(huì)以基 因水平轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)入宿主腸道菌群傳播，加速菌群的抗藥性發(fā)展。開(kāi)發(fā)一種不含抗生素 標(biāo)記的乳酸菌表達(dá)載體是其在食品，醫(yī)藥領(lǐng)域拓展應(yīng)用的前提。
[0011] 相對(duì)于胞內(nèi)表達(dá)，工程菌細(xì)胞壁表面展示和分泌表達(dá)重組蛋白，更有利于蛋白的 釋放和發(fā)揮效用。而且展示在細(xì)胞壁表面的蛋白比游離的蛋白穩(wěn)定性更好，能夠在宿主體 內(nèi)長(zhǎng)期發(fā)揮效用。
[0012] 乳酸菌表達(dá)和展示表達(dá)外源抗原蛋白，在活菌疫苗產(chǎn)品領(lǐng)域?qū)矣袘?yīng)用，取得了不 錯(cuò)的效果。但是乳酸菌作為表達(dá)外源抗菌肽的細(xì)胞工廠，特別是在細(xì)胞壁表面展示，卻至今 是研究的空白領(lǐng)域。
[0013] 近年來(lái)，隨著乳酸菌基因組學(xué)的不斷發(fā)展和遺傳操作工具的不斷豐富，以活體乳 酸菌為遞送載體的藥物遞送逐漸成為乳酸菌應(yīng)用研究的一個(gè)熱點(diǎn)。乳酸菌是一個(gè)十分良好 遞送載體，因?yàn)樗且嫔?，適應(yīng)腸道環(huán)境，更重要的是，它的定殖位點(diǎn)是小腸內(nèi)壁的上皮 細(xì)胞，能夠競(jìng)爭(zhēng)許多病毒的空間位點(diǎn)，從而起到抗病毒的作用。同時(shí)，乳酸菌本身又是天然 的免疫佐劑，能夠分泌多糖，對(duì)人體有良好的免疫促進(jìn)作用。
[0014] 使用食品級(jí)乳酸菌開(kāi)發(fā)蠅蛆抗菌肽還具有如下優(yōu)勢(shì)：
[0015] 重組抗菌肽可以活菌形式使用，無(wú)需純化，成本低廉，易于大量生產(chǎn)。乳酸菌本身 就能產(chǎn)生細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)，可以起到與蠅蛆抗菌肽聯(lián)合抗菌的作用。
[0016] 國(guó)內(nèi)專(zhuān)利（公開(kāi)號(hào)CN103908668A)公布了具有免疫佐劑作用的蠅蛆抗菌肽及其制 備方法和含該抗菌肽佐劑的疫苗制劑，以及它們?cè)谥苽湟呙缰苿┲械膽?yīng)用。該專(zhuān)利與直接 提取抗菌肽有關(guān)，沒(méi)有用到重組抗菌肽的技術(shù)手段。
[0017] 乳酸菌活載體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于黏膜免疫的疫苗開(kāi)發(fā)。
[0018] 歐盟專(zhuān)利(EP1066375B1)公布了一種羅伊氏乳桿菌細(xì)胞壁表面展示抗原的方法， 美國(guó)專(zhuān)利live(US2009/0324638Al)公布了一種用于乳酸菌分泌或者細(xì)胞壁展示蛋白質(zhì)或 者多肽的方法。但是都沒(méi)有關(guān)于蠅蛆抗菌肽在乳酸菌中表達(dá)或者展示的專(zhuān)利公布。
[0019] 截至目前，還沒(méi)有一種食品級(jí)乳酸菌重組表達(dá)蠅蛆抗菌肽的整體解決方案。 (三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 本發(fā)明目的是提供一種食品級(jí)表達(dá)蠅蛆抗菌肽重組乳酸菌及其應(yīng)用，即提供一種 蠅蛆抗菌肽、編碼基因、載體、工程菌及其作為抗菌劑的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0022]本發(fā)明提供一種蠅蛆抗菌肽，所述蠅蛆抗菌肽氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。
[0023] 本發(fā)明還提供一種所述蠅蛆抗菌肽編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。
[0024] 本發(fā)明涉及一種由所述蠅蛆抗菌肽編碼基因構(gòu)建的重組載體。
[0025]本發(fā)明還涉及一種由所述重組載體轉(zhuǎn)化制備的食品級(jí)重組基因工程菌。
[0026] 此外，本發(fā)明還提供一種所述蠅蛆抗菌肽編碼基因在制備抗菌肽中的應(yīng)用，所述 的應(yīng)用為:將含蠅蛆抗菌肽編碼基因的重組載體轉(zhuǎn)化至乳酸菌中，接種至MRS培養(yǎng)基，30°C 培養(yǎng)48小時(shí)，當(dāng)菌體0D6QQnm大于20且pH值低于4時(shí)反應(yīng)結(jié)束，將培養(yǎng)液在4°C、6000rpm離心 30min，收集菌體，即獲得含蠅蛆抗菌肽的菌體細(xì)胞。
[0027] 本發(fā)明還涉及一種所述蠅蛆抗菌肽在制備抗菌劑中的應(yīng)用，所述抗菌劑為革蘭氏 陽(yáng)性菌或革蘭氏陰性菌的抗菌劑，優(yōu)選所述革蘭氏陽(yáng)性菌為枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球 菌或蠟狀芽孢桿菌，革蘭氏陰性菌為李氏桿菌或大腸桿菌。所述抗菌劑是將含蠅蛆抗菌肽 編碼基因的重組基因工程菌(優(yōu)選重組乳酸菌)經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)物，所述抗菌劑的用 量為100毫升菌液（1〇 7~109CFU/mL)每公斤飼料。具體所述抗菌劑按如下方法制備:將含蠅 蛆抗菌肽編碼基因的重組基因工程菌(優(yōu)選重組乳酸菌)接種MRS培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)48小時(shí)， 檢測(cè)菌體密度和培養(yǎng)體系pH值，菌體0D 6QQnm大于20且pH值低于4即可認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束，4°C、 6000rpm離心30min，收集菌體，即為抑菌劑，使用時(shí)可以將菌體用等體積滅菌roS緩沖液懸 浮菌體制備菌懸液。
[0028] 本發(fā)明所述含蠅蛆抗菌肽編碼基因的重組基因工程菌按如下方法獲得：（1)抗菌 肽表達(dá)框?yàn)椋篖DH啟動(dòng)子（SEQIDN0.4)-信號(hào)肽（SEQIDN0.5)-錨定蛋白（SEQIDN0.6)-蠅蛆抗菌肽（SEQ ID N0.3);
[0029] (2)alr基因（丙氨酸消旋酶)表達(dá)框：以植物乳桿菌基因組DNA為模板，使用引物 alrF(SEQIDN0.10)和alrR(SEQIDN0.11)，PCR擴(kuò)增，獲得alr(丙氨酸消旋酶）基因 （SEQ IDN0·9)，將PGADPH基因片段（SEQIDN0·8)和alr的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（SEQIDN0·9)為模板，加 入引物PGADPHF(SEQIDN0·12)和alrR(SEQIDN0·ll)，將啟動(dòng)子P GADPH與alr基因融合，構(gòu)建 air基因表達(dá)框。
[0030] (3)alr基因（丙氨酸消旋酶)缺陷型無(wú)抗生素標(biāo)記的乳酸乳球菌株:將DNA片段： alr基因上游500bp同源臂（SEQIDN0.17)-lox位點(diǎn)序列（SEQIDN0.13)-氯霉素抗性基因 表達(dá)框（SEQ ID N0.16)-lox位點(diǎn)序列（SEQ ID N0.15)-alr基因下游500bp同源臂（SEQ ID NO. 18)電擊轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌株，篩選air基因（丙氨酸消旋酶)缺陷型無(wú)抗生素標(biāo)記的乳 酸乳球菌株。
[0031] 本發(fā)明由所述蠅蛆抗菌肽編碼基因構(gòu)建的重組載體是通過(guò)IDH啟動(dòng)子，USp45信號(hào) 肽和GSA錨定子的組合使用構(gòu)建重組載體，再將重組載體轉(zhuǎn)化至乳酸菌中，獲得的重組基因 工程菌使抗菌肽被分泌表達(dá)到細(xì)胞外，或者展示在細(xì)胞壁的表面。表達(dá)載體不攜帶外源性 抗生素，通過(guò)載體自帶的丙氨酸消旋酶，在不添加 D-丙氨酸的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性 克隆。