專利名稱：前原條和中內(nèi)胚層細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及包含前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞的組合物，以及制備、分離和使用這些細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
人多能性干細(xì)胞(pluripotent stem cell),如胚胎干細(xì)胞(ES)和胚胎生殖細(xì)胞(EG)，于1994年首先從無(wú)成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)物中分離(Bongso et al.，1994)， 1997年從含成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)物中分離(Hogan, 1997)。隨后Thomson、Reubinoff 和Shamblott建立了采用有絲分裂失活的小鼠飼養(yǎng)層連續(xù)培養(yǎng)人ES和EG細(xì)胞的方法 (Reubinoff et al. , 2000 ；Shamblott et al. , 1998 ；Thomson et al. ,1998)。人ES和EG細(xì)胞(hESC)為研究人類早期發(fā)育和為治療性干預(yù)一些疾病狀態(tài)(如糖尿病和帕金森氏癥)提供了極難得的機(jī)會(huì)。例如，在采用細(xì)胞療法治療糖尿病的過(guò)程中，使用衍生自hSEC的產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞會(huì)比目前利用來(lái)自供者胰腺的細(xì)胞治療糖尿病有很大進(jìn)步。但目前還不知道如何從hSEC得到產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞。因此，目前利用來(lái)自供者胰腺的胰島細(xì)胞治療糖尿病的細(xì)胞療法受限于缺乏移植所需的高質(zhì)量胰島細(xì)胞。對(duì)單一 I型糖尿病人的細(xì)胞治療需要移植大約8 X IO8胰島細(xì)胞(Shapiro et al. ,2000 ；Shapiro et al.，2001a ;Shapiro et al.，2001b)。一次成功移植所需的胰島細(xì)胞至少需要兩個(gè)健康供者的器官提供。而人胚胎干細(xì)胞為開(kāi)發(fā)用于人類細(xì)胞治療的大量的高質(zhì)量分化細(xì)胞提供了起始材料的來(lái)源。多能性和能夠維持hSEC細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)這兩個(gè)性質(zhì)使其特別適合用于細(xì)胞治療。多能性是指hESC能夠分化為所有3種主要胚層(內(nèi)胚層，中胚層和外胚層)的衍生物，進(jìn)而在除胚胎外組織(如胎盤)和生殖細(xì)胞外還形成成熟器官的所有體細(xì)胞類型的能力。盡管多能性賦予了 hSEC特殊的用途，但這個(gè)性質(zhì)也給這些細(xì)胞及其衍生物的研究和控制帶來(lái)挑戰(zhàn)。由于在分化hSEC培養(yǎng)基中會(huì)產(chǎn)生大量細(xì)胞類型，所以大部分細(xì)胞類型產(chǎn)生效率很低。而且，成功評(píng)價(jià)任一指定細(xì)胞類型的產(chǎn)生關(guān)鍵取決于定義合適的標(biāo)志物。高效、定向的分化對(duì)hESC的治療應(yīng)用非常重要。由此，除完成hESC的高效定向分化外，鑒定可以用于鑒定和/或分離特定細(xì)胞的標(biāo)志物是有利的，該特定細(xì)胞處于其從hESC分化出來(lái)的最早期階段。此外，還有利的是鑒定促進(jìn)這些源自hESC的早期前體細(xì)胞向可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞類型分化的因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及包含人細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。這些細(xì)胞培養(yǎng)物中，至少約 5%的人細(xì)胞是前原條細(xì)胞(preprimitive streak),其中該前原條細(xì)胞是可以分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞的專能細(xì)胞(multipotent cell)。其它實(shí)施方案中，培養(yǎng)物中至少約10%到至少約90 %的人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。本文所述的某些實(shí)施方案中，人飼養(yǎng)細(xì)胞也存在于細(xì)胞培養(yǎng)物中。這些實(shí)施方案中，除飼養(yǎng)細(xì)胞外，至少約5%到至少約75%的人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，該前原條細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物，例如FGF8和/或核定位的β-連接素(β-catenin)。某些實(shí)施方案中，這些標(biāo)志物中的一種或兩種的表達(dá)高于brachyury、 FGF4、SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7和/或SOXl的表達(dá)。本文所述的其它實(shí)施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)物基本上不含有內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞、體壁內(nèi)胚層細(xì)胞、原始內(nèi)胚層細(xì)胞、定形內(nèi)胚層細(xì)胞 (definitive endodermal cell)、外胚層細(xì)胞和/或中胚層細(xì)胞。關(guān)于本發(fā)明的某些實(shí)施方案，前原條細(xì)胞培養(yǎng)物包含多能性人細(xì)胞，如人胚胎干細(xì)胞(hESC)。這些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)應(yīng)每I個(gè)hESC存在至少約2個(gè)到至少約 10個(gè)前原條細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，該hESC源自桑椹胚、胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和胚胎生殖嵴。一些實(shí)施方案中，含有人前原條細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物包含的培養(yǎng)基含有少于約2% (v/v) 到少于約O. 2% (v/v)的血清。優(yōu)選實(shí)施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)物包含不含血清或血清替代物的培養(yǎng)基。其它實(shí)施方案中，含有人前原條細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物包含TGFii超家族的Nodal/ 活化素(Activin)亞組的生長(zhǎng)因子。優(yōu)選實(shí)施方案中，該生長(zhǎng)因子是活化素A。本文所述的其它實(shí)施方案涉及包含中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中該中內(nèi)胚層細(xì)胞是可以分化為中胚層或定形內(nèi)胚層細(xì)胞的專能細(xì)胞。這些實(shí)施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)物包含人細(xì)胞，其中至少約5%的人細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。其它實(shí)施方案中，培養(yǎng)物中至少約 10%到至少約90%的人細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。本文所述的某些實(shí)施方案中，人飼養(yǎng)細(xì)胞也存在于細(xì)胞培養(yǎng)物中。這些實(shí)施方案中，至少約5%到至少約75%的除飼養(yǎng)細(xì)胞外的人細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，中內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物，如brachyury、FGF4、和 /或SNAI1。某些實(shí)施方案中，這些標(biāo)志物中一種或多種的表達(dá)高于0CT4、S0X17、CXCR4、 F0XA2、S0X7和/或SOXl的表達(dá)。本文所述的其它實(shí)施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)物基本上不含有內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞、體壁內(nèi)胚層細(xì)胞、原始內(nèi)胚層細(xì)胞、定形內(nèi)胚層細(xì)胞、外胚層細(xì)胞和/或中胚層細(xì)胞。關(guān)于本發(fā)明的某些實(shí)施方案，中內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物包含多能性人細(xì)胞，如人胚胎干細(xì)胞(hESC)。這些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)應(yīng)每I個(gè)hESC存在至少約2個(gè)到至少約 10個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，該hESC源自桑椹胚、胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和胚胎生殖嵴。一些實(shí)施方案中，含有人中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物包含的培養(yǎng)基含有少于約2% (v/v)到少于約O. 2% (v/v)的血清。優(yōu)選實(shí)施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)物包含不含血清或血清替代物的培養(yǎng)基。其它實(shí)施方案中，含有人中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物包含TGFii超家族的Nodal/活化素亞組的生長(zhǎng)因子。優(yōu)選實(shí)施方案中，該生長(zhǎng)因子是活化素A。本文所述其它實(shí)施方案涉及包含特定細(xì)胞的細(xì)胞群，該特定細(xì)胞中至少約90%是人前原條細(xì)胞。這些實(shí)施方案中，該前原條細(xì)胞是可以分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞的專能細(xì)胞。 其它實(shí)施方案中，該細(xì)胞群中至少約95%到至少約98%的人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，前原條細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物，如FGF8和/或核定位的β-連接素。某些實(shí)施方案中，這兩個(gè)標(biāo)志物中一種或兩種的表達(dá)高于brachyury、FGF4、SNAIU S0X17、F0XA2、S0X7和/或 SOXl的表達(dá)。本文所述的其它實(shí)施方案中，該細(xì)胞群基本上不含有內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞、體壁內(nèi)胚層細(xì)胞、原始內(nèi)胚層細(xì)胞、定形內(nèi)胚層細(xì)胞、外胚層細(xì)胞和/或中胚層細(xì)胞。本文所述其它實(shí)施方案涉及包含特定細(xì)胞的細(xì)胞群，該特定細(xì)胞中至少約90%是人中內(nèi)胚層細(xì)胞。這些實(shí)施方案中，該中內(nèi)胚層細(xì)胞是可以分化為中胚層細(xì)胞和/或定形內(nèi)胚層細(xì)胞的專能細(xì)胞。其它實(shí)施方案中，該細(xì)胞群中至少約95%到至少約98%的人細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，中內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物，如brachyury、FGF4、和/或 SNAI1。某些實(shí)施方案中，這些標(biāo)志物中一種或多種的表達(dá)高于0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、 S0X7和/或SOXl的表達(dá)。本文所述的其它實(shí)施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)物基本上不含有內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞、體壁內(nèi)胚層細(xì)胞、原始內(nèi)胚層細(xì)胞、定形內(nèi)胚層細(xì)胞、外胚層細(xì)胞和/或中胚層細(xì)胞。本文所述其它實(shí)施方案涉及生產(chǎn)前原條細(xì)胞的方法。這些方法中，獲得包含諸如 hESC的多能性人細(xì)胞的細(xì)胞群。該細(xì)胞群中的多能性人細(xì)胞在包含少于約2%血清和至少一種TGFii超家族的生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中分化，其中培養(yǎng)基中存在的生長(zhǎng)因子的量足以促進(jìn)至少一部分所述多能性細(xì)胞向前原條細(xì)胞分化，該前原條細(xì)胞是專能的并且可以分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞。一些實(shí)施方案包括其它步驟，其包含給予足夠的時(shí)間使前原條細(xì)胞形成，其中通過(guò)檢測(cè)所述細(xì)胞群中前原條細(xì)胞的存在來(lái)確定所述足夠使前原條細(xì)胞形成的時(shí)長(zhǎng)。一些實(shí)施方案中，該足夠時(shí)長(zhǎng)是至少約6小時(shí)。其它實(shí)施方案中，檢測(cè)細(xì)胞群中前原條細(xì)胞的存在包括檢測(cè)細(xì)胞群的細(xì)胞中至少一種選自FGF8和核定位的β-連接素的標(biāo)志物和至少一種選自brachyury、FGF4、SNAIl、S0X17、F0XA2、S0X7和SOXl的標(biāo)志物的表達(dá)，其中所述前原條細(xì)胞中，選自FGF8和核定位的-β連接素中的標(biāo)志物的表達(dá)高于選自brachyury、 FGF4、SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7和SOXl中的標(biāo)志物的表達(dá)。這些實(shí)施方案中，標(biāo)志物檢測(cè)可以通過(guò)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)、免疫細(xì)胞化學(xué)或其它類似方法。關(guān)于本文所述的某些方法，培養(yǎng)物中至少約5%到至少約90%的人細(xì)胞分化為前原條細(xì)胞。本文所述方法的一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中存在的生長(zhǎng)因子是TGFii超家族的 Nodal/活化素亞組的生長(zhǎng)因子。優(yōu)選實(shí)施方案中，該生長(zhǎng)因子是活化素A。其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，該生長(zhǎng)因子在培養(yǎng)基中存在的濃度范圍為從至少約10ng/ml到至少約IOOOng/ ml。某些實(shí)施方案中，約6小時(shí)、12小時(shí)或18小時(shí)后撤除該生長(zhǎng)因子。其它實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含少于約1% (v/v)到少于約O. 2% (v/v)的血清。其它實(shí)施方案中，培養(yǎng)基是低血清RPMI。其它實(shí)施方案中，細(xì)胞群在缺乏血清或缺乏血清替代物下分化。本文所述其它方法是生產(chǎn)中內(nèi)胚層細(xì)胞的方法。這些方法中，獲得包含諸如hESC 的多能性人細(xì)胞的細(xì)胞群。該細(xì)胞群中的多能性人細(xì)胞在包含少于約2%血清和至少一個(gè) TGF^超家族的生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中分化，其中培養(yǎng)基中存在的生長(zhǎng)因子的量足以促進(jìn)至少一部分所述多能性細(xì)胞向中內(nèi)胚層細(xì)胞分化，該中內(nèi)胚層細(xì)胞是專能的并且可以分化為中胚層細(xì)胞和/或定形內(nèi)胚層細(xì)胞。一些實(shí)施方案包括其它步驟，其包含給予足夠的時(shí)間使中內(nèi)胚層細(xì)胞形成，其中通過(guò)檢測(cè)所述細(xì)胞群中中內(nèi)胚層細(xì)胞的存在來(lái)確定所述使中內(nèi)胚層細(xì)胞形成的足夠時(shí)長(zhǎng)。一些實(shí)施方案中，該足夠時(shí)長(zhǎng)是至少約24小時(shí)。其它實(shí)施方案中，檢測(cè)細(xì)胞群中中內(nèi)胚層細(xì)胞的存在包含檢測(cè)細(xì)胞群的細(xì)胞中至少一種選自brachyury、 FGF4 和 / 或 SNAIl 的標(biāo)志物和至少一種選自 0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7 和 / 或 SOXl 的標(biāo)志物的表達(dá),其中所述中內(nèi)胚層細(xì)胞中,選自brachyury、FGF4和/或SNAIl中的標(biāo)志物的表達(dá)高于選自0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和/或SOXl中的標(biāo)志物的表達(dá)。這些實(shí)施方案中，標(biāo)志物檢測(cè)可以通過(guò)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)、免疫細(xì)胞化學(xué)或其它類似方法。
關(guān)于本文所述的某些方法，培養(yǎng)物中至少約5%到至少約90%的人細(xì)胞分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞。本文所述方法的一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中存在的生長(zhǎng)因子是TGFii超家族的Nodal/活化素亞組的生長(zhǎng)因子。優(yōu)選實(shí)施方案中，該生長(zhǎng)因子是活化素A。其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，該生長(zhǎng)因子在培養(yǎng)基中存在的濃度范圍為從至少約10ng/ml到至少約IOOOng/ ml。某些實(shí)施方案中，約24小時(shí)、36小時(shí)或48小時(shí)后撤除該生長(zhǎng)因子。其它實(shí)施方案中， 培養(yǎng)基包含少于約1% (v/v)到少于約O. 2% (v/v)的血清。其它實(shí)施方案中，培養(yǎng)基是低血清RPMI。其它實(shí)施方案中，細(xì)胞群在缺乏血清或血清替代物下分化。本文所述的其它實(shí)施方案涉及產(chǎn)生富集前原條細(xì)胞的細(xì)胞群的方法。這些方法包括步驟(a)獲得諸如hESC的多能性細(xì)胞群，其中該多能細(xì)胞群中至少一個(gè)細(xì)胞包含置于 FGF8啟動(dòng)子控制下的編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核酸序列或其生物活性片段的拷貝，(b) 分化該多能性細(xì)胞以便生產(chǎn)前原條細(xì)胞，該前原條細(xì)胞為可以分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞的專能細(xì)胞，以及(c)從不表達(dá)GFP的細(xì)胞中分離前原條細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞群包含至少約95%到至少約98%的前原條細(xì)胞。一些實(shí)施方案中,本文所述方法的分化步驟包含向多能細(xì)胞群提供至少一種TGFii超家族的生長(zhǎng)因子，如活化素A?；罨谹的優(yōu)選濃度范圍從至少約50ng/ml到至少約500ng/ml。其它實(shí)施方案中，該細(xì)胞群在包含少于約1% (v/v) 到少于約0.1% (v/v)的血清的培養(yǎng)基中分化。其它實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基是低血清RPMI。 其它實(shí)施方案中，該細(xì)胞群在缺乏血清或血清替代物下分化。本文所述其它實(shí)施方案涉及生產(chǎn)富集中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群的方法。這些方法包括步驟(a)獲得諸如hESC的多能性細(xì)胞群，其中該多能細(xì)胞群中至少一個(gè)細(xì)胞包含置于 brachyury、FGF4和/或SNAIl啟動(dòng)子控制下的編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核酸序列的拷貝或生物活性片段，(b)分化該多能細(xì)胞以便生產(chǎn)中內(nèi)胚層細(xì)胞，該中內(nèi)胚層細(xì)胞為可以分化為中胚層細(xì)胞和/或定形內(nèi)胚層細(xì)胞的專能細(xì)胞，以及(c)從不表達(dá)GFP的細(xì)胞中分離中內(nèi)胚層細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞群包含至少約95%到至少約98%的中內(nèi)胚層細(xì)胞。 一些實(shí)施方案中，本文所述方法的分化步驟包含向多能細(xì)胞群提供至少一個(gè)TGFii超家族的生長(zhǎng)因子,如活化素A?；罨谹的優(yōu)選濃度范圍從至少約50ng/ml到至少約500ng/ml。 其它實(shí)施方案中，該細(xì)胞群在包含少于約I % (v/v)到少于約0.1% (v/v)的血清的培養(yǎng)基中分化。其它實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基是低血清RPMI。其它實(shí)施方案中，該細(xì)胞群在缺乏血清或血清替代物下分化。本發(fā)明的一些實(shí)施方案是鑒定分化因子的篩選方法，該分化因子能夠促進(jìn)包含人細(xì)胞的細(xì)胞群中的前原條細(xì)胞的分化。這些方法包括步驟(a)獲得包含人前原條細(xì)胞的細(xì)胞群，(b)向該細(xì)胞群提供候選分化因子，(c)確定細(xì)胞群中標(biāo)志物在第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)， 確定該細(xì)胞群中相同標(biāo)志物在第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，其中第二時(shí)間點(diǎn)在第一時(shí)間點(diǎn)之后，并且第二時(shí)間點(diǎn)在向該細(xì)胞群提供候選分化因子之后，(d)以及確定與該標(biāo)志物在細(xì)胞群中第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)相比，其在細(xì)胞群中第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)是否增加或減少，其中標(biāo)志物在細(xì)胞群中的表達(dá)的增加或減少表明該候選分化因子能夠促進(jìn)前原條細(xì)胞的分化。某些實(shí)施方案中，第一時(shí)間點(diǎn)在向細(xì)胞群提供候選分化因子之前或大致同時(shí)。其它實(shí)施方案中，第一時(shí)間點(diǎn)在向細(xì)胞群提供候選分化因子之后。本文所述篩選方法的一些實(shí)施方案中，該人前原條細(xì)胞響應(yīng)候選分化因子分化為特定細(xì)胞，如中內(nèi)胚層細(xì)胞、中胚層細(xì)胞和/或定形內(nèi)胚層細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，中內(nèi)胚層由諸如brachyury、FGF4和/或SNAIl的標(biāo)志物的表達(dá)表明。其它實(shí)施方案中，中胚層由諸如FOXFl、FLKl、BMP4、MOXl和SDFl的標(biāo)志物的表達(dá)表明。其它實(shí)施方案中，定形內(nèi)胚層由諸如CXCR4和/或S0X17的標(biāo)志物的表達(dá)表明。關(guān)于本文所述篩選方法，某些實(shí)施方案涉及提供候選分化因子，如至少一種TGF β 超家族的生長(zhǎng)因子，如活化素Α。其它實(shí)施方案中，該候選分化因子是小分子或多肽。其它實(shí)施方案中，該候選分化因子不是TGFii超家族的因子。其它實(shí)施方案中，該候選分化因子是未知能造成前原條細(xì)胞分化的因子。本文所述的其它實(shí)施方案是鑒定能夠促進(jìn)包含人細(xì)胞的細(xì)胞群中中內(nèi)胚層細(xì)胞分化的分化因子的篩選方法。此類方法包含步驟(a)獲得包含人中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群， (b)向該細(xì)胞群提供候選分化因子，(C)確定該細(xì)胞群中標(biāo)志物在第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，確定該細(xì)胞群中相同標(biāo)志物在第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，其中第二時(shí)間點(diǎn)在第一時(shí)間點(diǎn)之后，并且第二時(shí)間點(diǎn)在向該群提供候選分化因子之后，(d)以及確定與該標(biāo)志物在細(xì)胞群中第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)相比，其在細(xì)胞群中第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)是否增加或減少，其中標(biāo)志物在細(xì)胞群中的表達(dá)的增加或減少表明該候選分化因子能夠促進(jìn)中內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。某些實(shí)施方案中，第一時(shí)間點(diǎn)在向細(xì)胞群提供候選分化因子之前或大致同時(shí)。其它實(shí)施方案中，第一時(shí)間點(diǎn)在向細(xì)胞群提供候選分化因子之后。本文所述篩選方法的一些實(shí)施方案中，該人中內(nèi)胚層細(xì)胞響應(yīng)候選分化因子分化為特定細(xì)胞，如中胚層細(xì)胞和/或定形內(nèi)胚層細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，中胚層由諸如FOXFl、FLKl、BMP4、MOXl和SDFl的標(biāo)志物的表達(dá)表明。其它實(shí)施方案中，定形內(nèi)胚層由諸如CXCR4和/或S0X17的標(biāo)志物的表達(dá)表明。關(guān)于本文所述篩選方法，某些實(shí)施方案涉及提供候選分化因子，如至少一種TGF β 超家族的生長(zhǎng)因子，如活化素Α。其它實(shí)施方案中，該候選分化因子是小分子或多肽。其它實(shí)施方案中，該候選分化因子不是TGFii超家族的因子。其它實(shí)施方案中，該候選分化因子是未知能造成中內(nèi)胚層細(xì)胞分化的因子。其它實(shí)施方案涉及在體外提高人胚胎干細(xì)胞(hESC)中FGF8基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法。該方法包括在包含少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基中獲得hESC，并且使該hESC接觸特定量的分化因子，該特定量足以增加FGF8基因產(chǎn)物的表達(dá)。一些實(shí)施方案中，該分化因子是至少一種TGFf3超家族的生長(zhǎng)因子，如活化素A。一些實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基不包含血清替代物。其它實(shí)施方案涉及在體外提高人胚胎干細(xì)胞(hESC)中選自brachyury、FGF4和 SNAIl的基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法。所述方法包括在包含少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基中獲得hESC，并且使該hESC接觸特定量的分化因子，該特定量足以增加選自brachyury、FGF4 和SNAIl的基因產(chǎn)物的表達(dá)。一些實(shí)施方案中，該分化因子是至少一種TGFii超家族的生長(zhǎng)因子，如活化素A。一些實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基不包含血清替代物。本文所述的一些實(shí)施方案涉及包含人胚胎干細(xì)胞(hESC)和含有少于約2% (v/v) 血清的培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中該hESC從特定參考時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始分化，與該hESC的基線 FGF8 mRNA表達(dá)相比，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約6小時(shí)時(shí)FGF8 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。一些實(shí)施方案中，距該參考時(shí)間點(diǎn)約17小時(shí)β-連接素多肽的表達(dá)開(kāi)始向細(xì)胞核定位。其它實(shí)施方案中，距該參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)brachyury、FGF4和/或SNAIl mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。 其它實(shí)施方案中，距該參考時(shí)間點(diǎn)約12小時(shí)時(shí)E-鈣粘著素(E-cadherin)mRNA的表達(dá)開(kāi)始下調(diào)。此外，一些實(shí)施方案中，距該參考時(shí)間點(diǎn)約48小時(shí)時(shí)S0X17 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)和/或距該參考時(shí)間點(diǎn)約96小時(shí)時(shí)F0XA2 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。本文所述細(xì)胞培養(yǎng)物的某些實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基包含少于約I % (v/v)到少于約O. 2% (v/v)的血清。其它實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。其它實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基不包含血清替代物。本文所述的其它實(shí)施方案涉及包含人胚胎干細(xì)胞、TGF^超家族的分化因子和含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中第一套標(biāo)志物基因在第二套和/或第三套標(biāo)志物基因的上調(diào)或峰值表達(dá)之前或大致同時(shí)上調(diào)或下調(diào)。其它實(shí)施方案涉及分化細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞的方法，通過(guò)使包含人胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物與包含少于約2%血清的培養(yǎng)基接觸、向該hESC提供TGF0超家族的分化因子、以及允許hESC分化的發(fā)生。一些實(shí)施方案中，該方法產(chǎn)生特定細(xì)胞，該細(xì)胞中第一套標(biāo)志物基因在第二套和/或第三套標(biāo)志物基因的上調(diào)或峰值表達(dá)之前或大約同時(shí)上調(diào)或下調(diào)。一些實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基不包含血清或血清替代物。一些權(quán)限中，術(shù)語(yǔ)“包含”可能不具有任何通常所接受的定義。此處使用的術(shù)語(yǔ)“包含”是開(kāi)放式的，可以包括任何其他元素?？紤]到這一點(diǎn)，本發(fā)明的其他實(shí)施方案參考以下編號(hào)的段落進(jìn)行描述I.包含人細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物,其中至少約5%的所述人細(xì)胞是前原條細(xì)胞,所述前原條細(xì)胞是能分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞的專能細(xì)胞。2.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約10%的所述人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。3.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約20%的所述人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。4.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約30%的所述人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。5.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約40%的所述人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。6.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約50%的所述人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。7.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約60%的所述人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。8.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約70%的所述人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。9.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約80%的所述人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。10.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約90%的所述人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。11.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細(xì)胞，并且其中至少約 5 %的除所述人飼養(yǎng)細(xì)胞外的人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。12.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細(xì)胞，并且其中至少約 25%的除所述人飼養(yǎng)細(xì)胞外的人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。13.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細(xì)胞，并且其中至少約 50 %的除所述人飼養(yǎng)細(xì)胞外的人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。14.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細(xì)胞，并且其中至少約 75 %的除所述人飼養(yǎng)細(xì)胞外的人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。15.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述前原條細(xì)胞表達(dá)選自FGF8和核定位的β -連接素的標(biāo)志物。16.段落15的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述前原條細(xì)胞中選自FGF8和核定位的β -連接素的標(biāo)志物的表達(dá)高于選自brachyury、FGF4、SNAIl、S0X17、F0XA2、S0X7和SOXl的標(biāo)志物的表達(dá)。17.段落15的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述前原條細(xì)胞不顯著表達(dá)選自brachyury、FGF4、SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的標(biāo)志物。18.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述前原條細(xì)胞表達(dá)FGF8和核定位的β -連接素。19.段落18的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述前原條細(xì)胞中FGF8和細(xì)胞核定位的β連接素的表達(dá)高于 brachyury、FGF4、SNAII、S0X17、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的表達(dá)。20.段落18的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述前原條細(xì)胞不顯著表達(dá)brachyury、FGF4、 SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7 和 SOXl。21.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物基本上不含有選自內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞、體壁內(nèi)胚層細(xì)胞、原始內(nèi)胚層細(xì)胞、定形內(nèi)胚層細(xì)胞、外胚層細(xì)胞和中胚層細(xì)胞的細(xì)胞。22.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含人胚胎干細(xì)胞(hESC)。23.段落22的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)應(yīng)約每一個(gè)hESC存在至少約 2個(gè)前原條細(xì)胞。24.段落22的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)應(yīng)約每一個(gè)hESC存在至少約 10個(gè)前原條細(xì)胞。25.段落22的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述hESC源自選自桑椹胚、胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM) 和胚胎生殖嵴的組織。26.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。27.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約1% (v/v)血清的培養(yǎng)基。28.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約O. 5% (v/v)血清的培養(yǎng)基。29.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約O. 2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。30.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含不含血清或血清替代物的培養(yǎng)基。31.段落I的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含TGFP超家族的Nodal/活化素亞組的生長(zhǎng)因子。32.段落31的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述TGF0超家族的Nodal/活化素亞組的生長(zhǎng)因子包括活化素A。33.包含人細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約5%的所述人細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞，所述中內(nèi)胚層細(xì)胞是能分化為中胚層細(xì)胞或定形內(nèi)胚層細(xì)胞的專能細(xì)胞。34.段落
35.段落
36.段落
37.段落
38.段落
39.段落
40.段落
41.段落
42.段落
43.段落
5%的除所述人飼養(yǎng)細(xì)胞外的人細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。44.段落33的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細(xì)胞，并且其中至少約 25%的除所述人飼養(yǎng)細(xì)胞外的人細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。45.段落33的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細(xì)胞，并且其中至少約50%的除所述人飼養(yǎng)細(xì)胞外的人細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。46.段落33的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細(xì)胞，并且其中至少約 75%的除所述人飼養(yǎng)細(xì)胞外的人細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。47.段落33的細(xì)胞培養(yǎng)物,其中所述中內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)選自brachyury、FGF4和 SNAIl的標(biāo)志物。48.段落47的細(xì)胞培養(yǎng)物,其中所述中內(nèi)胚層細(xì)胞中選自brachyury、FGF4和 SNAIl的標(biāo)志物的表達(dá)高于選自0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和SOXl的標(biāo)志物的表達(dá)。49.段落47的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述中內(nèi)胚層細(xì)胞不顯著表達(dá)選自0CT4、S0X17、 CXCR4、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的標(biāo)志物。50.段落33的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述中內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)brachyury、FGF4和 SNAII。51.段落51的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述中內(nèi)胚層細(xì)胞中brachyury、FGF4和SNAIl的表達(dá)高于 0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的表達(dá)。52.段落51的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述中內(nèi)胚層細(xì)胞不顯著表達(dá)0CT4、S0X17、 CXCR4、F0XA2、S0X7 和 SOXl。53.段落33的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物基本上不含選自內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞、體壁內(nèi)胚層細(xì)胞、原始內(nèi)胚層細(xì)胞、定形內(nèi)胚層細(xì)胞、外胚層細(xì)胞和中胚層細(xì)胞的細(xì)胞。54.段落33的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含人胚胎干細(xì)胞(hESC)。55.段落54的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)應(yīng)約每一個(gè)hESC存在至少約 2個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞。56.段落54的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)應(yīng)約每一個(gè)hESC存在至少約 10個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞。57.段落54的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述hESC源自選自桑椹胚、胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM) 和胚胎生殖嵴的組織。58.段落33的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。59.段落33的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約1% (v/v)血清的培養(yǎng)基。60.段落33的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約O. 5% (v/v)血清的培養(yǎng)基。61.段落33的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約O. 2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。62.段落33的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含不含血清或血清替代物的培養(yǎng)基。63.段落33的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含TGF β超家族的Nodal/活化素亞組的生長(zhǎng)因子。64.段落63的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述TGFP超家族的Nodal/活化素亞組的生長(zhǎng)因子包含活化素A。65.包含細(xì)胞的細(xì)胞群,其中至少約90%的所述細(xì)胞是人前原條細(xì)胞,所述前原條細(xì)胞是能分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞的專能細(xì)胞。66.段落65的細(xì)胞群，其中至少約95%的所述細(xì)胞是人前原條細(xì)胞。67.段落65的細(xì)胞群，其中至少約98%的所述細(xì)胞是人前原條細(xì)胞。68.段落65的細(xì)胞群，其中所述人前原條細(xì)胞表達(dá)選自FGF8和核定位的β -連接素的標(biāo)志物。
69.段落68的細(xì)胞群，其中所述人前原條細(xì)胞中選自FGF8和核定位的β -連接素的標(biāo)志物的表達(dá)高于選自brachyury、FGF4、SNAIl、S0X17、F0XA2、S0X7和SOXl的標(biāo)志物的表達(dá)。70.段落68的細(xì)胞群,其中所述人前原條細(xì)胞不顯著表達(dá)選自brachyury、FGF4、 SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的標(biāo)志物。71.段落65的細(xì)胞群，其中所述人前原條細(xì)胞表達(dá)FGF8和核定位的β-連接素。72.段落71的細(xì)胞群，其中所述人前原條細(xì)胞中FGF8和核定位的β-連接素的表達(dá)高于 brachyury、FGF4、SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的表達(dá)。73.段落71的細(xì)胞群，其中所述人前原條細(xì)胞不顯著表達(dá)brachyury、FGF4、 SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7 和 SOXl。74.包含細(xì)胞的細(xì)胞群，其中至少約90%的所述細(xì)胞是人中內(nèi)胚層細(xì)胞，所述中內(nèi)胚層細(xì)胞是能分化為中胚層細(xì)胞或定形內(nèi)胚層細(xì)胞的專能細(xì)胞。75.段落74的細(xì)胞群，其中至少約95%的所述細(xì)胞是人中內(nèi)胚層細(xì)胞。76.段落74的細(xì)胞群，其中至少約98%的所述細(xì)胞是人中內(nèi)胚層細(xì)胞。77.段落74的細(xì)胞群,其中所述人中內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)選自brachyury、FGF4和 SNAIl的標(biāo)志物。78.段落77的細(xì)胞群，其中所述人中內(nèi)胚層細(xì)胞中選自1^1(*71^7、？6 4和5嫩11 的標(biāo)志物的表達(dá)高于選自0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和SOXl的標(biāo)志物的表達(dá)。79.段落77的細(xì)胞群，其中所述人中內(nèi)胚層細(xì)胞不顯著表達(dá)選自0CT4、S0X17、 CXCR4、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的標(biāo)志物。80.段落74的細(xì)胞群，其中所述人中內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)brachyury、FGF4和SNAII。81.段落77的細(xì)胞群，其中所述人中內(nèi)胚層細(xì)胞中brachyury、FGF4和SNAIl的表達(dá)高于 0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的表達(dá)。82.段落77的細(xì)胞群，其中所述人中內(nèi)胚層細(xì)胞不顯著表達(dá)0CT4、S0X17、CXCR4、 F0XA2、S0X7 和 SOXl。83.產(chǎn)生前原條細(xì)胞的方法，所述方法包括獲得含有多能性人細(xì)胞的細(xì)胞群和在含有少于約2%的血清和至少一種TGFii超家族的生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中分化所述多能性人細(xì)胞的步驟，其中所述生長(zhǎng)因子以足以促進(jìn)至少一部分所述多能性細(xì)胞分化為前原條細(xì)胞的量存在于所述培養(yǎng)基中，所述前原條細(xì)胞是能分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞的專能細(xì)胞。84.段落83的方法，還包括給予足夠時(shí)間讓前原條細(xì)胞形成，其中所述讓前原條細(xì)胞形成的足夠時(shí)間通過(guò)檢測(cè)前原條細(xì)胞在所述細(xì)胞群中的存在來(lái)確定。85.段落84的方法，其中足夠時(shí)間為最少約6小時(shí)。86.段落84的方法，其中檢測(cè)前原條細(xì)胞在所述細(xì)胞群中的存在包括檢測(cè)所述細(xì)胞群細(xì)胞中至少一種選自FGF8和核定位的β-連接素的標(biāo)志物和至少一種選自 brachyury、FGF4、SNAII、F0XA2、S0X7和SOXl的標(biāo)志物的表達(dá)，其中所述前原條細(xì)胞中選自FGF8和核定位的β -連接素的標(biāo)志物的表達(dá)高于選自brachyury、FGF4、SNAII、S0X17、 F0XA2、S0X7和SOXl的標(biāo)志物的表達(dá)。87.段落86的方法，其中通過(guò)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)確定至少一種所述標(biāo)志物的表達(dá)。
88.段落86的方法，其中通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)確定至少一種所述標(biāo)志物的表達(dá)。89.段落83的方法，其中至少約5%的所述多能性人細(xì)胞分化為前原條細(xì)胞。90.段落83的方法，其中至少約10%的所述多能性人細(xì)胞分化為前原條細(xì)胞。91.段落83的方法，其中至少約20%的所述多能性人細(xì)胞分化為前原條細(xì)胞。92.段落83的方法，其中至少約30%的所述多能性人細(xì)胞分化為前原條細(xì)胞。93.段落83的方法，其中至少約40%的所述多能性人細(xì)胞分化為前原條細(xì)胞。94.段落83的方法，其中至少約50%的所述多能性人細(xì)胞分化為前原條細(xì)胞。95.段落83的方法，其中至少約60%的所述多能性人細(xì)胞分化為前原條細(xì)胞。96.段落83的方法，其中至少約70%的所述多能性人細(xì)胞分化為前原條細(xì)胞。97.段落83的方法，其中至少約80%的所述多能性人細(xì)胞分化為前原條細(xì)胞。98.段落83的方法，其中至少約90%的所述多能性人細(xì)胞分化為前原條細(xì)胞。99.段落83的方法，其中所述至少一種生長(zhǎng)因子屬于TGFP超家族的Nodal/活化 素亞組。100.段落99的方法，其中所述至少一種屬于TGFP超家族的Nodal/活化素亞組 的生長(zhǎng)因子包含活化素A。101.段落83的方法，其中所述至少一種生長(zhǎng)因子以至少約10ng/ml的濃度提供。102.段落83的方法，其中所述至少一種生長(zhǎng)因子以至少約100ng/ml的濃度提供。103.段落83的方法，其中所述至少一種生長(zhǎng)因子以至少約500ng/ml的濃度提供。104.段落83的方法，其中所述至少一種生長(zhǎng)因子以至少約1000ng/ml的濃度提供。105.段落83的方法，其中在約6小時(shí)后撤除所述至少一種生長(zhǎng)因子。106.段落83的方法，其中在約12小時(shí)后撤除所述至少一種生長(zhǎng)因子。107.段落83的方法，其中在約18小時(shí)后撤除所述至少一種生長(zhǎng)因子。108.段落83的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約1% (v/v)血清的培養(yǎng)基中分 化。109.段落83的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約0. 5% (v/v)血清的培養(yǎng)基中 分化。110.段落83的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約0. 2% (v/v)血清的培養(yǎng)基中 分化。111.段落83的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約0. 1% (v/v)血清的培養(yǎng)基中 分化。112.段落83的方法，其中所述細(xì)胞群在不存在血清或不存在血清替代物下分化。113.段落83的方法，其中所述細(xì)胞群在特定血清含量的培養(yǎng)基中分化，所述培養(yǎng) 基在加入所述至少一種生長(zhǎng)因子后的約第一天含有約0% (v/v)血清，在加入所述至少一 種生長(zhǎng)因子后的約第二天含有約0.2% (v/v)或更少血清，并且在加入所述至少一種生長(zhǎng) 因子后的約第三天含有約2% (v/v)或更少血清。114.段落83的方法，其中所述細(xì)胞群在低血清RPMI培養(yǎng)基中分化。115.段落83的方法，其中所述多能性人細(xì)胞包含人胚胎干細(xì)胞(hESC)。116.段落115的方法，其中所述人胚胎干細(xì)胞源自選自桑椹胚、胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和胚胎生殖嵴的組織。117.通過(guò)段落83的方法制備的前原條細(xì)胞。118.制備中內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，所述方法包括獲得含有多能性人細(xì)胞的細(xì)胞群和在含有少于約2%的血清和至少一種TGFii超家族的生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中分化所述多能性人細(xì)胞的步驟，其中所述生長(zhǎng)因子以足以促進(jìn)至少一部分所述多能性細(xì)胞分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞的量存在于所述培養(yǎng)基中，所述中內(nèi)胚層細(xì)胞是能分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞的專能細(xì)胞。119.段落118的方法，還包括給予足夠時(shí)間讓中內(nèi)胚層細(xì)胞形成的步驟，其中所述讓中內(nèi)胚層細(xì)胞形成的足夠時(shí)間通過(guò)檢測(cè)中內(nèi)胚層細(xì)胞在所述細(xì)胞群中的存在來(lái)確定。120.段落119的方法，其中足夠時(shí)間為最少約24小時(shí)。121.段落118的方法，其中檢測(cè)中內(nèi)胚層細(xì)胞在所述細(xì)胞群中的存在包括檢測(cè)所述細(xì)胞群中至少一種選自brachyury、FGF4和SNAII的標(biāo)志物和至少一種選自0CT4、S0X17、 CXCR4、F0XA2、S0X7和SOXl的標(biāo)志物的表達(dá)，其中在所述中內(nèi)胚層細(xì)胞中選自brachyury、 FGF4和SNAIl的標(biāo)志物的表達(dá)高于選自0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和SOXl的標(biāo)志物的表達(dá)。122.段落121的方法，其中通過(guò)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)確定至少一種所述標(biāo)志物的表達(dá)。
123.段落121的方法，其中通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)確定至少一種所述標(biāo)志物的表達(dá)。
124.段落118的方法，其中至少約5%的所述多能性人細(xì)胞分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞。
125.段落118的方法，其中至少約10%的所述多能性人細(xì)胞分化為中內(nèi)胚層細(xì)
126.段落118的方法，其中至少約20%的所述多能性人細(xì)胞分化為中內(nèi)胚層細(xì)
127.段落118的方法，其中至少約30%的所述多能性人細(xì)胞分化為中內(nèi)胚層細(xì)
128.段落118的方法，其中至少約40%的所述多能性人細(xì)胞分化為中內(nèi)胚層細(xì)
129.段落118的方法，其中至少約50%的所述多能性人細(xì)胞分化為中內(nèi)胚層細(xì)
130.段落118的方法，其中至少約60%的所述多能性人細(xì)胞分化為中內(nèi)胚層細(xì)
131.段落118的方法，其中至少約70%的所述多能性人細(xì)胞分化為中內(nèi)胚層細(xì)
132.段落118的方法，其中至少約80%的所述多能性人細(xì)胞分化為中內(nèi)胚層細(xì)
133.段落118的方法，其中至少約90%的所述多能性人細(xì)胞分化為中內(nèi)胚層細(xì)的生長(zhǎng)因子包含活化素A。
136.段落118的方法，其中所述至少一種生長(zhǎng)因子以至少約10ng/ml的濃度提供。
的方法，其中所述至少一種生長(zhǎng)因子以至少約100ng/ml的濃度提
的方法，其中所述至少一種生長(zhǎng)因子以至少約500ng/ml的濃度提
的方法，其中所述至少一種生長(zhǎng)因子以至少約1000ng/ml的濃度提
的方法，其中在約24小時(shí)后撤除所述至少一種生長(zhǎng)因子。
的方法，其中在約36小時(shí)后撤除所述至少一種生長(zhǎng)因子。
的方法，其中在約48小時(shí)后撤除所述至少一種生長(zhǎng)因子。
的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約1% (v/v)血清的培養(yǎng)基中
的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約O. 5% (v/v)血清的培養(yǎng)基
的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約O. 2% (v/v)血清的培養(yǎng)基
的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約O. 1% (v/v)血清的培養(yǎng)基
的方法，其中所述細(xì)胞群在不存在血清或不存在血清替代物下分供。供。供。分化。
中分化^
中分化^
中分化^化。148.段落118的方法，其中所述細(xì)胞群在特定血清含量的培養(yǎng)基中分化，所述培養(yǎng)基在加入所述至少一種生長(zhǎng)因子后的約第一天含有約0% (v/v)血清，在加入所述至少一種生長(zhǎng)因子后的約第二天含有約0.2% (v/v)或更少血清，并且在加入所述至少一種生長(zhǎng)因子后的約第三天含有約2% (v/v)或更少血清。149.段落118的方法，其中所述細(xì)胞群在低血清RPMI培養(yǎng)基中分化。150.段落118的方法，其中所述細(xì)胞群包含人胚胎干細(xì)胞(hESC)。151.段落150的方法，其中所述人胚胎干細(xì)胞源自選自桑椹胚、胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán) (ICM)和胚胎生殖嵴的組織。152.通過(guò)段落118方法制備的中內(nèi)胚層細(xì)胞。153.產(chǎn)生富集前原條細(xì)胞的細(xì)胞群方法，所述方法包括以下步驟獲得多能性細(xì)胞的群，其中所述多能性細(xì)胞群的至少一個(gè)細(xì)胞含有至少一個(gè)拷貝的受FGF8啟動(dòng)子控制的核酸，所述核酸含有編碼綠色熒光蛋白(GFP)或其生物活性片段的序列；分化所述多能性細(xì)胞以制備前原條細(xì)胞，所述前原條細(xì)胞是能分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞的專能細(xì)胞；以及從不表達(dá)GFP的細(xì)胞中分離所述前原條細(xì)胞。154.段落153的方法，其中所述富集細(xì)胞群包含至少約95%的前原條細(xì)胞。155.段落153的方法，其中所述富集細(xì)胞群包含至少約98%的前原條細(xì)胞。156.段落153的方法，其中所述分化步驟包括以特定量向所述多能性細(xì)胞群提供至少一種來(lái)自TGFii超家族的生長(zhǎng)因子，該特定量足以促進(jìn)所述多能性細(xì)胞向前原條細(xì)胞
137.段落118138.段落118139.段落118140.段落118141.段落118142.段落118143.段落118144.段落118145.段落118146.段落118147.段落118148.段落118分化。157.段落156的方法，其中所述至少一種TGFP超家族的生長(zhǎng)因子是活化素A。158.段落157的方法，其中所述活化素A以至少約50ng/ml的濃度提供。159.段落157的方法，其中所述活化素A以至少約100ng/ml的濃度提供。160.段落157的方法，其中所述活化素A以至少約500ng/ml的濃度提供。161.段落153的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約1% (v/v)血清的培養(yǎng)基中 分化。162.段落153的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約0. 5% (v/v)血清的培養(yǎng)基 中分化。163.段落153的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約0. 2% (v/v)血清的培養(yǎng)基 中分化。164.段落153的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約0. 1% (v/v)血清的培養(yǎng)基 中分化。165.段落153的方法，其中所述細(xì)胞群在不存在血清或不存在血清替代物下分 化。166.段落153的方法，其中所述細(xì)胞群在特定血清含量的培養(yǎng)基中分化，所述培 養(yǎng)基在加入所述至少一種生長(zhǎng)因子后的約第一天含有約0% (v/v)血清，在加入所述至少 一種生長(zhǎng)因子后的約第二天含有約0.2% (v/v)或更少血清，并且在加入所述至少一種生 長(zhǎng)因子后的約第三天含有約2% (v/v)或更少血清。167.段落153的方法，其中所述細(xì)胞群在低血清RPMI培養(yǎng)基中分化。168.通過(guò)段落153的方法產(chǎn)生的前原條細(xì)胞的富集群。169.產(chǎn)生富集中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，所述方法包括以下步驟獲得多能 性細(xì)胞群，其中所述多能性細(xì)胞群的至少一個(gè)細(xì)胞含有至少一個(gè)拷貝的受選自brachyury 啟動(dòng)子、FGF4啟動(dòng)子和SNAI1啟動(dòng)子的啟動(dòng)子控制的核酸，所述核酸含有編碼綠色熒光蛋 白(GFP)或其生物活性片段的序列；分化所述多能性細(xì)胞以產(chǎn)生中內(nèi)胚層細(xì)胞，所述中內(nèi) 胚層細(xì)胞是能分化為中胚層細(xì)胞或定形內(nèi)胚層細(xì)胞的專能細(xì)胞；以及從不表達(dá)GFP的細(xì)胞 中分離所述中內(nèi)胚層細(xì)胞。170.段落169的方法，其中所述富集細(xì)胞群包含至少約95%的中內(nèi)胚層細(xì)胞。171.段落169的方法，其中所述富集細(xì)胞群包含至少約98%的中內(nèi)胚層細(xì)胞。172.段落169的方法，其中所述分化步驟包括以特定量向所述多能性細(xì)胞群提供 至少一種來(lái)自TGFP超家族的生長(zhǎng)因子，該特定量足以促進(jìn)所述多能性細(xì)胞向中內(nèi)胚層細(xì) 胞分化。173.段落172的方法，其中所述至少一種TGF0超家族的生長(zhǎng)因子是活化素A。174.段落173的方法，其中所述活化素A以至少約50ng/ml的濃度提供。175.段落173的方法，其中所述活化素A以至少約100ng/ml的濃度提供。176.段落173的方法，其中所述活化素A以至少約500ng/ml的濃度提供。177.段落169的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約1% (v/v)血清的培養(yǎng)基中 分化。178.段落169的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約0. 5% (v/v)血清的培養(yǎng)基
179.段落169的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約O.2% (v/v)血清的培養(yǎng)基
180.段落169的方法，其中所述細(xì)胞群在含有少于約O.1% (v/v)血清的培養(yǎng)基
181.段落169的方法，其中所述細(xì)胞群在不存在血清或不存在血清替代物下分
中分化
中分化
中分化化。182.段落169的方法，其中所述細(xì)胞群在特定血清含量的培養(yǎng)基中分化，所述培養(yǎng)基在加入所述至少一種生長(zhǎng)因子后的約第一天含有約0% (v/v)血清，在加入所述至少一種生長(zhǎng)因子后的約第二天含有約O. 2% (v/v)或更少血清，并且在加入所述至少一種生長(zhǎng)因子后的約第三天含有約2% (v/v)或更少血清。183.段落169的方法，其中所述細(xì)胞群在低血清RPMI培養(yǎng)基中分化。184.通過(guò)段落169的方法產(chǎn)生的中內(nèi)胚層細(xì)胞的富集群。185.鑒定能夠促進(jìn)包含人細(xì)胞的細(xì)胞群中前原條細(xì)胞的分化的分化因子的方法， 所述方法包含以下步驟獲得包含人前原條細(xì)胞的細(xì)胞群，向所述細(xì)胞群提供候選分化因子，確定所述細(xì)胞群中標(biāo)志物在第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)、確定所述細(xì)胞群中相同標(biāo)志物在第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，其中所述第二時(shí)間點(diǎn)在所述第一時(shí)間點(diǎn)之后，并且其中所述第二時(shí)間點(diǎn)在向所述細(xì)胞群提供所述候選分化因子之后，以及確定所述細(xì)胞群中該標(biāo)志物在所述第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與所述細(xì)胞群中該標(biāo)志物在所述第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)相比是否增加或減少，其中所述細(xì)胞群中所述標(biāo)志物表達(dá)的增加或減少表明所述候選分化因子能夠促進(jìn)所述前原條細(xì)胞的分化。186.段落185的方法，其中在所述細(xì)胞群中所述人前原條細(xì)胞占所述人細(xì)胞的至少約10%o187.段落185的方法，其中所述細(xì)胞群中存在人飼養(yǎng)細(xì)胞，并且其中至少約10% 的除所述飼養(yǎng)細(xì)胞外的人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。188.段落185的方法，其中在所述細(xì)胞群中所述人前原條細(xì)胞占所述人細(xì)胞的至少約50%。189.段落185的方法，其中所述細(xì)胞群中存在人飼養(yǎng)細(xì)胞，并且其中至少約50% 的除所述飼養(yǎng)細(xì)胞外的人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。190.段落185的方法，其中所述人前原條細(xì)胞響應(yīng)所述候選分化因子分化為選自中內(nèi)胚層、中胚層和定形內(nèi)胚層的細(xì)胞。191.段落185的方法，其中所述人前原條細(xì)胞響應(yīng)所述候選分化因子分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞。
層細(xì)胞。
192.段落191的方法，其中所述標(biāo)志物選自brachyury、FGF4和SNAII。
193.段落185的方法，其中所述人前原條細(xì)胞響應(yīng)所述候選分化因子分化為中胚
194.段落193的方法，其中所述標(biāo)志物選自FOXFl、FLKl、BMP4、MOXl和SDFl。
195.段落185的方法，其中所述人前原條細(xì)胞響應(yīng)所述候選分化因子分化為定形
內(nèi)胚層細(xì)胞。
197.段落185子之前。
198.段落185子大致同時(shí)。
199.段落185子之后。
200.段落185
201.段落185
202.段落185確定。
203.段落185
204.段落185因子。
205.段落204
206.段落185
207.段落185
208.段落185
209.段落185
的方法，其中所述標(biāo)志物選自CXCR4和SOXl7。
的方法，其中所述第一時(shí)間點(diǎn)在向所述細(xì)胞群提供所述候選分化因
的方法，其中所述第一時(shí)間點(diǎn)與向所述細(xì)胞群提供所述候選分化因
的方法，其中所述第一時(shí)間點(diǎn)在向所述細(xì)胞群提供所述候選分化因
的方法，其中所述標(biāo)志物的表達(dá)增加。
的方法，其中所述標(biāo)志物的表達(dá)減少。
的方法，其中所述標(biāo)志物的表達(dá)通過(guò)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)
的方法，其中所述標(biāo)志物的表達(dá)通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)確定。
的方法，其中所述候選分化因子包括至少一種TGFii超家族的生長(zhǎng)
的方法，其中所述至少一種TGFii超家族的生長(zhǎng)因子是活化素A。 的方法，其中所述候選分化因子包括小分子。
的方法，其中所述候選分化因子包括多肽。
的方法，其中所述候選分化因子不是TGFii超家族的生長(zhǎng)因子。
.85的方法,其中以約O. lng/ml至約10mg/ml的濃度向所述細(xì)胞群提供所述候選分化因子。210.段落185的方法，其中以約lng/ml至約lmg/ml的濃度向所述細(xì)胞群提供所述候選分化因子。211.段落185的方法，其中以約10ng/ml至約100 μ g/ml的濃度向所述細(xì)胞群提供所述候選分化因子。212.段落185的方法，其中以約100ng/ml至約10 μ g/ml的濃度向所述細(xì)胞群提供所述候選分化因子。213.段落185的方法，其中以約I μ g/ml的濃度向所述細(xì)胞群提供所述候選分化因子。214.鑒定能夠促進(jìn)包含人細(xì)胞的細(xì)胞群中中內(nèi)胚層細(xì)胞的分化的分化因子的方法，所述方法包括以下步驟獲得包含人中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群，向所述細(xì)胞群提供候選分化因子，確定所述細(xì)胞群中標(biāo)志物在第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，確定所述細(xì)胞群中相同標(biāo)志物在第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，其中所述第二時(shí)間點(diǎn)在所述第一時(shí)間點(diǎn)之后，并且其中所述第二時(shí)間點(diǎn)在向所述細(xì)胞群提供所述候選分化因子之后，以及確定所述細(xì)胞群中該標(biāo)志物在所述第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與所述細(xì)胞群中該標(biāo)志物在所述第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)相比是否增加或減少， 其中所述細(xì)胞群中所述標(biāo)志物表達(dá)的增加或減少表明所述候選分化因子能夠促進(jìn)所述中內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。215.段落214的方法，其中所述細(xì)胞群中所述人中內(nèi)胚層細(xì)胞占所述人細(xì)胞的至少約10%o216.段落214的方法，其中所述細(xì)胞群中存在人飼養(yǎng)細(xì)胞，并且其中至少約10%的除所述飼養(yǎng)細(xì)胞外的所述人細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。217.段落214的方法，其中所述細(xì)胞群中所述人中內(nèi)胚層細(xì)胞占所述人細(xì)胞的至少約50%。218.段落214的方法，其中所述細(xì)胞群中存在人飼養(yǎng)細(xì)胞，并且其中至少約50% 的除所述飼養(yǎng)細(xì)胞外的所述人細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。219.段落214的方法，其中所述人中內(nèi)胚層細(xì)胞響應(yīng)所述候選分化因子分化為選自中胚層細(xì)胞和定形內(nèi)胚層的細(xì)胞。
的方法，其中所述人中內(nèi)胚層細(xì)胞響應(yīng)所述候選分化因子分化為中
的方法，其中所述標(biāo)志物選自FOXFl、FLKl、BMP4、MOXl和SDFl。 的方法，其中所述人中內(nèi)胚層細(xì)胞響應(yīng)所述候選分化因子分化為定
的方法，其中所述標(biāo)志物選自CXCR4和SOXl7。
的方法，其中所述第一時(shí)間點(diǎn)在向所述細(xì)胞群提供所述候選分化因
的方法，其中所述第一時(shí)間點(diǎn)與向所述細(xì)胞群提供所述候選分化因
的方法，其中所述第一時(shí)間點(diǎn)在向所述細(xì)胞群提供所述候選分化因
的方法，其中所述標(biāo)志物的表達(dá)增加。
的方法，其中所述標(biāo)志物的表達(dá)減少。
的方法，其中所述標(biāo)志物的表達(dá)通過(guò)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)
的方法，其中所述標(biāo)志物的表達(dá)通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)確定。
的方法，其中所述候選分化因子包括至少一種TGFii超家族的生長(zhǎng)
的方法，其中所述至少一種TGFii超家族的生長(zhǎng)因子是活化素A。 的方法，其中所述候選分化因子包括小分子。
的方法，其中所述候選分化因子包括多肽。
的方法，其中所述候選分化因子不是TGFii超家族的生長(zhǎng)因子。 段落214的方法,其中以約O. lng/ml至約10mg/ml的濃度向所述細(xì)胞群提供
的方法，其中以約lng/ml至約lmg/ml的濃度向所述細(xì)胞群提供所
的方法，其中以約10ng/ml至約100 μ g/ml的濃度向所述細(xì)胞群提
的方法，其中以約100ng/ml至約10 μ g/ml的濃度向所述細(xì)胞群提
的方法，其中以約I μ g/ml的濃度向所述細(xì)胞群提供所述候選分化220.段落214胚層細(xì)胞。
221.段落220
222.段落214形內(nèi)胚層細(xì)胞。
223.段落222
224.段落214子之前。
225.段落214子大致同時(shí)。
226.段落214子之后。
227.段落214
228.段落214
229.段落214確定。
230.段落214
231.段落214因子。
232.段落231
233.段落214
234.段落214
235.段落214
236.段落214丨所述候選分化因子。
237.段落214述候選分化因子。
238.段落214供所述候選分化因子。
239.段落214供所述候選分化因子。
240.段落214因子。241.在體外提高人胚胎干細(xì)胞(hESC)中FGF8基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法，所述方法包括在含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基中獲得所述hESC，并且使所述hESC接觸足以增加FGF8基因產(chǎn)物的表達(dá)的量的分化因子。242.段落241的方法，其中所述分化因子包括至少一種TGF β超家族的生長(zhǎng)因子。243.段落242的方法，其中所述分化因子包括活化素Α。244.段落241的方法，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。245.在體外提高人胚胎干細(xì)胞(hESC)或前原條細(xì)胞中選自brachyury、FGF4 和SNAIl的基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法，所述方法包括在包含少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基中獲得所述hESC或前原條細(xì)胞，并且使所述hESC或所述前原條細(xì)胞接觸足以增加選自 brachyury、FGF4和SNAIl的基因產(chǎn)物的表達(dá)的量的細(xì)胞因子。246.段落245的方法，其中所述分化因子包括至少一種TGF0超家族的生長(zhǎng)因子。247.段落246的方法，其中所述分化因子包括活化素A。248.段落245的方法，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。249.包含人胚胎干細(xì)胞(hESC)和含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述hESC在參考時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始分化，以至于與所述hESC中基線FGF8 mRNA表達(dá)相比，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約6小時(shí)時(shí)FGF8 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。250.段落249的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)時(shí)FGF8 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。251.段落250的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中在距所述參考時(shí)間點(diǎn)約6小時(shí)至約24小時(shí)之間 FGF8 mRNA的表達(dá)達(dá)到峰值。252.段落249的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約17小時(shí)時(shí)β -連接素多肽開(kāi)始向細(xì)胞核定位。253.段落249的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)時(shí)brachyury mRNA 的表達(dá)顯著上調(diào)。254.段落253的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約48小時(shí)時(shí)brachyury mRNA 的表達(dá)顯著下調(diào)。255.段落254的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中在距所述參考時(shí)間點(diǎn)約12小時(shí)至約48小時(shí)之間brachyury mRNA的表達(dá)達(dá)到峰值。256.段落255的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約72小時(shí)時(shí)brachyury mRNA 不顯著表達(dá)。257.段落249的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)時(shí)FGF4 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。258.段落257的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約48小時(shí)時(shí)FGF4 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。259.段落258的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中在距所述參考時(shí)間點(diǎn)約12小時(shí)至約48小時(shí)之間FGF4 mRNA的表達(dá)達(dá)到峰值。260.段落259的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約72小時(shí)時(shí)FGF4 mRNA不顯著表達(dá)。
261.段落249的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)時(shí)brachyury和 FGF4 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。262.段落261的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約48小時(shí)時(shí)brachyury和 FGF4 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。263.段落262的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中在距所述參考時(shí)間點(diǎn)約12小時(shí)至約48小時(shí)之間brachyury和FGF4 mRNA的表達(dá)達(dá)到峰值。264.段落263的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約72小時(shí)時(shí)brachyury和 FGF4 mRNA不顯著表達(dá)。265.段落249的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)時(shí)SNAIl mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。266.段落265的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約48小時(shí)時(shí)SNAIl mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。267.段落266的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中在距所述參考時(shí)間點(diǎn)約12小時(shí)至約48小時(shí)之間SNAIl mRNA的表達(dá)達(dá)到峰值。268.段落249的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約12小時(shí)時(shí)E-鈣粘著素 mRNA的表達(dá)開(kāi)始下調(diào)。269.段落 249 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。270.段落 249 表達(dá)顯著上調(diào)。271.段落249的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約96小時(shí)時(shí)F0XA2 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。272.段落 249273.段落 249274.段落 249275.段落 249276.段落 249277.段落 276278.段落 277
的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約48小時(shí)時(shí)E-鈣粘著素的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時(shí)間點(diǎn)約48小時(shí)時(shí)SOX17 mRNA的
的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約I % (v/v)的血清。 的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約O. 2% (v/v)的血清。 的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。
的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。 的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含TGFii超家族的分化因子。
的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述分化因子包括活化素A。
的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述活化素A以約100ng/ml的濃度存在。279.包含人胚胎干細(xì)胞(hESC)、TGFP超家族的分化因子和含有少于約2% (v/ V)血清的培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物。280.段落279的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，選自FGF8、Nodal、 HEG、HEYU GATA2、BIK 和 IDl 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAIU Wnt3、 MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之
前上調(diào)。281.段落280的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，選自FGF8、Nodal、 HEG、HEYU GATA2、BIK 和 IDl 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAIU Wnt3、 MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標(biāo)志物基因的峰值表達(dá)之
前上調(diào)。
282.段落281的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，選自HEY1、GATA2、 BIK 和 IDl 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAIl、Wnt3、MIXLl、DKK4、NET01、 T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的標(biāo)志物基因的峰值表達(dá)之前或大約同時(shí)下調(diào)。283.段落279的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，選自FGF8、Nodal、 HEG、HEY1、GATA2、BIK和IDl的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之如上調(diào)。284.段落283的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，選自brachyury、 FGF4、SNAII、Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前或大致同時(shí)上調(diào)。285.段落284的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，選自brachyury、 FGF4、SNAII、Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標(biāo)志物基因在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前或大致同時(shí)達(dá)到其
峰值表達(dá)。286.段落283的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，選自FGF8、Nodal、 HEG、HEYU GATA2、BIK 和 IDl 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAIU Wnt3、 MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之
前上調(diào)。287.段落279的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約1% (v/v)的血清。288.段落279的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約0. 2% (v/v)的血清。289.段落279的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。290.段落279的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。291.段落279的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述TGF β超家族的分化因子包括活化素A。292.段落291的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述活化素A以約100ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)基中。293.在細(xì)胞培養(yǎng)物中分化細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)使包含人胚胎干細(xì)胞 (hESC)的細(xì)胞培養(yǎng)物與含有少于約2%血清的培養(yǎng)基接觸，(b)向所述hESC提供TGFii超家族的分化因子，以及(c)允許所述hESC的分化發(fā)生。294.段落283的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，選自FGF8、Nodal、HEG、 HEY1、GATA2、BIK 和 IDl 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAIl、Wnt3、MIXLl、 DKK4、NET01、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl和GRM4的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前上調(diào)。295.段落294的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，選自FGF8、Nodal、HEG、 HEY1、GATA2、BIK 和 IDl 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAIl、Wnt3、MIXLl、 DKK4、NET01、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl和GRM4的標(biāo)志物基因的峰值表達(dá)之前上調(diào)。296.段落295的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，選自HEYl、GATA2、BIK和 IDl 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAII、Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、Τ、 DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的標(biāo)志物基因的峰值表達(dá)之前或大致同時(shí)下調(diào)。297.段落293的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，選自FGF8、Nodal、HEG、 HEY1、GATA2、BIK和IDl的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之如上調(diào)。298.段落297的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，選自brachyury、FGF4、 SNAIl、Wnt3、MIXLl、DKK4、NET01、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標(biāo)志物基因的 表達(dá)在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXL1的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前或大致同時(shí)上調(diào)。299.段落298的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，選自brachyury、FGF4、 SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NET01、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1 和 GRM4 的標(biāo)志物基因 在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXL1的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前或大致同時(shí)達(dá)到其峰值 表達(dá)。300.段落297的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，選自FGF8、Nodal、HEG、 HEY1、GATA2、BIK 和 ID1 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAIl、Wnt3、MIXLl、 DKK4、NET01、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前上調(diào)。301.段落293的方法，其中所述培養(yǎng)基包含少于約1 % (v/v)的血清。302.段落293的方法，其中所述培養(yǎng)基包含少于約0. 2% (v/v)的血清。303.段落293的方法，其中所述培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。304.段落293的方法，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。305.段落293的方法，其中所述TGF0超家族的分化因子包括活化素A。306.段落305的方法，其中所述活化素A以約100ng/ml的濃度存在于所述培養(yǎng)基 中。307.包含人胚胎干細(xì)胞(hESC)和含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基的細(xì)胞培 養(yǎng)物，其中所述hESC在參考時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始分化，以至于距所述參考時(shí)間點(diǎn)約2小時(shí)時(shí)所述 hESC中選自FZD10、FGF5和0CT4的mRNA的表達(dá)與選自FZD10、FGF5和0CT4的相應(yīng)mRNA 的基線表達(dá)相比顯著上調(diào)。308.段落307的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約1% (v/v)的血清。309.段落307的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約0. 2% (v/v)的血清。310.段落307的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。311.段落307的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。312.段落307的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含TGF0超家族的分化因子。313.段落312的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述分化因子包括活化素A。314.段落313的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述活化素A以約100ng/ml的濃度存在。315.包含人胚胎干細(xì)胞(hESC)和含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基的細(xì)胞培 養(yǎng)物，其中所述hESC在參考時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始分化，以至于距所述參考時(shí)間點(diǎn)約2小時(shí)時(shí)所述 hESC中選自GBX2、ZFP42和S0X2的mRNA的表達(dá)與選自GBX2、ZFP42和S0X2的相應(yīng)mRNA 的基線表達(dá)相比顯著下調(diào)。316.段落315的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約1% (v/v)的血清。317.段落315的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約0. 2% (v/v)的血清。318.段落315的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。319.段落315的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。320.段落315的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含TGF0超家族的分化因子。321.段落320的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述TGF 0超家族的分化因子包括活化素A。
322.段落321的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述活化素A以約100ng/ml的濃度存在。323.包含人胚胎干細(xì)胞(hESC)、TGFP超家族的分化因子和含有少于約2% (v/ V)血清的培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，在選自FGF8、Nodal、HEG、 HEY1、GATA2、BIK和IDl的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前選自FZD10、FGF5、Nanog和0CT4的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)，或者選自GBX2、ZFP42和S0X2的標(biāo)志物基因的表達(dá)下調(diào)。324.段落 323 的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中在選自 brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXLl、 DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACI1、FLJ22662、SLIT2、GADl和GRM4的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前選自 FZD10、FGF5、Nanog和0CT4的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)，或者選自GBX2、ZFP42和S0X2的標(biāo)志物基因的表達(dá)下調(diào)。325.段落323的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約1% (v/v)的血清。326.段落323的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約O. 2% (v/v)的血清。327.段落323的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。328.段落323的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。329.段落323的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含TGFβ超家族的分化因子。330.段落329的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述TGF β超家族的分化因子包括活化素A。331.段落330的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述活化素A以約100ng/ml的濃度存在。332.分化細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)使包含人胚胎干細(xì)胞 (hESC)的細(xì)胞培養(yǎng)物與包含少于約2%血清的培養(yǎng)基接觸，(b)向所述hESC提供TGFii超家族的分化因子，以及(c)允許所述hESC分化的發(fā)生，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞中，在選自FGF8、Nodal、HEG、HEYl、GATA2、BIK和IDl的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前選自FZD10、 FGF5、Nanog和0CT4的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)，或者選自GBX2、ZFP42和S0X2的標(biāo)志物基因的表達(dá)下調(diào)。333.段落 332 所述的方法，其中在選自 brachyury、FGF4、SNAIU Wnt3、MIXLU DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GADl和GRM4的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前選自 FZD10、FGF5、Nanog和0CT4的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)，或者選自GBX2、ZFP42和S0X2的標(biāo)志物基因的表達(dá)下調(diào)。334.段落332的方法，其中所述培養(yǎng)基包含少于約I % (v/v)的血清。335.段落332的方法，其中所述培養(yǎng)基包含少于約O. 2% (v/v)的血清。336.段落332的方法，其中所述培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。337.段落332的方法，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。338.段落332的方法，還包含TGFβ超家族的分化因子。339.段落338的方法，其中所述分化因子包括活化素Α。340.段落339的方法，其中所述活化素A以約100ng/ml的濃度存在。應(yīng)理解上述方法和組合物涉及體外培養(yǎng)的細(xì)胞。但是，上述的體外分化的細(xì)胞組合物可用于體內(nèi)應(yīng)用。本發(fā)明的其他實(shí)施方案也可參見(jiàn)以下專利申請(qǐng)于2003年12月23日提交的題為 DEFINITIVE END0DERM(定形內(nèi)胚層)的第60/532，004號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)；于2004年4 月27日提交的題為PDXl EXPRESSING END0DERM (表達(dá)PDXl的內(nèi)胚層)的第60/566，293 號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)；于2004年7月9日提交的題為CHEM0KINE CELL SURFACE RECEPTORFOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM(用于分離定形內(nèi)胚層的趨化因子細(xì)胞表面受體)的第60/586，566號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)；于2004年7月14日提交的題為CHEM0KINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE END0DERM(用于分離定形內(nèi)胚層的趨化因子細(xì)胞表面受體)的第60/587，942號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)；于2004年12月23 日提交的題為DEFINITIVE END0DERM(定形內(nèi)胚層)的第11/021，618號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)；于 2005年4月26日提交的題為TOXl EXPRESSING END0DERM(表達(dá)TOXl的定形內(nèi)胚層)的第 11/115，868號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)；于2005年6月23日提交的題為METHODS FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DEFFERENTIATING DEFINITIVE END0DERM(鑒定用于分化定形內(nèi)胚層的因子的方法)的第11/165，305號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)和于2005年6月23日提交的題為PREPRMITIVE STREAK CELLS AND MESEND0DERM CELLS (前原條細(xì)胞和中內(nèi)胚層細(xì)胞)的第60/693，364號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)，其公開(kāi)在此整體并入以供參考。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖I是描述在活化素存在下、在BMP4和SU5402組合存在下、和不存在任何分化因子時(shí)胚胎干細(xì)胞(ESC)的分化的示意圖。還列出了一些對(duì)鑒定和/或檢測(cè)每種細(xì)胞類型有用的標(biāo)志物基因。圖2A-M是顯示可用于鑒定定形內(nèi)胚層細(xì)胞的標(biāo)志物基因的表達(dá)模式的條形圖。 圖G-L依次顯示了定形內(nèi)胚層標(biāo)志物FGF17、VWF、CALCR、F0XQ1、CMK0R1和CRIPl的表達(dá)分析。圖A-F依次顯示了前述細(xì)胞系標(biāo)志基因S0X17、S0X7、S0X17/S0X7、TM、ZIC1和MOXl的表達(dá)分析。圖M顯不了 CXCR4的表達(dá)分析。對(duì)于圖A-M的每一圖,標(biāo)注hESC的列表不來(lái)自純化的人胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)；2NF表示細(xì)胞經(jīng)過(guò)2% FBS處理，不添加活化素；0. 1A100 表示細(xì)胞經(jīng)0. 1% FBS和100ng/ml活化素A處理；1A100表示細(xì)胞經(jīng)過(guò)1% FBS和IOOng/ ml活化素A處理；2A100表示細(xì)胞經(jīng)過(guò)2% FBS和100ng/ml活化素A處理。圖3是顯示了某些標(biāo)志物基因在㈧前原條細(xì)胞，(B-D)原條(中內(nèi)胚層)細(xì)胞， (E-F)中內(nèi)胚層和定形內(nèi)胚層細(xì)胞，(G)定形內(nèi)胚層細(xì)胞,和(H-L)滋養(yǎng)外胚層和原始內(nèi)胚層細(xì)胞中表達(dá)的條形圖。分化過(guò)程中，在向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入100ng/ml活化素A(用“A” 表明)或 100ng/mlBMP4 和 2. 5 μ M SU5402 的組合(用“B/SU” 表明)后的 0、6、12、24、48、 72和96小時(shí)時(shí)，通過(guò)Q-PCR確定標(biāo)志物的表達(dá)。所有細(xì)胞都生長(zhǎng)在在第一天(最初24小時(shí))含有0% (v/v)FBS、在第二天(24-48小時(shí))含有0.2% (v/v)FBS和在第三和第四天 (48-96小時(shí))含有2% (v/v)FBS的RPMI培養(yǎng)基中。表I提供了每種標(biāo)志物基因的全稱。圖4A-C是顯示在100ng/ml活化素A和0. 1% (v/v) FBS存在下，在hESC (用“ESC” 表明)分化的最初48小時(shí)中(A)中內(nèi)胚層的Brachyury標(biāo)志物(BRACH)，(B) hESC的E-鈣粘著素標(biāo)志物，和(C)中內(nèi)胚層的SNAII標(biāo)志物的mRNA表達(dá)模式的條形圖。圖5A和B是依次顯示了 100ng/ml活化素A和O. 1% (v/v)FBS (用“ESC”表明) 存在下，在hESC分化的最初48小時(shí)中，中內(nèi)胚層的Brachyury標(biāo)志物(BRACH)和定形內(nèi)胚層的性別決定區(qū)Y-Box 17 (S0X17)標(biāo)志物的mRNA表達(dá)模式的條形圖。圖6A-D是顯微圖片，顯示了在100ng/ml活化素A和0. 1% (v/v)FBS存在下， 從hESC分化48小時(shí)后的細(xì)胞。圖A顯示了用DAPI染色的細(xì)胞區(qū)域。圖B-D顯示了用抗 Brachyury (B)、抗SOX17 (C)或抗Brachyury和S0X17 二者(D)的抗體染色的相同細(xì)胞區(qū)域。圖7是描述了低血清條件下，存在100ng/ml活化素A(AlOO)或不存在活化素A(NF)時(shí)胚胎干細(xì)胞(ESC)的分化的示意圖。PS表示原條細(xì)胞(中內(nèi)胚層細(xì)胞)；DE表示定形內(nèi)胚層細(xì)胞；并且M表示中胚層細(xì)胞。圖8A-F是描述特定條件下細(xì)胞培養(yǎng)物中中胚層標(biāo)志物基因(A)BRACH，(B)FOXFl, (C)FLKl, (D)BMP4, (E)MOXl和(F)SDFl表達(dá)的條形圖，該特定條件為在100ng/ml活化素A 連續(xù)存在下孵育4天后(AlOO)，或孵育4天后但在第一天后撤除活化素A (NF)。通過(guò)Q-PCR 確定標(biāo)志物基因的表達(dá)。圖9A-C是描述特定條件下細(xì)胞培養(yǎng)物中定形內(nèi)胚層標(biāo)志物基因(A)GSC，(B) S0X17和(C) F0XA2表達(dá)的條形圖，該特定條件為在100ng/ml活化素A連續(xù)存在下孵育4天后(AlOO),或孵育4天后但在第一天后撤除活化素A(NF)。通過(guò)Q-PCR確定標(biāo)志物基因的表達(dá)。

圖10A-I是描述可用于鑒定和/或檢測(cè)定形內(nèi)胚層細(xì)胞的某些標(biāo)志物基因表達(dá)的條形圖。在含有O. 5%、2%或10%小牛血清(FBS)和100ng/ml活化素A (A100)或沒(méi)有活化素A (NF)的五天的細(xì)胞培養(yǎng)物中，通過(guò)Q-PCR確定標(biāo)志物基因的表達(dá)。圖IlA和B是描述了在100ng/ml活化素A存在下分化了 4天的細(xì)胞培養(yǎng)物中定形內(nèi)胚層標(biāo)志物(A)S0X17和(B)F0XA2表達(dá)的條形圖。通過(guò)Q-PCR確定分化過(guò)程中，加入活化素A后0、6、24、30、48和96小時(shí)時(shí)標(biāo)志物基因的表達(dá)。圖12A-D顯示了移植到免疫妥協(xié)小鼠的腎包膜下的定形內(nèi)胚層細(xì)胞的體內(nèi)分化。 各圖A-蘇木精-伊紅染色顯示腸管樣結(jié)構(gòu)；B-抗肝細(xì)胞特異性抗原(肝)的抗體免疫反應(yīng)性；C-抗絨毛蛋白(腸)的抗體免疫反應(yīng)性；和D-抗CDX2 (腸)的抗體免疫反應(yīng)性。詳細(xì)描述稱為原腸胚形成的早期人發(fā)育中的重要階段發(fā)生于受精后2-3周。原腸胚形成非常重要，因?yàn)樵谶@個(gè)階段三種主要胚層第一次特異化和組織化(Lu et al. ,2001； Schoenwolf和Smith，2000)。外胚層負(fù)責(zé)身體外表和整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)的最終形成，而中胚層衍生出心、血、骨、骨骼肌和其他結(jié)締組織。定形內(nèi)胚層被定義為負(fù)責(zé)整個(gè)腸管(包括食道、 胃、小腸和大腸)以及腸管衍生的器官(如肺、肝、胸腺、甲狀旁腺、甲狀腺、膽囊和胰腺)形成的胚層(Grapin-Botton 和 Melton, 2000 ;Kimelman 和 Griff in, 2000 ；Tremblay et al.， 2000 ;Wells和Melton，1999 ;Wells和Melton，2000))。定形內(nèi)胚層細(xì)胞與稱為原始內(nèi)胚層的完全分離細(xì)胞系有重要區(qū)別。原始內(nèi)胚層主要負(fù)責(zé)胚外組織的形成，主要是胎盤卵黃囊的腔壁和內(nèi)臟內(nèi)胚層部分和Reichert’ s膜的胞外基質(zhì)物質(zhì)。在原腸胚形成期，定形內(nèi)胚層形成過(guò)程起始于細(xì)胞遷移，其中中內(nèi)胚層細(xì)胞(有形成中胚層或內(nèi)胚層能力的細(xì)胞)遷移穿過(guò)稱為原條的結(jié)構(gòu)。當(dāng)中內(nèi)胚層進(jìn)入原條，它們經(jīng)歷表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，成為中胚層或定形內(nèi)胚層。定形內(nèi)胚層源自遷移穿過(guò)原條前部及節(jié)(在原條最前部區(qū)域的特化結(jié)構(gòu))的細(xì)胞。當(dāng)遷移發(fā)生時(shí)，定形內(nèi)胚層首先集中于最前部腸管，隨后以腸管后端的形成而終止。原條前體細(xì)胞(前原條細(xì)胞)和原條細(xì)胞(中內(nèi)胚層細(xì)胞)是產(chǎn)生中胚層和定形內(nèi)胚層的早期階段前體細(xì)胞。事實(shí)上，前原條細(xì)胞和中內(nèi)胚層細(xì)胞可能是從多能性向由中胚層和定形內(nèi)胚層細(xì)胞系形成的終分化的細(xì)胞、組織和/或器官的發(fā)育過(guò)程中最早的前體。直到目前，尚未獲得富集人前原條細(xì)胞的細(xì)胞群或富集人中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群。而且，該細(xì)胞群的細(xì)胞之前未在體外被表征過(guò)。
考慮以上所述，本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含人前原條細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和/ 或富集細(xì)胞群，以及包含人中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或富集細(xì)胞群。這些實(shí)施方案中，前原條細(xì)胞和中內(nèi)胚層細(xì)胞能夠進(jìn)一步分化為中胚層細(xì)胞和/或定形內(nèi)胚層細(xì)胞以及源自這些細(xì)胞系的細(xì)胞、組織和/或器官。本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及制備包含人前原條細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或富集細(xì)胞群，以及制備包含人中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或富集細(xì)胞群的方法。本文所述其它實(shí)施方案涉及鑒定可用于使包含前原條細(xì)胞或中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群中細(xì)胞分化的一種或多種分化因子的篩選方法。這些因子可用于促進(jìn)這些細(xì)胞類型向中胚層和/或定形內(nèi)胚層細(xì)胞以及源自這些細(xì)胞系的細(xì)胞、組織和/或器官的分化。本發(fā)明的某些其它方面涉及提高某些早期階段細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的方法。其它方面涉及包含在分化過(guò)程中表達(dá)某些標(biāo)志物的細(xì)胞的細(xì)胞組合物。定義貫穿本申請(qǐng)的某些術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)具有以下所描述的意義此處使用的“胚胎的”指有機(jī)體的一系列發(fā)育階段，開(kāi)始于單一受精卵，結(jié)束于多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這種多細(xì)胞結(jié)構(gòu)除了發(fā)育的配子生殖細(xì)胞外不再包含多能性或全能細(xì)胞。除了來(lái)自配子融合的胚胎，術(shù)語(yǔ)“胚胎的”也指來(lái)自體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的胚胎。本文使用的“專能的(multipotent) ”或“專能細(xì)胞(multipotent cell)”指能產(chǎn)生有限數(shù)量的其它具體細(xì)胞類型的細(xì)胞類型。本文使用的“表達(dá)”指材料或物質(zhì)的產(chǎn)生以及材料或物質(zhì)產(chǎn)生的水平或數(shù)量。因此，檢測(cè)特定標(biāo)志物的表達(dá)指測(cè)定表達(dá)標(biāo)志物的相對(duì)或絕對(duì)量,或僅僅檢測(cè)標(biāo)志物的存在或缺失。此處使用的“標(biāo)志物”指能夠被觀察或檢測(cè)到的任何分子。例如，標(biāo)志物可包括但不局限于核酸，如特異基因的轉(zhuǎn)錄本、基因的多肽產(chǎn)物、非基因多肽產(chǎn)物、糖蛋白、糖、糖脂、 脂質(zhì)、脂蛋白或小分子(例如，分子量小于10，OOOamu的分子)。當(dāng)涉及細(xì)胞培養(yǎng)物和/或細(xì)胞群時(shí)，術(shù)語(yǔ)“部分”表示細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群任意不為零的數(shù)量，范圍從單個(gè)細(xì)胞到整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群。關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中的細(xì)胞，術(shù)語(yǔ)“基本上不含”表示細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群不含的特異細(xì)胞類型在細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群的所有細(xì)胞中占有的比例少于5%。關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，此處使用的“低血清RPMI ”指含有低血清的培養(yǎng)基，其中血清濃度在限定的時(shí)間段內(nèi)逐漸增強(qiáng)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，低血清RPMI在細(xì)胞生長(zhǎng)的第一天包含濃度為約O. 2%的小牛血清(FBS)，在細(xì)胞生長(zhǎng)的第二天包含濃度為約O. 5% 的小牛血清(FBS)，在細(xì)胞生長(zhǎng)的第三天到第五天包含濃度為約2%的小牛血清(FBS)。另一實(shí)施方案中，低血清RPMI在第一天包含濃度為約O %的，在第二天包含濃度為約O. 2% 的，以及在第三天及以后包含約2%的。本文使用的“血清替代物”指包含IGF或胰島素的血清替代物。hESC向定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化中早期事件的模型圖I顯示了總結(jié)在體外人胚胎干細(xì)胞(hESC)早期轉(zhuǎn)變的模型?？梢酝ㄟ^(guò)在低血清添加情況下使用高劑量的活化素A組織hESC通過(guò)接近重演原腸胚形成的過(guò)程的分化。約 24小時(shí)(前原條細(xì)胞)之前FGF8和核定位的β -連接素的表達(dá)(其為原條形成之前發(fā)生在最接近的上胚層的事件)明顯。原條表達(dá)基因(brachyury和FGF4)的高水平表達(dá)發(fā)生在約24小時(shí)。如果保持在高劑量活化素A中，該原條細(xì)胞(中內(nèi)胚層細(xì)胞)有效地轉(zhuǎn)化為定形內(nèi)胚層。相反，缺乏活化素時(shí)，這些中內(nèi)胚層前體成為中胚層。用BMP4和SU5402處理 hESC誘導(dǎo)與原始內(nèi)胚層和滋養(yǎng)外胚層相關(guān)的基因表達(dá)。前原條細(xì)胞和中內(nèi)胚層細(xì)胞及其相關(guān)過(guò)程本發(fā)明的實(shí)施方案涉及在培養(yǎng)物中生成前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞的新的確定方法，其通過(guò)將諸如干細(xì)胞的多能性細(xì)胞分化為前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。如上所述，前原條細(xì)胞能夠分化中內(nèi)胚層細(xì)胞以及源于它們的細(xì)胞、組織和/或器官。 中內(nèi)胚層細(xì)胞能夠分化中胚層細(xì)胞和/或定形內(nèi)胚層細(xì)胞以及源于這些細(xì)胞系中任一種的細(xì)胞、組織和/或器官。一些實(shí)施方案中，前原條細(xì)胞經(jīng)過(guò)中內(nèi)胚層中間體轉(zhuǎn)化為中胚層或定形內(nèi)胚層細(xì)胞系的終末分化的細(xì)胞。如以下將要進(jìn)一步詳細(xì)描述的，這些方法可以提供有效生成多種人內(nèi)胚層和中胚層衍生組織的基礎(chǔ)。例如，這些方法可以提供有效生成人內(nèi)胚層衍生的組織，如胰、肝、肺、胃、腸、甲狀腺、胸腺、咽、膽囊和膀胱的基礎(chǔ)。重要地，前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞的產(chǎn)生是干細(xì)胞向功能性的產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞分化的早期步驟。作為另一例子，前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞可以提供有效生成人中胚層衍生的組織，如血細(xì)胞、心血管組織、骨組織和其它結(jié)構(gòu)和結(jié)締組織的基礎(chǔ)。為了獲得有用量的任何上述的細(xì)胞或組織類型，在達(dá)到終末分化的細(xì)胞命運(yùn)之前，期望發(fā)生的每個(gè)分化步驟都是高效的。因?yàn)楦杉?xì)胞分化為前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞代表著生成功能性中胚層和定形內(nèi)胚層細(xì)胞系的終末分化細(xì)胞的最初步驟(如圖I所示)，特別需要此步分化高效。鑒于分化多能性細(xì)胞至前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞的需要，本發(fā)明一些方面涉及體外方法學(xué)，將約5-90%的多能性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榍霸瓧l細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞。典型地，這些方法包括以已確定及暫時(shí)指定的方式使用培養(yǎng)物及生長(zhǎng)因子。通過(guò)基于差異熒光標(biāo)志物表達(dá)揀選細(xì)胞，從細(xì)胞群中將前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞與其它細(xì)胞分離和/ 或純化，可獲得前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞細(xì)胞群的更大富集。這樣，本文所述一些實(shí)施方案涉及前原條細(xì)胞及制備和分離和/或純化這些細(xì)胞的方法。其它實(shí)施方案涉及中內(nèi)胚層細(xì)胞及制備和分離和/或純化這些細(xì)胞的方法。為了確定細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群內(nèi)前原條細(xì)胞細(xì)胞的數(shù)量,需要從培養(yǎng)物或細(xì)胞群中區(qū)分這類細(xì)胞與其它細(xì)胞的方法。因此，本發(fā)明實(shí)施方案涉及細(xì)胞標(biāo)志物，其存在、缺失和/或相對(duì)表達(dá)水平對(duì)前原條細(xì)胞是特異的，以及檢測(cè)確定這些標(biāo)志物表達(dá)的方法。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，標(biāo)志物表達(dá)的存在與否和/或其水平由定量 PCR(Q-PCR)確定。例如，一些遺傳標(biāo)志物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本量，例如0CT4、ECAD、FGF8、β-連接素、brachyury、FGF4、SNA 11、SOX17、CXCR4、GSC、MI XL I、F0XA2、S0X7、FOXF UFLKU BML4、 MOXUSDFl及本文所述的其它標(biāo)志物，由定量Q-PCR確定。其它實(shí)施方案中，免疫組化技術(shù)用于檢測(cè)上述基因表達(dá)的蛋白。其它實(shí)施方案中，免疫組化技術(shù)/免疫細(xì)胞化學(xué)用于檢測(cè)例如核定位的連接素的某些多肽標(biāo)志物的細(xì)胞區(qū)室定位。其它實(shí)施方案中，Q-PCR及免疫組化技術(shù)用于識(shí)別及確定這些標(biāo)志物的量或相對(duì)比例。通過(guò)使用如上述的確定一種或多種合適的標(biāo)志物表達(dá)的方法，在細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群內(nèi)識(shí)別前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞以及確定前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞的比例是可能的。例如，本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生的前原條細(xì)胞或細(xì)胞群表達(dá)FGF8標(biāo)志物和/或核定位的β_連接素的水平比非前原條細(xì)胞類型或細(xì)胞群高約2個(gè)數(shù)量級(jí)。在其它實(shí)施方案中，產(chǎn)生的前原條細(xì)胞或細(xì)胞群表達(dá)FGF8標(biāo)志物和/或核定位的β -連接素的水平比非前原條細(xì)胞細(xì)胞類型或細(xì)胞群高2個(gè)數(shù)量級(jí)以上。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中， 產(chǎn)生的中內(nèi)胚層細(xì)胞或細(xì)胞群表達(dá)brachyury、FGF4和/或SNAIl標(biāo)志物的水平比非中內(nèi)胚層細(xì)胞類型或細(xì)胞群高約2個(gè)數(shù)量級(jí)。其它實(shí)施方案中，產(chǎn)生的中內(nèi)胚層細(xì)胞或細(xì)胞群表達(dá)brachyury、FGF4和/或SNAIl標(biāo)志物的水平比非中內(nèi)胚層細(xì)胞類型或細(xì)胞群高2個(gè)數(shù)量級(jí)以上。本文所述實(shí)施方案還涉及前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞組合物。例如，一些實(shí)施方案涉及包括前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，然而其它的涉及富集了前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群。一些優(yōu)選的實(shí)施方案涉及包括前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中至少約5-90%的細(xì)胞為前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞。特別優(yōu)選的實(shí)施方案涉及包括人細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物中至少約 5-90%的人細(xì)胞為前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞。由于分化方法的效果可以通過(guò)改變一些參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，這些參數(shù)包括但不限于細(xì)胞生長(zhǎng)條件、生長(zhǎng)因子濃度及培養(yǎng)步驟的時(shí)間安排，本發(fā)明所述的分化方法可使約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約95%、或大于95%的多能性細(xì)胞轉(zhuǎn)化為前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，考慮將諸如干細(xì)胞群體的多能性細(xì)胞群轉(zhuǎn)化為基本純的前原條細(xì)胞和 /或中內(nèi)胚層細(xì)胞群。本發(fā)明所述的組合物及方法具有幾個(gè)有用的特征。例如，包括前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物及細(xì)胞群，以及制備這些細(xì)胞培養(yǎng)物及細(xì)胞群的方法可用于模建人發(fā)育的早期階段。此外，本發(fā)明所述的組合物及方法也可用于諸如糖尿病的疾病的治療性干預(yù)。例如，由于前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞僅為有限數(shù)量的組織的來(lái)源，因而其可用于發(fā)育純的組織或細(xì)胞類型。從多能件細(xì)胞產(chǎn)牛前原條細(xì)胞產(chǎn)生前原條細(xì)胞的一些方法中，作為起始材料的多能性細(xì)胞是干細(xì)胞。某些方法中，從胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生包含前原條細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和富集的細(xì)胞群。優(yōu)選的衍生前原條細(xì)胞的方法利用人胚胎干細(xì)胞作為制備前原條細(xì)胞的起始材料。這些多能性細(xì)胞可以是衍生于桑椹胚、胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或從胚胎生殖嵴獲得的細(xì)胞。使用現(xiàn)有技術(shù)已知的方法，人胚胎干細(xì)胞可在培養(yǎng)基中保持多能性狀態(tài)而基本不分化。所述的方法在諸如第5，453，357、 5，670，372,5, 690，926,5, 843，780,6, 200，806 及 6，251，671 號(hào)美國(guó)專利中有所描述，其公開(kāi)在此整體并入以供參考。在產(chǎn)生前原條細(xì)胞的一些方法中，hESC維持在滋養(yǎng)層。在這些方法中，任何能夠使hESC保持在多能性狀態(tài)的滋養(yǎng)層都可使用。一種常用的培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的滋養(yǎng)層為一層小鼠成纖維細(xì)胞。最近，人成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層也已開(kāi)發(fā)出來(lái)用于培養(yǎng)hESC(參見(jiàn)第 2002/0072117號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)中公開(kāi)的方法，其公開(kāi)在此整體并入以供參考)。產(chǎn)生前原條細(xì)胞的其它方法允許不使用滋養(yǎng)層而保持多能性hESC。在沒(méi)有滋養(yǎng)層條件下保持多能 hESC的方法已在第2003/0175956號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)中有描述，其公開(kāi)在此整體并入以供參考。
本發(fā)明所述的人胚胎干細(xì)胞可以保持在具有或不具有血清的培養(yǎng)基中。在一些胚胎干細(xì)胞保持方法中，使用血清替代品。在其它方法中，使用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)，如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?003/0190748所述，其公開(kāi)在此全部引入，以供參考。在培養(yǎng)基中保持多能性狀態(tài)的干細(xì)胞按照常規(guī)傳代，直到分化為前原條細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，分化至前原條細(xì)胞的完成是通過(guò)向干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入分化因子，如 TGF^超家族的生長(zhǎng)因子，其加入的量足以促進(jìn)至前原條細(xì)胞的分化。用于制備前原條細(xì)胞的TGFii超家族生長(zhǎng)因子選自Nodal/活化素亞群。一些優(yōu)選的分化方法中，生長(zhǎng)因子選自 Nodal、活化素A和活化素B。在某些分化方法中，使用生長(zhǎng)因子活化素A。關(guān)于從多能性干細(xì)胞向前原條細(xì)胞分化的一些方法，向細(xì)胞中加入的上述生長(zhǎng)因子，使其在培養(yǎng)基中的濃度足以促進(jìn)至少一部分干細(xì)胞分化至前原條細(xì)胞。一些方法中，培養(yǎng)基中上述生長(zhǎng)因子的濃度至少約5ng/ml、至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ ml、至少約500ng/ml、至少約1000ng/ml、至少約2000ng/ml、至少約3000ng/ml、至少約 4000ng/ml、至少約 5000ng/ml 或大于 5000ng/ml。在使多能干細(xì)胞向前原條細(xì)胞分化的某些方法中，上述生長(zhǎng)因子加入培養(yǎng)基后需要被從細(xì)胞培養(yǎng)物中除去。例如，生長(zhǎng)因子的除去時(shí)間約I小時(shí)之內(nèi)、約2小時(shí)之內(nèi)、約3小時(shí)之內(nèi)、約4小時(shí)之內(nèi)、約5小時(shí)之內(nèi)、約6小時(shí)之內(nèi)、約7小時(shí)之內(nèi)、約8小時(shí)之內(nèi)、約9小時(shí)之內(nèi)、約10小時(shí)之內(nèi)、約11小時(shí)之內(nèi)、約12小時(shí)之內(nèi)、約13小時(shí)之內(nèi)、約14小時(shí)之內(nèi)、 約15小時(shí)之內(nèi)、約16小時(shí)之內(nèi)、約17小時(shí)之內(nèi)、約18小時(shí)之內(nèi)、約19小時(shí)之內(nèi)、約20小時(shí)之內(nèi)、約21小時(shí)之內(nèi)、約22小時(shí)之內(nèi)、約23小時(shí)之內(nèi)、約24小時(shí)之內(nèi)或約多于24小時(shí)之內(nèi)。前原條細(xì)胞的培養(yǎng)物可生長(zhǎng)在包含少量血清或無(wú)血清的培養(yǎng)基中。在某些培養(yǎng)條件下，血清的濃度范圍為約0% (v/v)至約10% (ν/ν) ο例如，在一些分化方法中，培養(yǎng)基中血清的濃度可以低于約0.05% (v/v)、低于約0. 1% (v/v)、低于約0.2% (v/v)、低于約 0. 3% (v/v)、低于約 0.4% (v/v)、低于約 0. 5% (v/v)、低于約 0.6% (v/v)、低于約 0. 7% (v/v)、低于約0.8% (v/v)、低于約0.9% (v/v)、低于約1% (v/v)、低于約2% (v/v)、低于約3% (v/v)、低于約4% (v/v)、低于約5% (v/v)、低于約6% (v/v)、低于約7% (v/v)、低于約8% (v/v)、低于約9% (v/v)或低于約10% (ν/ν) ο在一些方法中，前原條細(xì)胞在無(wú)血清或無(wú)血清替代物下生長(zhǎng)。在其它方法中，前原條細(xì)胞在B27存在下生長(zhǎng)。在這些方法中， B27添加物的濃度范圍為約O. 1% (v/v)至約20% (v/v)。監(jiān)測(cè)多能件細(xì)胞向前原條細(xì)胞的分化hESC培養(yǎng)物至前原條細(xì)胞的進(jìn)程可以通過(guò)確定前原條細(xì)胞特征性標(biāo)志物的時(shí)間性表達(dá)來(lái)監(jiān)測(cè)。在一些方法中，一些標(biāo)志物的表達(dá)可通過(guò)標(biāo)志物的存在或缺失來(lái)確定。 或者，某些標(biāo)志物的表達(dá)可通過(guò)測(cè)定標(biāo)志物在細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群的細(xì)胞中，在加入分化因子之后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的水平來(lái)確定。在這些方法中，可以定性或定量測(cè)定標(biāo)志物的表達(dá)。定量標(biāo)志物基因產(chǎn)生的標(biāo)志物表達(dá)的一種方法可以使用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Q-PCR)。進(jìn)行Q-PCR的方法為現(xiàn)有技術(shù)?，F(xiàn)有技術(shù)已知的其它方法也可用于定量標(biāo)志物基因的表達(dá)。例如，標(biāo)志物基因產(chǎn)物的表達(dá)可以通過(guò)使用針對(duì)感興趣的特異標(biāo)志物基因產(chǎn)物的抗體來(lái)檢測(cè)。某些方法中，測(cè)定前原條細(xì)胞的特征性標(biāo)志物基因的表達(dá)，以及缺乏hESC及其它細(xì)胞類型的特征標(biāo)志物基因的顯著表達(dá)。其它方法中，確定前原條細(xì)胞的特征性標(biāo)志物基因在加入分化因子后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)的時(shí)間性和量。如以下實(shí)施例的進(jìn)一步所述，前原條細(xì)胞的標(biāo)志物為FGF8和β-連接素。這樣， 本發(fā)明所述方法制備的前原條細(xì)胞表達(dá)FGF8和β -連接素標(biāo)志物基因，由此產(chǎn)生FGF8和 β連接素標(biāo)志物基因產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)GF8 mRNA在前原條細(xì)胞但不在hESC中大量表達(dá)。FGF8 mRNA的顯著上調(diào)，直至接近峰值水平，可以在hESC接觸諸如活化素A的合適的分化因子后6小時(shí)時(shí)在分化中的hESC培養(yǎng)物中觀察到。此時(shí)，指示諸如中內(nèi)胚層、原始內(nèi)胚層、定形內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的其它細(xì)胞類型的標(biāo)志物(參見(jiàn)表I)的表達(dá)依然相對(duì)較低。一些實(shí)施方案中，指示中內(nèi)胚層、原始內(nèi)胚層、定形內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的標(biāo)志物在hESC接觸分化因子后6小時(shí)時(shí)不顯著表達(dá)。FGF8 mRNA的表達(dá)在hESC接觸分化因子后至少約24小時(shí)維持高水平，但是其后開(kāi)始下降。此外，hESC接觸諸如活化素A的合適的分化因子后17小時(shí)，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)觀察到β_連接素多肽的細(xì)胞核定位(細(xì)胞核定位的連接素的表達(dá))。hESC中，該β-連接素多肽存在于細(xì)胞外周但不在細(xì)胞核中。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)分化條件，在前原條細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)不同水平范圍的FGF8和細(xì)胞核定位的β連接素的表達(dá)。這樣，在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，在hESC分化的最初6至18小時(shí)內(nèi),FGF8標(biāo)志物和/或核定位的β -連接素標(biāo)志物在前原條細(xì)胞或細(xì)胞群的表達(dá)比這些標(biāo)志物在非前原條細(xì)胞或細(xì)胞群中的表達(dá)至少高約2倍至至少高約10，000倍。其它實(shí)施方案中，在hESC分化的最初6至18小時(shí)內(nèi)，F(xiàn)GF8標(biāo)志物和/或核定位的β -連接素標(biāo)志物在前原條細(xì)胞或細(xì)胞群的表達(dá)比FGF8標(biāo)志物和/或核定位的β -連接素標(biāo)志物在非前原條細(xì)胞或細(xì)胞群中的表達(dá)高至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15 倍、至少約20倍、至少約40倍、至少約80倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約200倍、 至少約500倍、至少約750倍、至少約1000倍、至少約2500倍、至少約5000倍、至少約7500 倍或至少約10，000倍。一些實(shí)施方案中，在hESC分化的最初6至18小時(shí)內(nèi)，F(xiàn)GF8標(biāo)志物和/或核定位的β -連接素標(biāo)志物在前原條細(xì)胞或細(xì)胞群的表達(dá)無(wú)限地高于FGF8標(biāo)志物和/或細(xì)胞核定位的β連接素標(biāo)志物在非前原條細(xì)胞或細(xì)胞群中的表達(dá)。還應(yīng)當(dāng)理解，在前原條細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)GF8標(biāo)志物的表達(dá)水平與brachyury、FGF4、 SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7和/或SOXl標(biāo)志物的表達(dá)水平存在差異范圍。類似地，在前原條細(xì)胞內(nèi)，核定位的β -連接素標(biāo)志物的表達(dá)水平與brachyury、FGF4、SNAI1、S0X17、F0XA2、 S0X7和/或SOXl標(biāo)志物的表達(dá)水平存在差異范圍。類似地，在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，F(xiàn)GF8 標(biāo)志物和/或核定位的β -連接素標(biāo)志物的表達(dá)比brachyury、FGF4、SNAIl、S0X17、F0XA2、 S0X7和/或SOXl標(biāo)志物的表達(dá)高至少約2倍至至少約10，000倍。其它實(shí)施方案中，F(xiàn)GF8 標(biāo)志物和/或核定位的β -連接素標(biāo)志物的表達(dá)比brachyury、FGF4、SNAIl、S0X17、F0XA2、 S0X7和/或SOXl標(biāo)志物的表達(dá)高至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約40倍、至少約80倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約 200倍、至少約500倍、至少約750倍、至少約1000倍、至少約2500倍、至少約5000倍、至少約 7500 倍或至少約 10，000 倍。一些實(shí)施方案中，brachyury、FGF4、SNAII、S0X17、F0XA2、 S0X7和/或SOXl標(biāo)志物在前原條細(xì)胞內(nèi)不顯著表達(dá)。前原條細(xì)胞的富集、分離和/或純化關(guān)于本發(fā)明方法的其它方面，前原條細(xì)胞可被富集、分離和/或純化。一些實(shí)施方案中，通過(guò)從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離此類細(xì)胞制備富集前原條細(xì)胞的細(xì)胞群。本文所述方法的一些實(shí)施方案中，前原條細(xì)胞被熒光標(biāo)記，然后通過(guò)熒光活化細(xì)胞分選器(FACS)將其從未標(biāo)記細(xì)胞中分離。這些實(shí)施方案中，編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核酸或編碼可表達(dá)突光標(biāo)志物的其它核酸被用于標(biāo)記前原條細(xì)胞。例如，一些實(shí)施方案中， 至少一個(gè)拷貝的編碼GFP或其生物活性片段的核酸被引入多能性細(xì)胞中，優(yōu)選為人胚胎干細(xì)胞，該核酸位于FGF8啟動(dòng)子下游，使得GFP基因產(chǎn)物或其生物活性片段的表達(dá)處于FGF8 啟動(dòng)子的控制之下。一些實(shí)施方案中，編碼FGF8的核酸的全部編碼區(qū)被編碼GFP或其生物活性片段的核酸替換。其它實(shí)施方案中，編碼GFP或其生物活性片段的核酸與至少部分 FGF8的核酸同框融合，因而提供融合蛋白。這些實(shí)施方案中，該融合蛋白保持與GFP類似的熒光活性。熒光標(biāo)記的細(xì)胞，如上述的多能性細(xì)胞，分化為如之前所述的前原條細(xì)胞。因?yàn)榍霸瓧l細(xì)胞表達(dá)熒光標(biāo)志物基因，而非前原條細(xì)胞不表達(dá)，因此這兩種細(xì)胞類型可被分開(kāi)。一些實(shí)施方案中，包含熒光標(biāo)記的前原條細(xì)胞和未標(biāo)記的非前原條細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物用FACS 分選。前原條細(xì)胞被從非前原條細(xì)胞分離收集，因而造成所述細(xì)胞類型的分離。如果需要的話，分離的細(xì)胞組合物可通過(guò)更多輪的分選被進(jìn)一步純化，該分選使用特異針對(duì)前原條細(xì)胞的相同或不同標(biāo)志物。除所述方法之外，可通過(guò)其它細(xì)胞分離技術(shù)分離前原條細(xì)胞。此外，可通過(guò)在特定生長(zhǎng)條件下連續(xù)次培養(yǎng)(subculture)的方法富集或分離前原條細(xì)胞，該特定生長(zhǎng)條件促進(jìn)前原條細(xì)胞的選擇性存活或選擇性生長(zhǎng)。應(yīng)該理解，上述的富集、分離和純化方法可用于任何分化階段的培養(yǎng)物。使用本文所述方法，前原條細(xì)胞和/或組織的富集的、分離的和/或純化的群可體外自hESC培養(yǎng)物或細(xì)胞群制備，該hESC培養(yǎng)物或細(xì)胞群經(jīng)歷約I小時(shí)至約24小時(shí)的分化。 一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分化。但在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞被定向主要分化為前原條細(xì)胞。一些優(yōu)選的富集、分離和/或純化方法涉及在體外產(chǎn)生始于人胚胎干細(xì)胞的前原條細(xì)胞。使用本文所述方法，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物中前原條細(xì)胞的含量可被富集至少約2倍至約1000倍。在一些實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，前原條細(xì)胞可被富集至少約5倍至約500倍。在其它實(shí)施方案中， 與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，前原條細(xì)胞可被富集至少約10倍至約200倍。在其它實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，前原條細(xì)胞可被富集至少約20倍至約100倍。在其它實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，前原條細(xì)胞可被富集至少約40倍至約80倍。在某些實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，前原條細(xì)胞可被富集至少約2倍至約20倍。包含前原條細(xì)胞的組合物上述方法產(chǎn)生的細(xì)胞組合物包括包含前原條細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和富集前原條細(xì)胞的細(xì)胞群。例如，能夠產(chǎn)生包含前原條細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物中至少約5-90% 的細(xì)胞是前原條細(xì)胞。因?yàn)榭赏ㄟ^(guò)調(diào)整某些參數(shù)(這些參數(shù)包括但不限于，細(xì)胞生長(zhǎng)條件、 生長(zhǎng)因子濃度和培養(yǎng)步驟的時(shí)間安排)來(lái)調(diào)整分化方法的效率，本文所述的分化方法可導(dǎo)致約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或超過(guò)約95%的
多能性細(xì)胞向前原條細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在使用分離前原條細(xì)胞的方法中，可回收基本上純的前原條細(xì)胞群。本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含諸如干細(xì)胞的多能性細(xì)胞和前原條細(xì)胞的組合物，例如細(xì)胞群和細(xì)胞培養(yǎng)物。例如，用本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生包含hESC和前原條細(xì)胞的混合物的組合物。一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生包含約每95個(gè)多能性細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約5個(gè)前原條細(xì)胞的組合物。其它實(shí)施方案中，產(chǎn)生包含約每5個(gè)多能性細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約95個(gè)前原條細(xì)胞的組合物。此外，預(yù)期可以得到包含前原條細(xì)胞和多能性細(xì)胞其他比例的組合物。例如， 預(yù)期可以得到包含至少約I個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每1，000, 000個(gè)多能性細(xì)胞、至少約I個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每100，000個(gè)多能性細(xì)胞、至少約I個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每10，000個(gè)多能性細(xì)胞、至少約I個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每1000個(gè)多能性細(xì)胞、至少約I個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每500個(gè)多能性細(xì)胞、至少約I個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每100個(gè)多能性細(xì)胞、至少約I個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每10個(gè)多能性細(xì)胞、至少約I個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每5個(gè)多能性細(xì)胞、 至少約I個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每2個(gè)多能性細(xì)胞、至少約2個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能性細(xì)胞、至少約5個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能性細(xì)胞、至少約10個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能性細(xì)胞、至少約20個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能性細(xì)胞、至少約50個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能性細(xì)胞、至少約100個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能性細(xì)胞、至少約 1000個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能性細(xì)胞、至少約10，000個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能性細(xì)胞、至少約100，000個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每一個(gè)多能性細(xì)胞、以及至少約1，000, 000 個(gè)前原條細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能性細(xì)胞的組合物。一些實(shí)施方案中，該多能性細(xì)胞是人多能干細(xì)胞。某些實(shí)施方案中，該干細(xì)胞衍生自桑椹胚、胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或胚胎生殖嵴。某些其他實(shí)施方案中，該多能性細(xì)胞衍生自發(fā)育已經(jīng)越過(guò)胚胎期的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的性腺組織或生殖組織。本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含從至少約5%前原條細(xì)胞到至少約99%前原條細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群。一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 優(yōu)選實(shí)施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群包含人細(xì)胞。例如，某些特定實(shí)施方案涉及含有人細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中從至少約5%到至少約99%的人類細(xì)胞是前原條細(xì)胞。其它實(shí)施方案涉及含有人細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約 20 %、至少約25 %、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約98 %、至少約99 %或多于99 %的人細(xì)胞是前原條細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群包含人飼養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)算上述百分比時(shí)不考慮細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中的人飼養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及包含諸如人前原條細(xì)胞的人細(xì)胞的組合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群，其中至少約5%的人細(xì)胞中FGF8標(biāo)志物和/或核定位的β -連接素標(biāo)志物的表達(dá)高于brachyury、FGF4、SNAIl、S0X17、F0XA2、S0X7和/或SOXl標(biāo)志物的表達(dá)。其他實(shí)施方案中，至少約10%的人細(xì)胞中、至少約15%的人細(xì)胞中、至少約20%的人細(xì)胞中、 至少約25%的人細(xì)胞中、至少約30%的人細(xì)胞中、至少約35%的人細(xì)胞中、至少約40%的人細(xì)胞中、至少約45%的人細(xì)胞中、至少約50%的人細(xì)胞中、至少約55%的人細(xì)胞中、至少約60 %的人細(xì)胞中、至少約65%的人細(xì)胞中、至少約70%的人細(xì)胞中、至少約75 %的人細(xì)胞中、至少約80%的人細(xì)胞中、至少約85%的人細(xì)胞中、至少約90%的人細(xì)胞中、至少95% 的人細(xì)胞中、至少98 %的人細(xì)胞中、至少99 %的人細(xì)胞中或多于99 %的人細(xì)胞中，F(xiàn)GF8或核定位的β -連接素標(biāo)志物的表達(dá)高于brachyury、FGF4、SNAII、S0X17、F0XA2、S0X7和/ 或SOXl標(biāo)志物的表達(dá)。一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群包含人飼養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)算上述百分比時(shí)不考慮細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中的人飼養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及包含人hESC和人前原條細(xì)胞的組合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群，其中在細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群的細(xì)胞中，F(xiàn)GF8mRNA表達(dá)的顯著上調(diào)發(fā)生在使培養(yǎng)物中的hESC與諸如活化素A的適當(dāng)分化因子接觸后約I小時(shí)、約2小時(shí)、約3小時(shí)、約 4小時(shí)、約5小時(shí)、約6小時(shí)、約7小時(shí)、約8小時(shí)、約9小時(shí)、約10小時(shí)、約11小時(shí)、約12小時(shí)、約13小時(shí)、約14小時(shí)、約15小時(shí)、約16小時(shí)、約17小時(shí)、約18小時(shí)、約19小時(shí)、約20 小時(shí)、約21小時(shí)、約22小時(shí)、約23小時(shí)、約24小時(shí)或晚于約24小時(shí)。這些實(shí)施方案中， FGF8 mRNA表達(dá)的顯著上調(diào)發(fā)生在至少約5%的人細(xì)胞中、至少約10%的人細(xì)胞中、至少約 15%的人細(xì)胞中、至少約20%的人細(xì)胞中、至少約25%的人細(xì)胞中、至少約30%的人細(xì)胞中、至少約35%的人細(xì)胞中、至少約40%的人細(xì)胞中、至少約45%的人細(xì)胞中、至少約50% 的人細(xì)胞中、至少約55%的人細(xì)胞中、至少約60%的人細(xì)胞中、至少約65%的人細(xì)胞中、至少約70%的人細(xì)胞中、至少約75%的人細(xì)胞中、至少約80%的人細(xì)胞中、至少約85%的人細(xì)胞中、至少約90%的人細(xì)胞中、至少95%的人細(xì)胞中、至少98%的人細(xì)胞中、至少99%的人細(xì)胞中或多于99%的人細(xì)胞中。一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群包含人飼養(yǎng)細(xì)胞， 計(jì)算上述百分比時(shí)不考慮細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中的人飼養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及包含人hESC和人前原條細(xì)胞的組合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群，其中在細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群的細(xì)胞中，連接素多肽的顯著細(xì)胞核定位 (核定位的β_連接素標(biāo)志物的表達(dá))發(fā)生在使培養(yǎng)物中的hESC與諸如活化素A的適當(dāng)分化因子接觸后約I小時(shí)、約2小時(shí)、約3小時(shí)、約4小時(shí)、約5小時(shí)、約6小時(shí)、約7小時(shí)、約8 小時(shí)、約9小時(shí)、約10小時(shí)、約11小時(shí)、約12小時(shí)、約13小時(shí)、約14小時(shí)、約15小時(shí)、約16 小時(shí)、約17小時(shí)、約18小時(shí)、約19小時(shí)、約20小時(shí)、約21小時(shí)、約22小時(shí)、約23小時(shí)、約 24小時(shí)或晚于約24小時(shí)。這些實(shí)施方案中，核定位的連接素的表達(dá)發(fā)生在至少約5% 的人細(xì)胞中、至少約10%的人細(xì)胞中、至少約15%的人細(xì)胞中、至少約20%的人細(xì)胞中、至少約25%的人細(xì)胞中、至少約30%的人細(xì)胞中、至少約35%的人細(xì)胞中、至少約40%的人細(xì)胞中、至少約45%的人細(xì)胞中、至少約50%的人細(xì)胞中、至少約55%的人細(xì)胞中、至少約 60%的人細(xì)胞中、至少約65%的人細(xì)胞中、至少約70%的人細(xì)胞中、至少約75%的人細(xì)胞中、至少約80%的人細(xì)胞中、至少約85%的人細(xì)胞中、至少約90%的人細(xì)胞中、至少95%的人細(xì)胞中、至少98%的人細(xì)胞中、至少99%的人細(xì)胞中或多于99%的人細(xì)胞中。一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群包含人飼養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)算上述百分比時(shí)不考慮細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中的人飼養(yǎng)細(xì)胞。使用本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生包含基本上不含其它細(xì)胞類型的前原條細(xì)胞的組合物。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明方法制備的前原條細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物基本上不含顯著表達(dá)brachyury、FGF4、SNAII、S0X17、F0XA2、S0X7和/或SOXl標(biāo)志物基因的細(xì)胞。
—個(gè)實(shí)施方案中，基于標(biāo)志物基因表達(dá)的前原條細(xì)胞的描述是FGF8高、核定位的 β -連接素高、brachyury 低、FGF4 低、SNAIl 低、SOX17 低、F0XA2 低、S0X7 低和 SOXl 低。從多能細(xì)胞產(chǎn)生中內(nèi)胚層細(xì)胞一些產(chǎn)生中內(nèi)胚層細(xì)胞的方法中，作為起始材料的多能性細(xì)胞是干細(xì)胞。某些方法中，從胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生包含中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和富集的細(xì)胞群。優(yōu)選的衍生中內(nèi)胚層細(xì)胞的方法利用人胚胎干細(xì)胞作為產(chǎn)生中內(nèi)胚層細(xì)胞的起始材料。這些多能性細(xì)胞可以是起源于桑椹胚、胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或從胚胎生殖嵴獲得的細(xì)胞。使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法，人胚胎干細(xì)胞可在培養(yǎng)基中保持多能性狀態(tài)而基本不分化。所述的方法在諸如美國(guó)專利第 5，453，357,5, 670，372,5, 690，926,5, 843，780,6, 200，806 及 6，251，671 號(hào)中有所描述，其公開(kāi)在此整體引入，以供參考。在產(chǎn)生中內(nèi)胚層細(xì)胞的一些方法中，將hESC維持在滋養(yǎng)層上。在這些方法中，可以使用任何能夠使hESC保持在多能性狀態(tài)的滋養(yǎng)層。一種常用的培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的滋養(yǎng)層為一層小鼠成纖維細(xì)胞。最近，人成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層也已開(kāi)發(fā)出來(lái)用于培養(yǎng)hESC(參見(jiàn)第2002/0072117號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)，其公開(kāi)在此整體引入，以供參考)。制備中內(nèi)胚層細(xì)胞的其它方法允許不使用滋養(yǎng)層保持多能hESC。在沒(méi)有滋養(yǎng)層的條件下保持多能性hESC的方法已在第2003/0175956號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)中有描述，其公開(kāi)在此整體引入，以供參考。本發(fā)明使用的人胚胎干細(xì)胞可以保持在含有或不含有血清的培養(yǎng)基中。在一些胚胎干細(xì)胞保持方法中，使用血清替代品。其它方法中，使用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)，例如美國(guó)專利申請(qǐng)第2003/0190748號(hào)所述的方法，其公開(kāi)在此整體引入，以供參考。在培養(yǎng)物中保持多能性狀態(tài)的干細(xì)胞按照常規(guī)傳代，直到分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞。 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)向干細(xì)胞培養(yǎng)物中加入諸如TGFβ超家族生長(zhǎng)因子的分化因子完成向中內(nèi)胚層細(xì)胞的分化，其加入的量足以促進(jìn)向中內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。用于制備中內(nèi)胚層細(xì)胞的TGFii超家族生長(zhǎng)因子選自Nodal/活化素亞組。在一些優(yōu)選的分化方法中，生長(zhǎng)因子選自Nodal、活化素A和活化素B。某些分化方法中，使用生長(zhǎng)因子活化素A。關(guān)于從多能性干細(xì)胞向中內(nèi)胚層細(xì)胞分化的一些方法，向細(xì)胞提供上述生長(zhǎng)因子，使其在培養(yǎng)基中的濃度足以促進(jìn)至少一部分干細(xì)胞分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞。在一些方法中，上述生長(zhǎng)因子在細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的濃度為至少約5ng/ml、至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約 300ng/ml、至少約 400ng/ml、至少約 500ng/ml、至少約 1000ng/ml、至少約 2000ng/ml、至少約 3000ng/ml、至少約 4000ng/ml、至少約 5000ng/ml 或大于 5000ng/ml。在使多能性干細(xì)胞向中內(nèi)胚層細(xì)胞分化的某些方法中，上述生長(zhǎng)因子加入細(xì)胞培養(yǎng)物后從細(xì)胞培養(yǎng)物中除去。例如，可以在約18小時(shí)、約19小時(shí)、約20小時(shí)、約21小時(shí)、 約22小時(shí)、約23小時(shí)、約24小時(shí)、約25小時(shí)、約26小時(shí)、約27小時(shí)、約28小時(shí)、約29小時(shí)、約30小時(shí)、約31小時(shí)、約32小時(shí)、約33小時(shí)、約34小時(shí)、約35小時(shí)、約36小時(shí)、約37 小時(shí)、約38小時(shí)、約39小時(shí)、約40小時(shí)、約41小時(shí)、約42小時(shí)、約43小時(shí)、約44小時(shí)、約 45小時(shí)、約46小時(shí)、約47小時(shí)、約48小時(shí)或約多于48小時(shí)之內(nèi)除去生長(zhǎng)因子。可在含有減量血清或不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)中內(nèi)胚層細(xì)胞的培養(yǎng)物。在某些培養(yǎng)條件下,血清的濃度范圍為約0% (v/v)至約10% (ν/ν) ο例如，在一些分化方法中，培養(yǎng)基中血清的濃度可以低于約0.05% (v/v)、低于約0. I % (v/v)、低于約0. 2% (v/v)、低于約 O. 3% (v/v)、低于約 O. 4% (v/v)、低于約 O. 5% (v/v)、低于約 O. 6% (v/v)、低于約 O. 7% (v/v)、低于約O. 8% (v/v)、低于約O. 9% (v/v)、低于約1% (v/v)、低于約2% (v/v)、低于約3% (v/v)、低于約4% (v/v)、低于約5% (v/v)、低于約6% (v/v)、低于約7% (v/v)、低于約8% (v/v)、低于約9% (v/v)或低于約10% (ν/ν) ο 一些方法中，中內(nèi)胚層細(xì)胞在無(wú)血清或無(wú)血清替代物下生長(zhǎng)。在其它方法中，中內(nèi)胚層細(xì)胞在B27存在下生長(zhǎng)。在這些方法中，B27添加物的濃度范圍為約O. 1% (v/v)至約20% (v/v)。監(jiān)測(cè)多能性細(xì)胞向中內(nèi)胚層細(xì)胞的分化可以通過(guò)確定中內(nèi)胚層細(xì)胞特征性標(biāo)志物的時(shí)間性表達(dá)來(lái)監(jiān)測(cè)hESC培養(yǎng)物向中內(nèi)胚層細(xì)胞的進(jìn)行。一些方法中，某些標(biāo)志物的表達(dá)可通過(guò)檢測(cè)是否存在該標(biāo)志物來(lái)確定。 或者，某些標(biāo)志物的表達(dá)可通過(guò)測(cè)量該標(biāo)志物在加入分化因子后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)在細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群細(xì)胞中存在的水平來(lái)確定。在這些方法中，可以定性或定量測(cè)定標(biāo)志物的表達(dá)。定量標(biāo)志物基因產(chǎn)生的標(biāo)志物表達(dá)的一種方法是通過(guò)使用Q-PCR。也可以使用本領(lǐng)域已知的其它方法定量標(biāo)志物基因的表達(dá)。例如，可以通過(guò)使用對(duì)所關(guān)注的標(biāo)志物基因產(chǎn)物特異的抗體來(lái)檢測(cè)標(biāo)志物基因產(chǎn)物的表達(dá)。某些方法中，確定中內(nèi)胚層細(xì)胞的特征性標(biāo)志物基因的表達(dá)以及hESC和其它細(xì)胞類型的特征性標(biāo)志物基因的顯著表達(dá)的缺乏。其它方法中，測(cè)定加入分化因子后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，中內(nèi)胚層細(xì)胞的特征性標(biāo)志物基因表達(dá)的時(shí)間性和數(shù)量。如以下實(shí)施例進(jìn)一步所述，中內(nèi)胚層細(xì)胞的標(biāo)志物為brachyury、FGF4和SNAI1。 同樣地，用本發(fā)明所述方法制備的中內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)brachyury、FGF4和SNAIl標(biāo)志物基因，因此產(chǎn)生brachyury、FGF4和SNAIl標(biāo)志物基因產(chǎn)物。一些實(shí)施方案中,brachyury、FGF4 和SNAIlmRNA在中內(nèi)胚層細(xì)胞中但不在hESC中顯著表達(dá)。在使hESC與諸如活化素A的適當(dāng)分化因子接觸后24小時(shí)，可在分化中的hESC培養(yǎng)物中觀察到brachyury、FGF4和SNAIl mRNA的顯著上調(diào)，直至接近峰值。這時(shí)，指示諸如原始內(nèi)胚層、定形內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的其它細(xì)胞類型(參見(jiàn)表I)的某些標(biāo)志物的表達(dá)依然相對(duì)較低。一些實(shí)施方案中，指示原始內(nèi)胚層、定形內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的某些標(biāo)志物在使hESC與分化因子接觸后24小時(shí)不顯著表達(dá)。一些實(shí)施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAIl mRNA的表達(dá)在使hESC與分化因子接觸后24小時(shí)之后開(kāi)始下降。一些實(shí)施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAIl mRNA的表達(dá)在使hESC與分化因子接觸后約30小時(shí)、約36小時(shí)、約42小時(shí)、約48小時(shí)或晚于約48小時(shí)之后開(kāi)始下降。應(yīng)當(dāng)理解,可根據(jù)分化條件誘導(dǎo)不同水平的brachyury、FGF4和/或SNAIl在中內(nèi)胚層細(xì)胞中的表達(dá)。由此，本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在從hESC開(kāi)始分化約24小時(shí)之后， brachyury、FGF4和/或SNAIl標(biāo)志物在中內(nèi)胚層細(xì)胞或細(xì)胞群中的表達(dá)比這些標(biāo)志物在非中內(nèi)胚層細(xì)胞或細(xì)胞群中的表達(dá)高至少約2倍至至少約10，000倍。其它實(shí)施方案中，在從hESC開(kāi)始分化約24小時(shí)之后，brachyury、FGF4和/或SNAIl標(biāo)志物在中內(nèi)胚層細(xì)胞或細(xì)胞群中的表達(dá)比這些標(biāo)志物在非中內(nèi)胚層細(xì)胞或細(xì)胞群中的表達(dá)高至少約4倍、高至少約6倍、高至少約8倍、高至少約10倍、高至少約15倍、高至少約20倍、高至少約40倍、高至少約80倍、高至少約100倍、高至少約150倍、高至少約200倍、高至少約500倍、高至少約750倍、高至少約1000倍、高至少約2500倍、高至少約5000倍、高至少約7500倍或高至少約10，000倍。一些實(shí)施方案中，在從hESC開(kāi)始分化約24小時(shí)之后，brachyury、FGF4和/或SNAIl標(biāo)志物在中內(nèi)胚層細(xì)胞或細(xì)胞群中的表達(dá)無(wú)限地高于brachyury、FGF4和/或 SNAIl標(biāo)志物在非中內(nèi)胚層細(xì)胞或細(xì)胞群中的表達(dá)。另外，應(yīng)當(dāng)理解,在中內(nèi)胚層細(xì)胞內(nèi)，brachyury、FGF4和/或SNAIl標(biāo)志物的表達(dá)水平與0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和/或SOXl標(biāo)志物的表達(dá)水平存在差異范圍。 類似地，在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAIl標(biāo)志物的表達(dá)比0CT4、 S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和/或SOXl標(biāo)志物的表達(dá)高至少約2倍至至少約10，000倍。其它實(shí)施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAIl標(biāo)志物的表達(dá)比0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、 S0X7和/或SOXl標(biāo)志物的表達(dá)高至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約40倍、至少約80倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約 200倍、至少約500倍、至少約750倍、至少約1000倍、至少約2500倍、至少約5000倍、至少約7500倍或至少約10，000倍。在一些實(shí)施方案中，0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和/ 或SOXl標(biāo)志物在中內(nèi)胚層細(xì)胞中不顯著表達(dá)。中內(nèi)胚層細(xì)胞的富集、分離和/或純化關(guān)于本發(fā)明方法的其它方面，可以富集、分離和/或純化中內(nèi)胚層細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離中內(nèi)胚層細(xì)胞產(chǎn)生富集中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群。本發(fā)明方法的一些實(shí)施方案中，突光標(biāo)記中內(nèi)胚層細(xì)胞，然后使用FACS從未標(biāo)記的細(xì)胞中將其分離。這些實(shí)施方案中，使用編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核酸或編碼可表達(dá)的突光標(biāo)志物基因的另一核酸標(biāo)記中內(nèi)胚層細(xì)胞。例如，在一些實(shí)施方案中，向優(yōu)選為人胚胎干細(xì)胞的多能性細(xì)胞中引入編碼GFP或其生物活性片段的至少一個(gè)拷貝的核酸，該編碼GFP或其生物活性片段的至少一個(gè)拷貝的核酸位于brachyury、FGF4和SNAIl啟動(dòng)子的下游，使得其處于brachyury、FGF4和SNAIl啟動(dòng)子的控制之下。在一些實(shí)施方案中，編碼 brachyury、FGF4或SNAIl的核酸的全部編碼區(qū)被編碼GFP或其生物活性片段的核酸替代。 在其它實(shí)施方案中，編碼GFP或其生物活性片段的核酸與至少部分編碼brachyury、FGF4或 SNAIl的核酸同框融合，從而產(chǎn)生融合蛋白。這些實(shí)施方案中，該融合蛋白保留了與GFP相似的熒光活性。例如上述多能性細(xì)胞的熒光標(biāo)記的細(xì)胞如前所述地分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞。因?yàn)橹袃?nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)熒光標(biāo)志物基因而非中內(nèi)胚層細(xì)胞不表達(dá)，這兩類細(xì)胞可被分開(kāi)。在一些實(shí)施方案中，使用FACS分選包含突光標(biāo)記的中內(nèi)胚層細(xì)胞和未標(biāo)記的非中內(nèi)胚層細(xì)胞混合物的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。中內(nèi)胚層細(xì)胞被從非中內(nèi)胚層細(xì)胞中分離收集，從而導(dǎo)致這些細(xì)胞類型的分離。如果需要的話，分離的細(xì)胞組合物可通過(guò)更多輪的分選被進(jìn)一步純化，該分選使用特異針對(duì)中內(nèi)胚層細(xì)胞的相同或不同標(biāo)志物。除上述的方法之外，還可以通過(guò)細(xì)胞分離的其它技術(shù)分離中內(nèi)胚層細(xì)胞。另外，還可以通過(guò)特定生長(zhǎng)條件下連續(xù)次培養(yǎng)的方法富集或分離中內(nèi)胚層細(xì)胞，該特定生長(zhǎng)條件促進(jìn)中內(nèi)胚層細(xì)胞的選擇性存活或選擇性生長(zhǎng)。
應(yīng)該理解，上述的富集、分離和純化方法可用于任何分化階段的培養(yǎng)物。使用本文所述方法，富集的、分離的和/或純化的中內(nèi)胚層細(xì)胞群和/或組織可體外自hESC培養(yǎng)物或細(xì)胞群制備，該hESC培養(yǎng)物或細(xì)胞群經(jīng)歷約18小時(shí)至約48小時(shí)的分化。一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分化。但在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞被定向?yàn)橹饕只癁橹袃?nèi)胚層細(xì)胞。一些優(yōu)選的富集、分離和/或純化方法涉及在體外產(chǎn)生始于人胚胎干細(xì)胞的中內(nèi)胚層細(xì)胞。使用本文所述方法，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物中中內(nèi)胚層細(xì)胞的含量可被富集至少約2倍至約1000倍。在一些實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，中內(nèi)胚層細(xì)胞可被富集至少約5倍至約500倍。在其它實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，中內(nèi)胚層細(xì)胞可被富集至少約10倍至約200 倍。在其它實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，中內(nèi)胚層細(xì)胞可被富集至少約20倍至約100倍。在其它實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，中內(nèi)胚層細(xì)胞可被富集至少約40倍至約80倍。在某些實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，中內(nèi)胚層細(xì)胞可被富集至少約2倍至約20倍。包含中內(nèi)胚層細(xì)胞的組合物上述方法產(chǎn)生的細(xì)胞組合物包括包含中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和富集中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群。例如，能夠產(chǎn)生包含中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物中至少約 5-90%的細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。因?yàn)榭赏ㄟ^(guò)調(diào)整某些參數(shù)(這些參數(shù)包括但不限于，細(xì)胞生長(zhǎng)條件、生長(zhǎng)因子濃度和培養(yǎng)步驟的時(shí)間安排)來(lái)調(diào)整分化方法的效率，本文所述的分化方法可導(dǎo)致約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、 約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%或超過(guò)約95 %的多能性細(xì)胞向中內(nèi)胚層細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在使用分離中內(nèi)胚層細(xì)胞的方法中，可回收基本上純的中內(nèi)胚層細(xì)胞群。本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含諸如干細(xì)胞的多能性細(xì)胞和中內(nèi)胚層細(xì)胞的組合物，例如細(xì)胞群和細(xì)胞培養(yǎng)物。例如，用本發(fā)明的方法可以制備包含hESC和中內(nèi)胚層細(xì)胞的混合物的組合物。一些實(shí)施方案中,產(chǎn)生包含至少約5個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每95個(gè)多能性細(xì)胞的組合物。其它實(shí)施方案中，產(chǎn)生包含至少約95個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每5個(gè)多能性細(xì)胞的組合物。此外，預(yù)期可以得到包含中內(nèi)胚層細(xì)胞和多能細(xì)胞其他比例的組合物。例如，預(yù)期可以得到包含至少約I個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每1，000, 000個(gè)多能性細(xì)胞、 至少約I個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每100,000個(gè)多能性細(xì)胞、至少約I個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每10，000個(gè)多能性細(xì)胞、至少約I個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每1000個(gè)多能性細(xì)胞、至少約
I個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每500個(gè)多能細(xì)胞、至少約I個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每100個(gè)多能細(xì)胞、至少約I個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每10個(gè)多能細(xì)胞、至少約I個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每5個(gè)多能細(xì)胞、至少約I個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每2個(gè)多能細(xì)胞、至少約2個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能細(xì)胞、至少約5個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能細(xì)胞、至少約10個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能細(xì)胞、至少約20個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能細(xì)胞、 至少約50個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能細(xì)胞、至少約100個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I 個(gè)多能細(xì)胞、至少約1000個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能細(xì)胞、至少約10，000個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能細(xì)胞、至少約100，000個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能細(xì)胞、以及至少約1，000，000個(gè)中內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)約每I個(gè)多能細(xì)胞的組合物。一些實(shí)施方案中， 該多能性細(xì)胞是人多能性干細(xì)胞。某些實(shí)施方案中，該干細(xì)胞衍生自桑椹胚、胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或胚胎生殖嵴。某些其他實(shí)施方案中，該多能性細(xì)胞衍生自發(fā)育已經(jīng)越過(guò)胚胎期的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的性腺組織或生殖組織。本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含從至少約5%的中內(nèi)胚層細(xì)胞到至少約99%的中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群。一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選實(shí)施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群包含人細(xì)胞。例如，某些特定實(shí)施方案涉及含有人細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中從至少約5%到至少約99%的人細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。其它實(shí)施方案涉及含有人細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約5%、至少約10%、至少約 15%,至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或多于99%的人類細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群包含人飼養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)算上述百分比時(shí)不考慮細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中的人飼養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及包含諸如人中內(nèi)胚層細(xì)胞的人細(xì)胞的組合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群，其中至少約5%的人細(xì)胞中brachyury、FGF4和/或SNAIl標(biāo)志物的表達(dá)高于0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和/或SOXl標(biāo)志物的表達(dá)。其他實(shí)施方案中，至少約10%的人細(xì)胞中、至少約15%的人細(xì)胞中、至少約20%的人細(xì)胞中、至少約25%的人細(xì)胞中、至少約30%的人細(xì)胞中、至少約35%的人細(xì)胞中、至少約40%的人細(xì)胞中、至少約 45%的人細(xì)胞中、至少約50%的人細(xì)胞中、至少約55%的人細(xì)胞中、至少約60%的人細(xì)胞中、至少約65%的人細(xì)胞中、至少約70%的人細(xì)胞中、至少約75%的人細(xì)胞中、至少約80% 的人細(xì)胞中、至少約85%的人細(xì)胞中、至少約90%的人細(xì)胞中、至少95%的人細(xì)胞中、至少 98%的人細(xì)胞中、至少99%的人細(xì)胞中或多于99%的人細(xì)胞中，brachyury、FGF4和/或 SNAIl標(biāo)志物的表達(dá)高于0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和/或SOXl標(biāo)志物的表達(dá)。一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群包含人飼養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)算上述百分比時(shí)不考慮細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中的人飼養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及包含人hESC和人中內(nèi)胚層細(xì)胞的組合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群，其中在細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群的細(xì)胞中，brachyury, FGF4和/或SNAIl mRNA表達(dá)的顯著上調(diào)發(fā)生在使培養(yǎng)物中的hESC與諸如活化素A的適當(dāng)分化因子接觸后約 18小時(shí)、約19小時(shí)、約20小時(shí)、約21小時(shí)、約22小時(shí)、約23小時(shí)、約24小時(shí)、約25小時(shí)、 約26小時(shí)、約27小時(shí)、約28小時(shí)、約29小時(shí)、約30小時(shí)、約31小時(shí)、約32小時(shí)、約33小時(shí)、約34小時(shí)、約35小時(shí)、約36小時(shí)、約37小時(shí)、約38小時(shí)、約39小時(shí)、約40小時(shí)、約41 小時(shí)、約42小時(shí)、約43小時(shí)、約44小時(shí)、約45小時(shí)、約46小時(shí)、約47小時(shí)、約48小時(shí)或晚于約48小時(shí)。這些實(shí)施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAIl mRNA表達(dá)的顯著上調(diào)發(fā)生在至少約5%的人細(xì)胞中、至少約10%的人細(xì)胞中、至少約15%的人細(xì)胞中、至少約20% 的人細(xì)胞中、至少約25%的人細(xì)胞中、至少約30%的人細(xì)胞中、至少約35%的人細(xì)胞中、至少約40%的人細(xì)胞中、至少約45%的人細(xì)胞中、至少約50%的人細(xì)胞中、至少約55%的人細(xì)胞中、至少約60%的人細(xì)胞中、至少約65%的人細(xì)胞中、至少約70%的人細(xì)胞中、至少約 75 %的人細(xì)胞中、至少約80 %的人細(xì)胞中、至少約85%的人細(xì)胞中、至少約90 %的人細(xì)胞中、至少95%的人細(xì)胞中、至少98%的人細(xì)胞中、至少99%的人細(xì)胞中或多于99%的人細(xì)胞中。一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群包含人飼養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)算上述百分比時(shí)不考慮細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中的人飼養(yǎng)細(xì)胞。使用本發(fā)明的方法，可以制備包含基本上不含其它細(xì)胞類型的中內(nèi)胚層細(xì)胞的組合物。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明方法制備的中內(nèi)胚層細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物基本上不含顯著表達(dá)0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和/或SOXl標(biāo)志物基因的細(xì)胞?！獋€(gè)實(shí)施方案中，基于標(biāo)志物基因表達(dá)的中內(nèi)胚層細(xì)胞的描述是brachyury高、 FGF4 高、SNAIl 高、S0X17 低、CXCR4 低、F0XA2 低、S0X7 低和 SOXl 低。定形內(nèi)胚層細(xì)胞的產(chǎn)生下文簡(jiǎn)述分化多能性細(xì)胞產(chǎn)生包含定形內(nèi)胚層的細(xì)胞培養(yǎng)物和富集的細(xì)胞群的方法，在于2004年12月23日提交的題為DEFINITIVE END0DERM(定形內(nèi)胚層)的第 11/021，618號(hào)美國(guó)專利中詳細(xì)描述了該方法，其公開(kāi)內(nèi)容在此整體并入以供參考。一些制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞的方法中，作為起始材料的多能性細(xì)胞是干細(xì)胞。某些方法中，從胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生包含定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和富集的細(xì)胞群。優(yōu)選的衍生定形內(nèi)胚層細(xì)胞的方法利用人胚胎干細(xì)胞作為產(chǎn)生定形內(nèi)胚層的起始材料。這些多能性細(xì)胞可以是起源于桑椹胚、胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或從胚胎生殖嵴獲得的細(xì)胞。使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法，人胚胎干細(xì)胞可在培養(yǎng)基中保持多能性狀態(tài)而基本不分化。所述的方法在諸如美國(guó)專利第 5，453，357,5, 670，372,5, 690，926,5, 843，780,6, 200，806 及 6，251，671 號(hào)中有所描述，其公開(kāi)在此整體引入，以供參考。在產(chǎn)生定形內(nèi)胚層細(xì)胞的一些方法中，將hESC保持在滋養(yǎng)層上。在這些方法中，可以使用任何能夠使hESC保持在多能性狀態(tài)的滋養(yǎng)層。一種常用的培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的滋養(yǎng)層為一層小鼠成纖維細(xì)胞。最近，人成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層也已開(kāi)發(fā)出來(lái)用于培養(yǎng) hESC(參見(jiàn)第2002/0072117號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)，其公開(kāi)在此整體引入，以供參考)。制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞的其它方法允許不使用滋養(yǎng)層保持多能性hESC。在沒(méi)有滋養(yǎng)層的條件下保持多能性hESC的方法已在第2003/0175956號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)中有描述，其公開(kāi)在此整體引入，以供參考。本發(fā)明使用的人胚胎干細(xì)胞可以保持在含有或不含有血清的培養(yǎng)基中。在一些胚胎干細(xì)胞保持方法中，使用血清替代品。其它方法中，使用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)，例如美國(guó)專利申請(qǐng)第2003/0190748號(hào)所述的方法，其公開(kāi)在此整體引入，以供參考。在培養(yǎng)物中保持多能性狀態(tài)的干細(xì)胞按照常規(guī)傳代，直到分化為定形內(nèi)胚層。在一些方法中，通過(guò)向干細(xì)胞培養(yǎng)物中加入諸如TGFii超家族生長(zhǎng)因子的分化因子完成向定形內(nèi)胚層的分化，其加入的量足以促進(jìn)向定形內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。可用于制備定形內(nèi)胚層的TGFii超家族生長(zhǎng)因子選自Nodal/活化素亞組。在一些優(yōu)選的分化方法中，生長(zhǎng)因子選自Nodal、活化素A和活化素B。某些分化方法中，可以使用任何上述生長(zhǎng)因子的組合。關(guān)于從多能性干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化的一些方法，向細(xì)胞提供上述生長(zhǎng)因子，使其在培養(yǎng)基中的濃度足以促進(jìn)至少一部分干細(xì)胞分化為定形內(nèi)胚層細(xì)胞。在一些方法中，上述生長(zhǎng)因子在細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的濃度為至少約5ng/ml、至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約 300ng/ml、至少約 400ng/ml、至少約 500ng/ml、至少約 1000ng/ml、至少約 2000ng/ml、至少約 3000ng/ml、至少約 4000ng/ml、至少約 5000ng/ml 或大于約 5000ng/ml。在使多能性干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化的某些方法中，上述生長(zhǎng)因子加入細(xì)胞培養(yǎng)物后從細(xì)胞培養(yǎng)物中除去。例如，可以在加入后約I天、約2天、約3天、約4天、約5 天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天除去生長(zhǎng)因子。在優(yōu)選的方法中，在加入后約 4天除去生長(zhǎng)因子。
可在含有減量血清或不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)定形內(nèi)胚層細(xì)胞的培養(yǎng)物。在某些培養(yǎng)條件下，血清的濃度范圍為約O. 05% (v/v)至約20% (v/v)。例如，在一些分化方法中，培養(yǎng)基中血清的濃度可以低于約O. 05% (v/v)、低于約O. I % (v/v)、低于約O. 2% (v/ V)、低于約 O. 3% (v/v)、低于約 O. 4% (v/v)、低于約 O. 5% (v/v)、低于約 O. 6 % (v/v)、低于約O. 7% (v/v)、低于約O. 8% (v/v)、低于約O. 9% (v/v)、低于約1% (v/v)、低于約2% (v/v)、低于約3% (v/v)、低于約4% (v/v)、低于約5% (v/v)、低于約6% (v/v)、低于約7% (v/v)、低于約8% (v/v)、低于約9% (v/v)、低于約10% (v/v)、低于約15% (v/v)或低于約20% (v/v) 0 一些方法中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞在無(wú)血清或無(wú)血清替代物下生長(zhǎng)。一些實(shí)施方案中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞在有血清替代物下生長(zhǎng)。在其它方法中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞在B27存在下生長(zhǎng)。在這些方法中，B27添加物的濃度范圍為約O. 1% (v/v)至約20% (v/v)。監(jiān)測(cè)多能性細(xì)胞向定形內(nèi)胚層細(xì)胞的分化 可以通過(guò)測(cè)定定形內(nèi)胚層特征性標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)監(jiān)測(cè)hESC培養(yǎng)物向定形內(nèi)胚層的進(jìn)行。一些方法中，某些標(biāo)志物的表達(dá)可通過(guò)檢測(cè)是否存在該標(biāo)志物來(lái)確定?；蛘?，某些標(biāo)志物的表達(dá)可通過(guò)測(cè)量該標(biāo)志物在細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群細(xì)胞中存在的水平來(lái)確定。在這些方法中，可以定性或定量測(cè)定標(biāo)志物的表達(dá)。定量標(biāo)志物基因產(chǎn)生的標(biāo)志物表達(dá)的一種方法是通過(guò)使用Q-PCR。也可以使用本領(lǐng)域已知的其它方法定量標(biāo)志物基因的表達(dá)。例如， 可以通過(guò)使用對(duì)所關(guān)注的標(biāo)志物基因產(chǎn)物特異的抗體來(lái)檢測(cè)標(biāo)志物基因產(chǎn)物的表達(dá)。某些方法中，確定定形內(nèi)胚層的特征性標(biāo)志物基因的表達(dá)以及hESC和其它細(xì)胞類型的特征性標(biāo)志物基因的顯著表達(dá)的缺乏。如以下實(shí)施例進(jìn)一步所述，定形內(nèi)胚層的可靠標(biāo)志物為S0X17基因。這樣，用本發(fā)明所述方法產(chǎn)生的定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)S0X17標(biāo)志物基因，因此產(chǎn)生S0X17基因產(chǎn)物。定形內(nèi)胚層的其它標(biāo)志物為 MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQU CMKORl 和 CRIPl0因?yàn)槎ㄐ蝺?nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)S0X17標(biāo)志物基因的水平高于表達(dá)S0X7標(biāo)志物基因的水平，所以在一些方法中，既監(jiān)測(cè)S0X17又監(jiān)測(cè)S0X7的表達(dá)，S0X7是原始內(nèi)胚層和內(nèi)臟內(nèi)胚層的特征性標(biāo)志物基因。其它方法中，既監(jiān)測(cè)S0X17標(biāo)志物基因又監(jiān)測(cè)0CT4標(biāo)志物基因的表達(dá)，0CT4是hESC的特征性標(biāo)志物基因。另外，因?yàn)槎ㄐ蝺?nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)S0X17標(biāo)志物基因的水平高于表達(dá)AFP、SPARC或血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)標(biāo)志物基因的水平，所以還可以監(jiān)測(cè)這些基因的表達(dá)。定形內(nèi)胚層的另一標(biāo)志物是CXCR4基因。CXCR4基因編碼配體為趨化吸引劑 SDF-I的細(xì)胞表面趨化因子受體。成體中具有CXCR4受體的細(xì)胞的主要作用被認(rèn)為有造血細(xì)胞向骨髓的遷移、淋巴細(xì)胞傳輸以及各種B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞血細(xì)胞譜系的分化[Kim， C.，and Broxmeyer, H. J. Leukocyte Biol. 65，6-15 (1999) ]。CXCR4 受體還作為 HIV-1 進(jìn)入 T 細(xì)胞的共同受體[Feng, Y.，et al. Science, 272，872-877 (1996)]。在[McGrath, K.E.et al. Dev. Biology 213,442-456(1999)]進(jìn)行的一系列廣泛研究中，描述了小鼠中趨化因子受體 CXCR4 及其獨(dú)特的配體 SDF-1 [Kim, C. , and Broxmeyer, H. J. Leukocyte Biol. 65,6-15(1999)]在早期發(fā)育和成體生活期間的表達(dá)。當(dāng)證實(shí)轉(zhuǎn)基因小鼠中，CXCR4 和 SDF-1 的任意一個(gè)被破壞[Nagasawa et al. Nature, 382,635-638 (1996) ；Ma, Q.，et al Immunity, 10,463-471 (1999)]都導(dǎo)致晚期胚胎死亡時(shí)，發(fā)育中CXCR4/SDF-1的相互作用變得明顯。McGrath等人使用RNase保護(hù)和原位雜交方法證實(shí)CXCR4是在早期原腸胚(E7. 5)期間檢測(cè)到的最大量的趨化因子受體信使RNA。在原腸胚中，CXCR4/SDF-1信號(hào)看來(lái)主要涉及誘導(dǎo)原條胚層細(xì)胞的遷移，并且其在此時(shí)存在的定形內(nèi)胚層、中胚層和胚外中胚層表達(dá)。在E7. 2-7. 8小鼠胚胎中，CXCR4和甲胎蛋白互相排斥，表明其在內(nèi)臟內(nèi)胚層缺乏表達(dá) [McGrath, K. E. et al. Dev. Biology 213,442-456(1999)]。因?yàn)橥ㄟ^(guò)分化多能性細(xì)胞制備的定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)CXCR4標(biāo)志物基因，所以為了追蹤定形內(nèi)胚層細(xì)胞的產(chǎn)生可以監(jiān)測(cè)CXCR4的表達(dá)。另外，用本發(fā)明方法制備的定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)定形內(nèi)胚層的其它標(biāo)志物，包括但不限于S0X17、MIXLU GATA4、HNF3b、GSC、 FGF17、VWF、CALCR、FOXQU CMKORl和CRIP1。因?yàn)槎ㄐ蝺?nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)CXCR4標(biāo)志物基因的水平高于表達(dá)S0X7標(biāo)志物基因的水平，所以可以既監(jiān)測(cè)CXCR4又監(jiān)測(cè)S0X7的表達(dá)。其它方法中，監(jiān)測(cè)CXCR4標(biāo)志物基因和0CT4標(biāo)志物基因的表達(dá)。另外，因?yàn)槎ㄐ蝺?nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)CXCR4標(biāo)志物基因的水平高于表達(dá)AFP、SPARC或血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)標(biāo)志物基因的水平，所以還可以監(jiān)測(cè)這些基因的表達(dá)。應(yīng)當(dāng)理解，CXCR4在內(nèi)胚層細(xì)胞中的表達(dá)不排除S0X17的表達(dá)。由此，用本發(fā)明方法產(chǎn)生的定形內(nèi)胚層細(xì)胞將顯著表達(dá)S0X17和CXCR4，但不會(huì)顯著表達(dá)AFP、TM、SPARC或 PDXl。定形內(nèi)胚層細(xì)胞的富集、分離和/或純化可以使用對(duì)該細(xì)胞特異的親和標(biāo)簽富集、分離和/或純化通過(guò)任何上述方法制備的定形內(nèi)胚層細(xì)胞。對(duì)定形內(nèi)胚層細(xì)胞特異的親和標(biāo)簽的實(shí)例是對(duì)諸如多肽的標(biāo)志物分子特異的抗體、配體或其它結(jié)合劑，該標(biāo)志物分子存在于定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞表面，但不在可在通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)物中找到的其它細(xì)胞類型上顯著存在。在一些方法中，結(jié)合CXCR4的抗體被用做富集、分離和/或純化定形內(nèi)胚層細(xì)胞的親和標(biāo)簽。在其它方法中，趨化因子SDF-I或基于SDF-I的其它分子也可以被用做親和標(biāo)簽。這樣的分子包括但不限于SDF-I片段、SDF-I融和物或SDF-I模擬物。本領(lǐng)域已知制備抗體以及使用它們分離細(xì)胞的方法，這些方法可用于本文所述的抗體和定形內(nèi)胚層細(xì)胞。一種方法中，結(jié)合CXCR4的抗體被連接到磁珠上，然后使其在細(xì)胞培養(yǎng)物中與定形內(nèi)胚層細(xì)胞結(jié)合，該細(xì)胞培養(yǎng)物已經(jīng)過(guò)酶處理以減少細(xì)胞間及與基質(zhì)間的粘附。然后將該細(xì)胞/抗體/珠子復(fù)合體暴露于用于從未結(jié)合細(xì)胞中分離珠子結(jié)合的定形內(nèi)胚層細(xì)胞的活動(dòng)磁場(chǎng)中。一旦定形內(nèi)胚層細(xì)胞與培養(yǎng)物的其它細(xì)胞物理分離，就破壞所述抗體結(jié)合，并且將定形內(nèi)胚層細(xì)胞再次接種在適當(dāng)?shù)慕M織培養(yǎng)培養(yǎng)基中。也可以使用其它方法獲得富集的、分離的或純化的定形內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物或群。 例如，在一些實(shí)施方案中，CXCR4抗體與含有定形內(nèi)胚層的細(xì)胞培養(yǎng)物一起孵育，該細(xì)胞培養(yǎng)物已經(jīng)過(guò)酶處理以減少細(xì)胞間及與基質(zhì)間的粘附。然后清洗、離心并且再次懸浮這些細(xì)胞。然后該細(xì)胞懸浮物與諸如能夠結(jié)合所述初級(jí)抗體的FITC-偶聯(lián)抗體等二級(jí)抗體一起孵育。然后清洗、離心并且在緩沖液中再次懸浮這些細(xì)胞。然后使用熒光激活細(xì)胞分選儀 (FACS)分析和分選該細(xì)胞懸浮物。CXCR4-陽(yáng)性細(xì)胞被從CXCR4-陰性細(xì)胞中分離收集，因此產(chǎn)生該細(xì)胞類型的分離。如果需要的話，分離的細(xì)胞組合物可通過(guò)更多輪的分選被進(jìn)一步純化，該分選通過(guò)其它基于親和的方法或者使用特異針對(duì)定形內(nèi)胚層細(xì)胞的相同或不同標(biāo)志物。在其它方法中，可以使用配體或與CXCR4結(jié)合的其它分子富集、分離和/或純化定形內(nèi)胚層細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該分子是SDF-I或其片段、融合物或模擬物。優(yōu)選的方法中，在誘導(dǎo)干細(xì)胞培養(yǎng)物向定形內(nèi)胚層譜系分化后，從其它非定形內(nèi)胚層細(xì)胞富集、分離和/或純化定形內(nèi)胚層細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，上述富集、分離和純化方法可用于處于分化任何階段的培養(yǎng)物。除了剛描述過(guò)的方法外，也可以使用其它細(xì)胞分離技術(shù)分離定形內(nèi)胚層細(xì)胞。另外，還可以通過(guò)特定生長(zhǎng)條件下連續(xù)次培養(yǎng)的方法富集或分離定形內(nèi)胚層細(xì)胞，該特定生長(zhǎng)條件促進(jìn)定形內(nèi)胚層細(xì)胞的選擇性存活或選擇性生長(zhǎng)。使用本發(fā)明的方法，富集的、分離的和/或純化的定形內(nèi)胚層細(xì)胞群和/或組織可在體外自多能性細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群產(chǎn)生，例如已經(jīng)經(jīng)歷至少一些分化的干細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群。在一些方法中，所述細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分化。但在優(yōu)選的方法中，所述細(xì)胞被定向主要分化為定形內(nèi)胚層細(xì)胞。一些優(yōu)選的富集、分離和/或純化方法涉及在體外產(chǎn)生始于人胚胎干細(xì)胞的定形內(nèi)胚層細(xì)胞。使用本發(fā)明的方法，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物中定形內(nèi)胚層細(xì)胞的含量可被富集至少約2倍至約1000倍。包含定形內(nèi)胚層細(xì)胞的組合物上述方法產(chǎn)生的細(xì)胞組合物包括包含定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和富集定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群。例如，可以產(chǎn)生包含定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中該細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中至少約50-90%的細(xì)胞是定形內(nèi)胚層細(xì)胞。因?yàn)榭赏ㄟ^(guò)調(diào)整某些參數(shù)(這些參數(shù)包括但不限于，細(xì)胞生長(zhǎng)條件、生長(zhǎng)因子濃度和培養(yǎng)步驟的時(shí)間安排)來(lái)調(diào)整分化方法的效率，本文所述的分化方法可導(dǎo)致約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、 約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85 %、約90 %、約95 %、約98 %、約99 %或超過(guò)約99 %的多能性細(xì)胞向定形內(nèi)胚層細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在使用分離定形內(nèi)胚層細(xì)胞的方法中，例如通過(guò)使用與CXCR4受體結(jié)合的親和試劑，可回收基本上純的定形內(nèi)胚層細(xì)胞群。一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群包含人飼養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)算上述百分比時(shí)不考慮細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中的人飼養(yǎng)細(xì)胞。鑒定能夠促進(jìn)前原條和/或中內(nèi)胚層分化的因子本發(fā)明的某些篩選方法涉及鑒定能夠促進(jìn)前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞分化的至少一種分化因子的方法。這些方法的一些實(shí)施方案中，獲得包含諸如人前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞的前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群。然后向該細(xì)胞群提供候選分化因子。在第一時(shí)間點(diǎn)，其在提供候選分化因子之前或大約同時(shí)，確定標(biāo)志物的表達(dá)?；蛘?，可以在提供候選因子之后確定該標(biāo)志物的表達(dá)。在第二時(shí)間點(diǎn)，其在第一時(shí)間點(diǎn)之后并且在向所述細(xì)胞群提供候選分化因子之后，再次確定相同標(biāo)志物的表達(dá)。通過(guò)比較所述標(biāo)志物在第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)和所述標(biāo)志物在第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，確定所述候選分化因子是否能夠促進(jìn)定形內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。如果所述標(biāo)志物在第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)比所述標(biāo)志物在第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)增加或減少，則所述候選分化因子能夠促進(jìn)定形內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。本發(fā)明篩選方法的一些實(shí)施方案使用包含人前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物。例如，該細(xì)胞群可以是基本上純的人前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞群。或者，該細(xì)胞群可以是富集的人前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞群，其中該細(xì)胞群中至少約90%、 至少約91 %、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約 97 %、至少約98 %、至少約99 %或多于至少約99 %的人細(xì)胞是人前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞。本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群包含人細(xì)胞，其中至少約10%、至少約15%、至少約20 %、至少約25 %、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、 至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80 %、至少約 85%或多于至少約85%的人細(xì)胞是人前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞。其它實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群包含非人細(xì)胞，例如非人飼養(yǎng)細(xì)胞。其它實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群包含人飼養(yǎng)細(xì)胞。 這些實(shí)施方案中，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %或多于至少約 95%的除所述飼養(yǎng)細(xì)胞外的人細(xì)胞是人前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞。本發(fā)明篩選方法的一些實(shí)施方案中，使所述細(xì)胞群接觸候選(測(cè)試)分化因子，或者以其它方式向所述細(xì)胞群提供候選(測(cè)試)分化因子。該候選分化因子可以包括有可能促進(jìn)人前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞分化的任何分子。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述候選分化因子包括已知是一種或多種細(xì)胞類型的分化因子的分子。其它實(shí)施方案中，所述候選分化因子包括未知能夠促進(jìn)細(xì)胞分化的分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述候選分化因子包括未知能夠促進(jìn)人前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞分化的分子。本發(fā)明篩選方法的一些實(shí)施方案中，所述候選分化因子包括小分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，小分子是分子量約10，OOOamu或更小的分子。在一些實(shí)施方案中，小分子是類視黃醇，例如視黃酸。本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，候選分化因子包括多肽。該多肽可以是包括但不限于糖蛋白、脂蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、細(xì)胞因子、趨化因子、肽類激素、白介素或生長(zhǎng)因子的任何多肽。優(yōu)選的多肽包括生長(zhǎng)因子。一些優(yōu)選實(shí)施方案中，候選分化因子包括一種或多種選自FGF10、FGF4、FGF2和Wnt3B的生長(zhǎng)因子。本文所述篩選方法的一些實(shí)施方案中，候選分化因子包括一種或多種選自雙調(diào)蛋白(amphiregulin)、B-淋巴細(xì)胞刺激因子、IL-16、胸腺生成素、TRAIL/Apo-2、前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子、內(nèi)皮分化相關(guān)因子I (EDFl)、內(nèi)皮單核細(xì)胞活化多肽II、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、自然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子(NKEFA)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白8(成骨蛋白2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白6、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、CGI-149蛋白(神經(jīng)內(nèi)分泌分化因子)、細(xì)胞因子A3 (巨噬細(xì)胞炎性蛋白I- α )、神經(jīng)膠母細(xì)胞分化相關(guān)蛋白 (GBDRl)、肝癌衍生生長(zhǎng)因子、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽U-25前體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B(VEGF-B)、Τ細(xì)胞特異RANTES前體、胸腺樹(shù)突狀細(xì)胞衍生因子I、運(yùn)鐵蛋白、白介素-I (IL I)、白介素-2(IL 2)、白介素-3(IL 3)、白介素_4(IL 4)、白介素_5(IL 5)、白介素-6 (IL 6)、白介素-7 (IL 7)、白介素-8 (IL 8)、白介素-9 (IL 9)、白介素-10 (IL 10)、白介素-11(IL 11)、白介素-12(IL 12)、白介素-13(IL 13)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、紅細(xì)胞生成素、 血小板生成素、維生素D3、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、白血病抑制因子、甲狀腺激素、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、aFGF、FGF-4、FGF-6、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (KGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(TOGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子ΒΒ、β神經(jīng)生長(zhǎng)因子、活化素A、 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β I (TGF- β I)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-Y、腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β、爆裂刺激活性物(BPA)、紅細(xì)胞系刺激活性物(EPA)、PGE2、胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-I)、IGF-II、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白生長(zhǎng)因子(NGF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白4/5、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、膠質(zhì)源性連接蛋白(Glial-derived nexin)、地塞米松(Dexamethasone)、 β-巰基乙醇、視黃酸、叔丁對(duì)甲氧酚、5-氮雜胞苷、兩性霉素B、抗壞血酸、抗壞血酸鹽、 異丁基黃嘌呤、吲哚美辛、β -甘油磷酸鹽、煙酰胺、DMS0、噻唑烷二酮、TWS119、氧化毒素 (oxytoxin)、血管升壓素、促黑素細(xì)胞激素、促皮質(zhì)激素、促脂解素、促甲狀腺素、生長(zhǎng)激素、 促乳素、黃體生成素、人絨毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、促性腺激素釋放因子、促乳素釋放因子、促乳素抑制因子、生長(zhǎng)激素釋放因子、促生長(zhǎng)素抑制素、 促甲狀腺素釋放因子、降鈣素基因相關(guān)肽、甲狀旁腺激素、胰高血糖素樣肽I、葡萄糖依賴性促胰島多肽、胃泌素、腸促胰液素、縮膽囊素、促胃動(dòng)素、血管活性腸肽、P物質(zhì)、胰多肽、酪酪肽、酪神經(jīng)肽、胰島素、胰高血糖素、胎盤促乳素、松弛素、血管緊張素II、鈣三醇、心房鈉尿肽、褪黑激素、甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、降鈣素、雌二醇、雌酮、孕酮、睪酮、皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、醛固酮、腎上腺素、去甲腎上腺素、雄留烯(androstiene)、鈣三醇、膠原蛋白、地塞米松、 β -巰基乙醇、視黃酸、叔丁對(duì)甲氧酚、5-氮雜胞苷、兩性霉素B、抗壞血酸、抗壞血酸鹽、異丁基黃嘌呤、吲哚美辛、甘油磷酸鹽、煙酰胺、DMS0、噻唑烷二酮和TWS119的生長(zhǎng)因子。本發(fā)明篩選方法的一些實(shí)施方案中，以一種或多種濃度向細(xì)胞群提供候選分化因子。一些實(shí)施方案中，向細(xì)胞群提供候選分化因子使圍繞細(xì)胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度范圍為從約O. lng/ml到約10mg/ml。一些實(shí)施方案中，圍繞細(xì)胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度范圍為從約lng/ml到約lmg/ml。其它實(shí)施方案中，圍繞細(xì)胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度范圍為從約10ng/ml到約100 μ g/ml。其它實(shí)施方案中，圍繞細(xì)胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度范圍為從約100ng/ml到約10 μ g/ml。優(yōu)選實(shí)施方案中，圍繞細(xì)胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度為約5ng/ml、約25ng/ml、約50ng/ml、約75ng/ml、約 100ng/ml、約 125ng/ml、約 150ng/ml、約 175ng/ml、約 200ng/ml、約 225ng/ml、約 250ng/ml、 約 275ng/ml、約 300ng/ml、約 325ng/ml、約 350ng/ml、約 375ng/ml、約 400ng/ml、約 425ng/ ml、約 450ng/ml、約 475ng/ml、約 500ng/ml、約 525ng/ml、約 550ng/ml、約 575ng/ml、約 600ng/ml、約 625ng/ml、約 650ng/ml、約 675ng/ml、約 700ng/ml、約 725ng/ml、約 750ng/ml、 約 775ng/ml、約 800ng/ml、約 825ng/ml、約 850ng/ml、約 875ng/ml、約 900ng/ml、約 925ng/ ml、約 950ng/ml、約 975ng/ml、約 I μ g/ml、約 2 μ g/ml、約 3 μ g/ml、約 4 μ g/ml、約 5 μ g/ ml、約 6 μ g/ml、約 7 μ g/ml、約 8 μ g/ml、約 9 μ g/ml、約 10 μ g/ml、約 11 μ g/ml、約 12 μ g/ ml、約 13 μ g/ml、約 14 μ g/ml、約 15 μ g/ml、約 16 μ g/ml、約 17 μ g/ml、約 18 μ g/ml、約
19μ g/ml、約 20 μ g/ml、約 25 μ g/ml、約 50 μ g/ml、約 75 μ g/ml、約 100 μ g/ml、約 125 μ g/ ml、約 150 μ g/ml、約 175 μ g/ml、約 200 μ g/ml、約 250 μ g/ml、約 300 μ g/ml、約 350 μ g/ml、 約 400 μ g/ml、約 450 μ g/ml、約 500 μ g/ml、約 550 μ g/ml、約 600 μ g/ml、約 650 μ g/ml、 約 700 μ g/ml、約 750 μ g/ml、約 800 μ g/ml、約 850 μ g/ml、約 900 μ g/ml、約 950 μ g/ml、約 1000 μ g/ml 或大于 1000 μ g/ml。本發(fā)明篩選方法的某些實(shí)施方案中，向細(xì)胞群提供除前腸分化因子之外的包括任何分子的候選分化因子。例如，一些實(shí)施方案中，向細(xì)胞群提供除類視黃醇、生長(zhǎng)因子TGF3 超家族的成員、FGF10和FGF4之外的包括任何分子的候選分化因子。一些實(shí)施方案中，向細(xì)胞群提供除視黃酸之外的包括任何分子的候選分化因子。一些實(shí)施方案中，本文所述篩選方法的步驟包括確定至少一種標(biāo)志物在第一時(shí)間點(diǎn)和第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。一些實(shí)施方案中，該第一時(shí)間點(diǎn)可以在向細(xì)胞群提供候選分化因子之前或與之大致同時(shí)。或者，一些實(shí)施方案中，該第一時(shí)間點(diǎn)在向細(xì)胞群提供候選分化因子之后。一些實(shí)施方案中，確定多種標(biāo)志物在第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。除確定至少一種標(biāo)志物在第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)之外,本文所述篩選方法的一些實(shí)施方案考慮確定至少一種標(biāo)志物在第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，該第二時(shí)間點(diǎn)在第一時(shí)間點(diǎn)之后，也在向細(xì)胞群提供候選分化因子之后。這些實(shí)施方案中，確定相同標(biāo)志物在第一時(shí)間點(diǎn)和第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。一些實(shí)施方案中，確定多種標(biāo)志物在第一時(shí)間點(diǎn)和第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。這些實(shí)施方案中，確定相同的多種標(biāo)志物在第一時(shí)間點(diǎn)和第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。一些實(shí)施方案中，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)確定標(biāo)志物的表達(dá)，其中每一個(gè)都在第一時(shí)間點(diǎn)之后，并且每一個(gè)都在向細(xì)胞群提供候選分化因子之后。某些實(shí)施方案中，用Q-PCR確定標(biāo)志物的表達(dá)。其它實(shí)施方案中，用免疫細(xì)胞化學(xué)確定標(biāo)志物的表達(dá)。本文所述篩選方法的某些實(shí)施方案中，在第一時(shí)間點(diǎn)和第二時(shí)間點(diǎn)確定其表達(dá)的標(biāo)志物是與人前原條細(xì)胞和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞分化為特定細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物，該特定細(xì)胞為組成衍生自腸管的組織和/或器官的細(xì)胞的前體。一些實(shí)施方案中，衍生自腸管的組織和/或器官包含終末分化的細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，標(biāo)志物指示胰細(xì)胞或胰前體細(xì)胞。優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)志物是胰-十二指腸同源框因子-I (PDXl)。其它實(shí)施方案中，標(biāo)志物是同源框A13(H0XA13)或同源框C6 (H0XC6)。另外，其它實(shí)施方案中，標(biāo)志物指示肝細(xì)胞或肝前體細(xì)胞。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)志物是白蛋白、肝細(xì)胞特異性抗原(HSA)或普洛斯彼羅(prospero)-相關(guān)同源框I (PROXl)。其它實(shí)施方案中,標(biāo)志物指示肺或肺前體細(xì)胞。一些優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)志物是甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子l(TITFl)。其它實(shí)施方案中，標(biāo)志物指示腸或腸前體細(xì)胞。其它優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)志物是絨毛蛋白(villin)或尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子 2(CDX2)。其它實(shí)施方案中，標(biāo)志物指示胃或胃前體細(xì)胞。其它優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)志物是 VACMUVMF或CXCR4。其它實(shí)施方案中，標(biāo)志物指示甲狀腺或甲狀腺前體細(xì)胞。這些實(shí)施方案中，標(biāo)志物是TITFl。其它實(shí)施方案中,標(biāo)志物指示胸腺或胸腺前體細(xì)胞。本發(fā)明篩選方法的一些實(shí)施方案中，使向細(xì)胞群提供候選趨化因子和確定標(biāo)記物在第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)之間經(jīng)過(guò)足夠長(zhǎng)的時(shí)間。該向細(xì)胞群提供候選趨化因子和確定標(biāo)記物在第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)之間的足夠的時(shí)間間隔可以從最短約I小時(shí)到最長(zhǎng)約10天。一些實(shí)施方案中，向細(xì)胞群提供候選趨化因子后多次確定至少一種標(biāo)志物的表達(dá)。一些實(shí)施方案中，該足夠的時(shí)間間隔是最短約I小時(shí)、最短約6小時(shí)、最短約12小時(shí)、最短約18小時(shí)、最短約24小時(shí)、最短約30小時(shí)、最短約36小時(shí)、最短約42小時(shí)、最短約48小時(shí)、最短約54 小時(shí)、最短約60小時(shí)、最短約66小時(shí)、最短約72小時(shí)、最短約78小時(shí)、最短約84小時(shí)、最短約90小時(shí)、最短約96小時(shí)、最短約102小時(shí)、最短約108小時(shí)、最短約114小時(shí)、最短約 120小時(shí)、最短約126小時(shí)、最短約132小時(shí)、最短約138小時(shí)、最短約144小時(shí)、最短約150 小時(shí)、最短約156小時(shí)、最短約162小時(shí)、最短約168小時(shí)、最短約174小時(shí)、最短約180小時(shí)、最短約186小時(shí)、最短約192小時(shí)、最短約198小時(shí)、最短約204小時(shí)、最短約210小時(shí)、 最短約216小時(shí)、最短約222小時(shí)、最短約228小時(shí)、最短約234小時(shí)或最短約240小時(shí)。本文所述方法的一些實(shí)施方案中，進(jìn)一步確定標(biāo)志物在第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與該標(biāo)志物在第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)相比是否增加或減少。所述至少一種標(biāo)志物表達(dá)的增加或減少表明候選分化因子能夠促進(jìn)定形內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。類似地，如果確定了多種標(biāo)志物表達(dá)，進(jìn)一步確定該多種標(biāo)志物在第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與該多種標(biāo)志物在第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)相比是否增加或減少?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)量或評(píng)估細(xì)胞群中標(biāo)志物在第一和第二時(shí)間點(diǎn)的數(shù)量、水平或活性來(lái)確定標(biāo)志物表達(dá)的增加或減少。這種確定可以是與其它標(biāo)志物(如看家基因的表達(dá))相比較的，或絕對(duì)的。某些實(shí)施方案中，其中標(biāo)志物在第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)比其在第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)增加了，增加的量為至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90 倍、至少約100倍或多于至少約100倍。一些實(shí)施方案中，增加的量為少于2倍。標(biāo)志物在第二時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)比其在第一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)減少的實(shí)施方案中，減少的量為至少約2倍、 至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約 60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍或多于至少約100倍。一些實(shí)施方案中，減少的量為少于2倍。本文所述篩選方法的一些實(shí)施方案中，向細(xì)胞群提供候選趨化因子之后，人前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞分化為一種或多種定形內(nèi)胚層譜系的細(xì)胞類型。一些實(shí)施方案中， 向細(xì)胞群提供候選趨化因子之后，人前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞分化為衍生自腸管的細(xì)胞。這些細(xì)胞包括但不限于，胰腺、肝、肺、胃、腸、甲狀腺、胸腺、咽、膽囊和膀胱的細(xì)胞和這些細(xì)胞的前體。此外，這些細(xì)胞可以進(jìn)一步發(fā)育為更高級(jí)的結(jié)構(gòu)如組織和/或器官。本發(fā)明的篩選方法的其它實(shí)施方案中，向所述細(xì)胞群提供候選分化因子之后，所述人前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞分化為中胚層譜系的一種或多種細(xì)胞類型。一些實(shí)施方案中，向所述細(xì)胞群提供候選分化因子之后，所述人前原條和/或中內(nèi)胚層細(xì)胞分化為包括但不限于血細(xì)胞、心血管系統(tǒng)的細(xì)胞、骨骼組織及其它結(jié)構(gòu)和結(jié)締組織以及每一前述細(xì)胞類型的前體的細(xì)胞。或者，這些細(xì)胞可以進(jìn)一步發(fā)育為諸如組織和/或器官的更高級(jí)結(jié)構(gòu)。增加FGF8基因產(chǎn)物表汰的方法本發(fā)明方法的一些實(shí)施方案涉及在體外增加FGF8基因產(chǎn)物在人胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)的方法。此類方法包括在含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基中獲得所述hESC的步驟。例如，該培養(yǎng)基可以含有濃度為約0% (v/v)、約O. 05% (v/v)、約0.1% (v/v)、約0.2% (v/v)、約 O. 3% (v/v)、約 O. 4% (v/v)、約 O. 5% (v/v)、約 O. 6% (v/v)、約 O. 7% (v/v)、約 O. 8% (v/v)、約 O. 9% (v/v)、約 I % (v/v)、約 1.1% (v/v)、約 I. 2% (v/v)、約 I. 3% (v/v)、 約 L 4% (v/v)、約 L 5% (v/v)、約 L 6% (v/v)、約 L 7% (v/v)、約 L 8% (v/v)、約 L 9% (v/v)的血清。一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基不包含血清替代物。讓hESC與足以增加FGF8 基因產(chǎn)物的表達(dá)的量的分化因子接觸。一些實(shí)施方案中，所述分化因子是至少一種TGF3 超家族的生長(zhǎng)因子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述TGFii超家族的生長(zhǎng)因子是活化素A。用于接觸hESC的分化因子的濃度范圍從約lng/ml至約lmg/ml。例如,分化因子可以以lng/ml、 約 5ng/ml、約 25ng/ml、約 50ng/ml、約 75ng/ml、約 100ng/ml、約 125ng/ml、約 150ng/ml、約 175ng/ml、約 200ng/ml、約 225ng/ml、約 250ng/ml、約 275ng/ml、約 300ng/ml、約 325ng/ml、 約 350ng/ml、約 375ng/ml、約 400ng/ml、約 425ng/ml、約 450ng/ml、約 475ng/ml、約 500ng/ ml、約 525ng/ml、約 550ng/ml、約 575ng/ml、約 600ng/ml、約 625ng/ml、約 650ng/ml、約 675ng/ml、約 700ng/ml、約 725ng/ml、約 750ng/ml、約 775ng/ml、約 800ng/ml、約 825ng/ml、 約 850ng/ml、約 875ng/ml、約 900ng/ml、約 925ng/ml、約 950ng/ml、約 975ng/ml、約 lyg/ ml、約 2 μ g/ml、約 3 μ g/ml、約 4 μ g/ml、約 5 μ g/ml、約 6 μ g/ml、約 7 μ g/ml、約 8 μ g/ml、約9 μ g/ml、約 10 μ g/ml、約 11 μ g/ml、約 12 μ g/ml、約 13 μ g/ml、約 14 μ g/ml、約 15 μ g/ml、 約 16 μ g/ml、約 17 μ g/ml、約 18 μ g/ml、約 19 μ g/ml、約 20 μ g/ml、約 25 μ g/ml、約 50 μ g/ ml、約 75 μ g/ml、約 100 μ g/ml、約 125 μ g/ml、約 150 μ g/ml、約 175 μ g/ml、約 200 μ g/ml、 約 250 μ g/ml、約 300 μ g/ml、約 350 μ g/ml、約 400 μ g/ml、約 450 μ g/ml、約 500 μ g/ml、 約 550 μ g/ml、約 600 μ g/ml、約 650 μ g/ml、約 700 μ g/ml、約 750 μ g/ml、約 800 μ g/ml、約 850 μ g/ml、約 900 μ g/ml、約 950 μ g/ml、約 1000 μ g/ml 的濃度接觸 hESC。 曾力口 Brachyury、FGF4矛口 /或SNAIl基因產(chǎn)物表達(dá)的方法本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及在體外增加brachyuir、FGF4和/或SNAIl基因產(chǎn)物在人胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)的方法。此類方法包括在含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基中獲得所述hESC的步驟。例如，該培養(yǎng)基可以含有濃度為約0% (v/v)、約O. 05% (v/v)、 約 0.1% (v/v)、約 O. 2% (v/v)、約 O. 3% (v/v)、約 O. 4% (v/v)、約 O. 5% (v/v)、約 O. 6% (v/v)、約 O. 7% (v/v)、約 O. 8% (v/v)、約 O. 9% (v/v)、約 I % (v/v)、約 1.1% (v/v)、約 1.2% (v/v)、約 1.3% (v/v)、約 1.4% (v/v)、約 1.5% (v/v)、約 1.6% (v/v)、約 1.7% (v/v)、約1.8% (v/v)、約1.9% (v/v)的血清。一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基不包含血清替代物。讓hESC與足以增加brachyuir、FGF4和/或SNAIl基因產(chǎn)物的表達(dá)的量的分化因子接觸。一些實(shí)施方案中，所述分化因子是至少一種TGFP超家族的生長(zhǎng)因子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述TGFP超家族的生長(zhǎng)因子是活化素A。用于接觸hESC的分化因子的濃度范圍從約lng/ml至約lmg/ml ο例如，分化因子可以以lng/ml、約5ng/ml、約25ng/ml、約 50ng/ml、約 75ng/ml、約 100ng/ml、約 125ng/ml、約 150ng/ml、約 175ng/ml、約 200ng/ml、約 225ng/ml、約 250ng/ml、約 275ng/ml、約 300ng/ml、約 325ng/ml、約 350ng/ml、約 375ng/ml、 約 400ng/ml、約 425ng/ml、約 450ng/ml、約 475ng/ml、約 500ng/ml、約 525ng/ml、約 550ng/ ml、約 575ng/ml、約 600ng/ml、約 625ng/ml、約 650ng/ml、約 675ng/ml、約 700ng/ml、約 725ng/ml、約 750ng/ml、約 775ng/ml、約 800ng/ml、約 825ng/ml、約 850ng/ml、約 875ng/ml、 約 900ng/ml、約 925ng/ml、約 950ng/ml、約 975ng/ml、約 I μ g/ml、約 2 μ g/ml、約 3 μ g/ml、 約 4μ g/ml、約 5 μ g/ml、約 6 μ g/ml、約 7 μ g/ml、約 8 μ g/ml、約 9 μ g/ml、約 10 μ g/ml、約
11μ g/ml、約 12 μ g/ml、約 13 μ g/ml、約 14 μ g/ml、約 15 μ g/ml、約 16 μ g/ml、約 17 μ g/ml、 約 18 μ g/ml、約 19 μ g/ml、約 20 μ g/ml、約 25 μ g/ml、約 50 μ g/ml、約 75 μ g/ml、約 100 μ g/ ml、約 125 μ g/ml、約 150 μ g/ml、約 175 μ g/ml、約 200 μ g/ml、約 250 μ g/ml、約 300 μ g/ml、 約 350 μ g/ml、約 400 μ g/ml、約 450 μ g/ml、約 500 μ g/ml、約 550 μ g/ml、約 600 μ g/ml、 約 650 μ g/ml、約 700 μ g/ml、約 750 μ g/ml、約 800 μ g/ml、約 850 μ g/ml、約 900 μ g/ml、約 950 μ g/ml、約 1000 μ g/ml 的濃度接觸 hESC?；虍a(chǎn)物在細(xì)胞培養(yǎng)物中的時(shí)間件表達(dá)本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及具有特定時(shí)間模式的基因表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)物。一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)物包含人胚胎干細(xì)胞(hESC)和含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。 例如，該培養(yǎng)基可以含有濃度為約0% (v/v)、約O. 05% (v/v)、約0.1% (v/v)、約0.2% (v/v)、約 O. 3% (v/v)、約 O. 4% (v/v)、約 O. 5% (v/v)、約 O. 6% (v/v)、約 O. 7% (v/v)、約 0.8% (v/v)、約 O. 9% (v/v)、約 1% (v/v)、約 I. 1% (v/v)、約 I. 2% (v/v)、約 I. 3% (v/v)、 約 I. 4% (v/v)、約 I. 5% (v/v)、約 I. 6% (v/v)、約 I. 7% (v/v)、約 I. 8% (v/v)、約 I. 9% (v/v)的血清。一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基不包含血清替代物。一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基是低血清RPMI。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)物中的hESC在參考時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始分化。該參考時(shí)間點(diǎn)是向所述細(xì)胞提供分化因子的點(diǎn)。一些實(shí)施方案中，所述分化因子是至少一種TGFP超家族的生長(zhǎng)因子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述TGFii超家族的生長(zhǎng)因子是活化素A。向hESC 提供的分化因子的濃度范圍從約lng/ml至約lmg/ml。例如，分化因子可以以lng/ml、約 5ng/ml、約 25ng/ml、約 50ng/ml、約 75ng/ml、約 100ng/ml、約 125ng/ml、約 150ng/ml、約 175ng/ml、約 200ng/ml、約 225ng/ml、約 250ng/ml、約 275ng/ml、約 300ng/ml、約 325ng/ml、 約 350ng/ml、約 375ng/ml、約 400ng/ml、約 425ng/ml、約 450ng/ml、約 475ng/ml、約 500ng/ ml、約 525ng/ml、約 550ng/ml、約 575ng/ml、約 600ng/ml、約 625ng/ml、約 650ng/ml、約 675ng/ml、約 700ng/ml、約 725ng/ml、約 750ng/ml、約 775ng/ml、約 800ng/ml、約 825ng/ml、 約 850ng/ml、約 875ng/ml、約 900ng/ml、約 925ng/ml、約 950ng/ml、約 975ng/ml、約 lyg/ ml、約 2 μ g/ml、約 3 μ g/ml、約 4 μ g/ml、約 5 μ g/ml、約 6 μ g/ml、約 7 μ g/ml、約 8 μ g/ml、約 9 μ g/ml、約 10 μ g/ml、約 11 μ g/ml、約 12 μ g/ml、約 13 μ g/ml、約 14 μ g/ml、約 15 μ g/ml、 約 16 μ g/ml、約 17 μ g/ml、約 18 μ g/ml、約 19 μ g/ml、約 20 μ g/ml、約 25 μ g/ml、約 50 μ g/ ml、約 75 μ g/ml、約 100 μ g/ml、約 125 μ g/ml、約 150 μ g/ml、約 175 μ g/ml、約 200 μ g/ml、 約 250 μ g/ml、約 300 μ g/ml、約 350 μ g/ml、約 400 μ g/ml、約 450 μ g/ml、約 500 μ g/ml、 約 550 μ g/ml、約 600 μ g/ml、約 650 μ g/ml、約 700 μ g/ml、約 750 μ g/ml、約 800 μ g/ml、約 850 μ g/ml、約 900 μ g/ml、約 950 μ g/ml、約 1000 μ g/ml 的濃度接觸 hESC。向hESC提供分化因子后，與hESC中的基線FGF8 mRNA表達(dá)相比，F(xiàn)GF8 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。hESC中的基線FGF8表達(dá)是諸如mRNA等的FGF8基因產(chǎn)物的表達(dá)，該FGF8基因產(chǎn)物存在于維持在未分化狀態(tài)的hESC細(xì)胞培養(yǎng)物中。一些實(shí)施方案中，距參考時(shí)間點(diǎn)約 6小時(shí)時(shí)，F(xiàn)GF8 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，距參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)后，F(xiàn)GF8 mRNA的表達(dá)下調(diào)。其它實(shí)施方案中，F(xiàn)GF8 mRNA的表達(dá)在距參考時(shí)間點(diǎn)約6小時(shí)至約24小時(shí)之間達(dá)到峰值。其它實(shí)施方案中，F(xiàn)GF8的峰值表達(dá)在距參考時(shí)間點(diǎn)少于約6小時(shí)時(shí)達(dá)到。本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及細(xì)胞培養(yǎng)物，其展現(xiàn)連接素多肽的增加的細(xì)胞核定位。在這些實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約17小時(shí)時(shí)β-連接素多肽開(kāi)始向細(xì)胞核定位。一些實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)短于約17小時(shí)時(shí)β-連接素多肽開(kāi)始向細(xì)胞核定位。其它實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約17小時(shí)時(shí)β-連接素多肽顯著地向細(xì)胞核定位。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物的其它實(shí)施方案涉及具有增加的brachyury mRNA表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)物。在該細(xì)胞培養(yǎng)物中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)時(shí)brachyury mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。一些實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)之前brachyury mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。一些實(shí)施方案中,距所述參考時(shí)間點(diǎn)約48小時(shí)時(shí)brachyury mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。 某些實(shí)施方案中，brachyury mRNA的表達(dá)在距參考時(shí)間點(diǎn)約12小時(shí)至約48小時(shí)之間達(dá)到峰值。在優(yōu)選實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約72小時(shí)時(shí)brachyury mRNA不顯著表達(dá)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)時(shí)brachyury mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，而在距所述參考時(shí)間點(diǎn)約72小時(shí)時(shí)brachyury mRNA不顯著表達(dá)。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物的其它實(shí)施方案涉及具有增加的FGF4 mRNA表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)物。在該細(xì)胞培養(yǎng)物中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)時(shí)FGF4 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。一些實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)之前FGF4 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。一些實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約48小時(shí)時(shí)FGF4 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。某些實(shí)施方案中，F(xiàn)GF4 mRNA的表達(dá)在距參考時(shí)間點(diǎn)約12小時(shí)至約48小時(shí)之間達(dá)到峰值。在優(yōu)選實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約72小時(shí)時(shí)FGF4 mRNA不顯著表達(dá)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)時(shí)FGF4 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，而在距所述參考時(shí)間點(diǎn)約72小時(shí)時(shí)FGF4 mRNA不顯著表達(dá)。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物的優(yōu)選實(shí)施方案涉及具有增加的brachyury和FGF4 mRNA表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)物。在該細(xì)胞培養(yǎng)物中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)時(shí)brachyury和FGF4 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。一些實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)之前brachyury和 FGF4 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。一些實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約48小時(shí)時(shí)brachyury 和FGF4 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。某些實(shí)施方案中，brachyury和FGF4 mRNA的表達(dá)在距參考時(shí)間點(diǎn)約12小時(shí)至約48小時(shí)之間達(dá)到峰值。在優(yōu)選實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約 72小時(shí)時(shí)brachyury和FGF4 mRNA不顯著表達(dá)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)時(shí)brachyury和FGF4 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，而在距所述參考時(shí)間點(diǎn)約72小時(shí)時(shí)brachyury和FGF4 mRNA不顯著表達(dá)。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物的其它實(shí)施方案涉及具有增加的SNAIl mRNA表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)物。在該細(xì)胞培養(yǎng)物中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)時(shí)SNAIl mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。一些實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約24小時(shí)之前SNAIl mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。一些實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約48小時(shí)時(shí)SNAIl mRNA的表達(dá)下調(diào)。某些實(shí)施方案中，SNAIl mRNA的表達(dá)在距參考時(shí)間點(diǎn)約12小時(shí)至約48小時(shí)之間達(dá)到峰值。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物的實(shí)施方案還涉及具有E-鈣粘著素(ECAD)基因產(chǎn)物的特異時(shí)間表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)物。該實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約12小時(shí)時(shí)E-鈣粘著素mRNA 的表達(dá)下調(diào)。其它實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)短于12小時(shí)時(shí)E-鈣粘著素mRNA的表達(dá)可以下調(diào)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約48小時(shí)時(shí)E-鈣粘著素mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及表達(dá)S0X17和/或F0XA2標(biāo)志物的細(xì)胞培養(yǎng)物。一些實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約48小時(shí)時(shí)S0X17 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。其它實(shí)施方案中，距所述參考時(shí)間點(diǎn)約96小時(shí)時(shí)F0XA2 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包括具有某些特定模式的基因表達(dá)的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。這些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含hESC、例如TGFii超家族的分化因子等的分化因子和包含少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。其它實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基包含多于2% (v/v)的血清。一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)物缺乏血清替代物。一些實(shí)施方案中，在向所述細(xì)胞培養(yǎng)物提供所述分化因子時(shí)，所述細(xì)胞培養(yǎng)物全部是或主要全部是hESC。在分化期間，至少部分hESC分化為其它細(xì)胞類型，如通過(guò)某些標(biāo)志物基因產(chǎn)物(mRNA和/或多肽)的表達(dá)所表明的。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物的一些實(shí)施方案中，第一套標(biāo)志物基因的表達(dá)在第二和/或第三套標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前上調(diào)。一些實(shí)施方案中，每一套標(biāo)志物基因都可以包括一種或多種標(biāo)志物基因?；虮磉_(dá)上調(diào)的范圍可以是從輕微到顯著。例如，與未分化hESC 中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以上調(diào)至少約10%。其它實(shí)施方案中，與未分化hESC中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以上調(diào)至少約 20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約90 %或多于至少約90%。其它實(shí)施方案中，與未分化hESC中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以上調(diào)至少2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6 倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約 30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、 至少約100倍或多于至少約100倍。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物的其它實(shí)施方案中，第一套標(biāo)志物基因的表達(dá)在第二和/或第三套標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前下調(diào)。這些實(shí)施方案中，每一套標(biāo)志物基因都可以包括一種或多種標(biāo)志物基因。如同基因表達(dá)的上調(diào)，下調(diào)的范圍可以是從輕微到顯著。例如， 與未分化hESC中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以下調(diào)至少約10%。 其它實(shí)施方案中，與未分化hESC中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以下調(diào)至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或多于至少約90%。其它實(shí)施方案中，與未分化hESC中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以下調(diào)至少2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5 倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約 20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、 至少約90倍、至少約100倍或多于至少約100倍。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物的其它實(shí)施方案中，第一套標(biāo)志物基因的表達(dá)在第二和/或第三套標(biāo)志物基因的峰值表達(dá)之前或大致同時(shí)上調(diào)。這些實(shí)施方案中，每一套標(biāo)志物基因都可以包括一種或多種標(biāo)志物基因。其它實(shí)施方案中，第一套標(biāo)志物基因的表達(dá)在第二和 /或第三套標(biāo)志物基因的峰值表達(dá)之前或大致同時(shí)下調(diào)。如上所述，在這些實(shí)施方案中，每一套標(biāo)志物基因都可以包括一種或多種標(biāo)志物基因。而且，在上述實(shí)施方案中，基因表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)的范圍都可以是從輕微到顯著。例如，與未分化hESC中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以上調(diào)或下調(diào)至少約10%。其它實(shí)施方案中，與未分化hESC 中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以上調(diào)或下調(diào)至少約20%、至少約 30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或多于至少約90%。其它實(shí)施方案中，與未分化hESC中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比,該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以上調(diào)或下調(diào)至少2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、 至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約30 倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍或多于至少約100倍。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一些細(xì)胞中，選自FGF8、 Nodal、HEG、HEYl、GATA2、BIK 和 IDl 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAII、 Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前上調(diào)。其它實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一些細(xì)胞中，選自FGF8、Nodal、 HEG、HEYU GATA2、BIK 和 IDl 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAIU Wnt3、 MIXL1、DKK4、NET01、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1 和 GRM4 的標(biāo)志物基因的峰值表達(dá)之前上調(diào)。其它實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一些細(xì)胞中，選自HEY1、GATA2、BIK和IDl的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAII、Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTI、 FLJ22662、SLIT2、GADl和GRM4的標(biāo)志物基因的峰值表達(dá)之前或大致同時(shí)下調(diào)。其它實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一些細(xì)胞中，選自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和 IDl的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前上調(diào)。其它實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一些細(xì)胞中，選自brachyury、FGF4、 SNAI1、Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前或大致同時(shí)上調(diào)。其它實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一些細(xì)胞中，選自brachyury、FGF4、SNAIl、 Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標(biāo)志物基因在選自 S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前或大致同時(shí)達(dá)到峰值表達(dá)。其它實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一些細(xì)胞中，選自FGF8、Nodal.HEG, HEY1、GATA2、 BIK 和 IDl 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAIl、Wnt3、MIXLl、DKK4、NET01、 T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前上調(diào)。具有一種或多種上述時(shí)間性基因表達(dá)模式的細(xì)胞培養(yǎng)物中的一些包括包含少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基不含血清。在其它實(shí)施方案中，培養(yǎng)基不含血清替代物。用于本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)物的一些培養(yǎng)基包括濃度少于約I. 9% (v/v)、 少于約I. 8% (v/v)、少于約I. 7% (v/v)、少于約1.6% (v/v)、少于約I. 5% (v/v)、少于約 I. 4% (v/v)、少于約 I. 3% (v/v)、少于約 I. 2% (v/v)、少于約 I. 1% (v/v)、少于約 1% (v/v)、少于約 O. 9% (v/v)、少于約 O. 8% (v/v)、少于約 O. 7% (v/v)、少于約 O. 6% (v/v)、 少于約O. 5% (v/v)、少于約O. 4% (v/v)、少于約O. 3% (v/v)、少于約O. 2% (v/v)、少于約 O. 1% (v/v)或少于約O. 05% (v/v)的血清。具有一種或多種上述時(shí)間性基因表達(dá)模式的細(xì)胞培養(yǎng)物中的一些包含至少一種 TGF^超家族的分化因子。一些實(shí)施方案中，該生長(zhǎng)因子是nodal、活化素A和/或活化素 B。在優(yōu)選實(shí)施方案中,所述分化因子是活化素A。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，活化素A在培養(yǎng)基中存在的濃度為約100ng/ml。然而，應(yīng)該理解，可以以約lng/ml至約lmg/ml的濃度范圍向細(xì)胞培養(yǎng)物提供所述TGFβ超家族的分化因子。一些實(shí)施方案中，以約5ng/ml、約25ng/ml、約50ng/ml、約 75ng/ml、約 100ng/ml、約 125ng/ml、約 150ng/ml、約 175ng/ml、約 200ng/ml、約 225ng/ml、 約 250ng/ml、約 275ng/ml、約 300ng/ml、約 325ng/ml、約 350ng/ml、約 375ng/ml、約 400ng/ ml、約 425ng/ml、約 450ng/ml、約 475ng/ml、約 500ng/ml、約 525ng/ml、約 550ng/ml、約 575ng/ml、約 600ng/ml、約 625ng/ml、約 650ng/ml、約 675ng/ml、約 700ng/ml、約 725ng/ml、 約 750ng/ml、約 775ng/ml、約 800ng/ml、約 825ng/ml、約 850ng/ml、約 875ng/ml、約 900ng/ ml、約 925ng/ml、約 950ng/ml、約 975ng/ml、約 I μ g/ml、約 2 μ g/ml、約 3 μ g/ml、約 4 μ g/ ml、約 5 μ g/ml、約 6 μ g/ml、約 7 μ g/ml、約 8 μ g/ml、約 9 μ g/ml、約 10 μ g/ml、約 11 μ g/ ml、約 12 μ g/ml、約 13 μ g/ml、約 14 μ g/ml、約 15 μ g/ml、約 16 μ g/ml、約 17 μ g/ml、約 18 μ g/ml、約 19 μ g/ml、約 20 μ g/ml、約 25 μ g/ml、約 50 μ g/ml、約 75 μ g/ml、約 100 μ g/ ml、約 125 μ g/ml、約 150 μ g/ml、約 175 μ g/ml、約 200 μ g/ml、約 250 μ g/ml、約 300 μ g/ml、 約 350 μ g/ml、約 400 μ g/ml、約 450 μ g/ml、約 500 μ g/ml、約 550 μ g/ml、約 600 μ g/ml、 約 650 μ g/ml、約 700 μ g/ml、約 750 μ g/ml、約 800 μ g/ml、約 850 μ g/ml、約 900 μ g/ml、約950 μ g/ml、約1000 μ g/ml或高于約1000 μ g/ml向細(xì)胞培養(yǎng)物提供所述TGF β超家族的分化因子。本發(fā)明還預(yù)期分化hESC以產(chǎn)生具有特定時(shí)間性標(biāo)志物基因表達(dá)模式的細(xì)胞的方法。例如，一些實(shí)施方案涉及分化人胚胎干細(xì)胞(hESC)的方法，其通過(guò)使hESC接觸包含少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基，向該hESC提供TGFii超家族的分化因子，然后容許hESC的分化發(fā)生來(lái)實(shí)現(xiàn)。在上述分化hESC的方法的一些實(shí)施方案中，第一套標(biāo)志物基因的表達(dá)在第二和 /或第三套標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前上調(diào)。一些實(shí)施方案中，每一套標(biāo)志物基因都可以包括一種或多種標(biāo)志物基因?；虮磉_(dá)上調(diào)的范圍可以是從輕微到顯著。例如，與未分化 hESC中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以上調(diào)至少約10%。其它實(shí)施方案中，與未分化hESC中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比,該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以上調(diào)至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、 至少約90%或多于至少約90%。其它實(shí)施方案中，與未分化hESC中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以上調(diào)至少2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、 至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約 90倍、至少約100倍或多于至少約100倍。本發(fā)明的分化hESC的方法的其它實(shí)施方案中，第一套標(biāo)志物基因的表達(dá)在第二和/或第三套標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前下調(diào)。這些實(shí)施方案中，每一套標(biāo)志物基因都可以包括一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物基因。如同基因表達(dá)的上調(diào)，下調(diào)的范圍可以是從輕微到顯著。 例如，與未分化hESC中同一標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以下調(diào)至少約10%。其它實(shí)施方案中，與未分化hESC中同一標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以下調(diào)至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約 70 %、至少約80 %、至少約90 %或多于至少約90 %。其它實(shí)施方案中，與未分化hESC中同一標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以下調(diào)至少2倍、至少約3倍、至少約4 倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15 倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍或多于至少約100倍。本發(fā)明的分化hESC的方法的其它實(shí)施方案中，第一套標(biāo)志物基因的表達(dá)在第二和/或第三套標(biāo)志物基因的峰值表達(dá)之前或大致同時(shí)上調(diào)。這些實(shí)施方案中，每一套標(biāo)志物基因都可以包括一種或多種標(biāo)志物基因。其它實(shí)施方案中，第一套標(biāo)志物基因的表達(dá)在第二和/或第三套標(biāo)志物基因的峰值表達(dá)之前或大約同時(shí)下調(diào)。如上所述，在這些實(shí)施方案中，每一套標(biāo)志物基因都可以包括一種或多種標(biāo)志物基因。而且，在上述實(shí)施方案中，基因表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)的范圍都可以是從輕微到顯著。例如，與未分化hESC中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以上調(diào)或下調(diào)至少約10%。其它實(shí)施方案中，與未分化hESC中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以上調(diào)或下調(diào)至少約
20%、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約90%或多于至少約90%。其它實(shí)施方案中，與未分化hESC中相同標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，該標(biāo)志物基因的表達(dá)可以上調(diào)或下調(diào)至少2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20 倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍或多于至少約100倍。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一些細(xì)胞中，選自FGF8、 Nodal、HEG、HEYl、GATA2、BIK 和 IDl 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAII、 Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前上調(diào)。其它實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一些細(xì)胞中，選自FGF8、Nodal、 HEG、HEYU GATA2、BIK 和 IDl 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAIU Wnt3、 MIXL1、DKK4、NET01、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1 和 GRM4 的標(biāo)志物基因的峰值表達(dá)之前上調(diào)。其它實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一些細(xì)胞中，選自HEY1、GATA2、BIK和IDl 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAII、Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTI、 FLJ22662、SLIT2、GADl和GRM4的標(biāo)志物基因的峰值表達(dá)之前或大致同時(shí)下調(diào)。其它實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一些細(xì)胞中，選自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和 IDl的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前上調(diào)。其它實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一些細(xì)胞中，選自brachyury、FGF4、 SNAI1、Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前或大致同時(shí)上調(diào)。其它實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一些細(xì)胞中，選自brachyury、FGF4、SNAIl、 Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標(biāo)志物基因在選自 S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前或大致同時(shí)達(dá)到峰值表達(dá)。其它實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一些細(xì)胞中，選自FGF8、Nodal.HEG, HEY1、GATA2、 BIK 和 IDl 的標(biāo)志物基因的表達(dá)在選自 brachyury、FGF4、SNAIl、Wnt3、MIXLl、DKK4、NET01、 T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的標(biāo)志物基因的表達(dá)上調(diào)之前上調(diào)。在本發(fā)明分化方法的一些實(shí)施方案中，使細(xì)胞培養(yǎng)物接觸或者以其它方式向其提供包含少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基不含血清。在其它實(shí)施方案中，培養(yǎng)基不含血清替代物。用于本發(fā)明方法的一些培養(yǎng)基包括濃度少于約I. 9% (v/ V)、少于約 I. 8% (v/v)、少于約 I. 7% (v/v)、少于約 I. 6% (v/v)、少于約 I. 5% (v/v)、少于約 I. 4% (v/v)、少于約 I. 3% (v/v)、少于約 I. 2% (v/v)、少于約 I. 1% (v/v)、少于約 1% (v/v)、少于約 0.9% (v/v)、少于約 0.8% (v/v)、少于約 0. 7% (v/v)、少于約 0. 6% (v/v)、 少于約0.5% (v/v)、少于約0. 4% (v/v)、少于約0. 3% (v/v)、少于約0. 2% (v/v)、少于約 0. 1% (v/v)或少于約0.05% (v/v)的血清。分化hESC以產(chǎn)生上述基因表達(dá)的時(shí)間模式的一些方法包括向例如hESC的培養(yǎng)物中的細(xì)胞提供至少一種TGFii超家族的分化因子。一些實(shí)施方案中，該生長(zhǎng)因子是nodal、 活化素A和/或活化素B。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述分化因子是活化素A。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，活化素A在培養(yǎng)基中存在的濃度為約100ng/ml。然而，應(yīng)該理解，可以以約lng/ml至約lmg/ml的濃度范圍向細(xì)胞培養(yǎng)物提供所述TGFβ超家族的分化因子。一些實(shí)施方案中，以約5ng/ml、約25ng/ml、約50ng/ml、約 75ng/ml、約 100ng/ml、約 125ng/ml、約 150ng/ml、約 175ng/ml、約 200ng/ml、約 225ng/ml、 約 250ng/ml、約 275ng/ml、約 300ng/ml、約 325ng/ml、約 350ng/ml、約 375ng/ml、約 400ng/ml、約 425ng/ml、約 450ng/ml、約 475ng/ml、約 500ng/ml、約 525ng/ml、約 550ng/ml、約 575ng/ml、約 600ng/ml、約 625ng/ml、約 650ng/ml、約 675ng/ml、約 700ng/ml、約 725ng/ml、 約 750ng/ml、約 775ng/ml、約 800ng/ml、約 825ng/ml、約 850ng/ml、約 875ng/ml、約 900ng/ ml、約 925ng/ml、約 950ng/ml、約 975ng/ml、約 I μ g/ml、約 2 μ g/ml、約 3 μ g/ml、約 4 μ g/ ml、約 5 μ g/ml、約 6 μ g/ml、約 7 μ g/ml、約 8 μ g/ml、約 9 μ g/ml、約 10 μ g/ml、約 11 μ g/ ml、約 12 μ g/ml、約 13 μ g/ml、約 14 μ g/ml、約 15 μ g/ml、約 16 μ g/ml、約 17 μ g/ml、約 18 μ g/ml、約 19 μ g/ml、約 20 μ g/ml、約 25 μ g/ml、約 50 μ g/ml、約 75 μ g/ml、約 100 μ g/ ml、約 125 μ g/ml、約 150 μ g/ml、約 175 μ g/ml、約 200 μ g/ml、約 250 μ g/ml、約 300 μ g/ml、 約 350 μ g/ml、約 400 μ g/ml、約 450 μ g/ml、約 500 μ g/ml、約 550 μ g/ml、約 600 μ g/ml、 約 650 μ g/ml、約 700 μ g/ml、約 750 μ g/ml、約 800 μ g/ml、約 850 μ g/ml、約 900 μ g/ml、約 950 μ g/ml、約1000 μ g/ml或高于約1000 μ g/ml向細(xì)胞培養(yǎng)物提供所述TGF β超家族的分化因子。以上概括描述了本發(fā)明，可通過(guò)參照本文提供的某些具體實(shí)施例進(jìn)一步理解本發(fā)明，這些實(shí)施例僅是為了說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例以下很多實(shí)施例描述了人多能性細(xì)胞的使用。產(chǎn)生人多能性細(xì)胞的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，在許多科學(xué)出版物中都有描述，包括第5，453，357,5, 670，372,5, 690，926、 6,090,622,6, 200,806和6，251,671號(hào)美國(guó)專利及
發(fā)明者伊曼紐爾·E·貝特格, 依文特·克魯恩, 凱文·艾倫·達(dá)穆?tīng)? 艾倫·D·阿古尼克, 蘇珊·埃利澤 申請(qǐng)人:維亞希特公司