專利名稱：一種發(fā)酵培養(yǎng)基及用該培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵培養(yǎng)基及用該培養(yǎng)基生產(chǎn)丁醇的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
丁醇是一種重要的有機溶劑和化工原料，廣泛應(yīng)用于化工、塑料、有機合成、油漆等行業(yè)。丁醇還是一種極具潛力的新型生物燃料，其具有能量密度高、腐蝕性小、蒸汽壓力低、親水性弱等許多優(yōu)于生物乙醇之處而受到世界各國的廣泛關(guān)注。
生物丁醇一般通過丙酮-丁醇發(fā)酵制備，作為一項傳統(tǒng)的工業(yè)發(fā)酵，其生產(chǎn)規(guī)模曾經(jīng)僅次于乙醇發(fā)酵。20世紀(jì)中期，由于生產(chǎn)成本等原因，丁醇發(fā)酵工藝逐漸衰退(Qureshi N, Blaschek H P. Recent advances in ABE fermentation: hyper—butanol producing Clostridium beijerinckii BAlOL J Ind Microbiol Biotechnol 27:287-291.)。日前， 隨著石油危機等問題的日益突顯，丁醇的生物發(fā)酵工業(yè)受到越來越多的關(guān)注。
甘蔗渣酸解糖液中含有酸類、醛類、木質(zhì)素衍生物等副產(chǎn)物，甘蔗渣除少量用于造紙外，絕大部分被焚燒或廢棄(李春光，周偉鐸等.甘蔗渣纖維素提取及木質(zhì)素與半纖維素脫除工藝探討[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2011，4:316-320)。為有效提高丁醇發(fā)酵的經(jīng)濟競爭性， 利用價格低廉的纖維原料和農(nóng)林廢棄物等作為底物制備燃料丁醇成為近年來研究的熱點問題之一。本申請人之前申請的專利《一株高抗逆性貝氏梭菌及其應(yīng)用》CN102174433A中涉及一株能利用未脫毒木質(zhì)纖維酸解糖液的貝氏梭菌^Zo1Sirii/i beijerinckii IB4,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號CCTCC N0:M2010310，保藏日期2010年 11月23日，在該專利中所用的P2培養(yǎng)基成分復(fù)雜，含有8種組分，且丁醇產(chǎn)量相對較低， NCIMB8052 和 IB4 丁醇產(chǎn)量分別為 1. 6g/L 和 6. 8g/L。發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種廉價高產(chǎn)丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基及利用該培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)丁醇的方法。
技術(shù)方案一種生產(chǎn)丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基，每升該培養(yǎng)基中含有玉米芯稀酸水解糖液總還原糖27. 5^37g,碳酸氫銨1. Γ2. 2g,硫酸亞鐵0. 2^0. 4g，碳酸鈣2. 5^3. 5g，玉米漿 0. 8^1. 2g，其余為水，pH 6. 6^6. 8。
其中，所述的玉米芯稀酸水解糖液是將玉米芯與l%1%(wt)的H2SO4按質(zhì)量比 1:4 1:6混合，在121 °C 125°C的高溫下水解12(Tl50min，冷卻后抽濾，調(diào)節(jié)pH5. 9 6. 1，然后抽濾得到水解糖液。
一種用上述發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵三步驟，其中所述厭氧發(fā)酵步驟中，5L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為2 4L，接種量為8 10%(v/v)，溫度為35 40°C，發(fā)酵罐在接種后通入純隊，以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，10 20min后停止通氣，攪拌速度在100 300 rpm，發(fā)酵時間在60 84 h。
其中，所述菌種為貝氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB8052或者其誘變菌瓶Clostridium beijerinckii IB4, ^M^M^Clostridium beijerinckii IB4 己{呆藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號CCTCC N0:M2010310。其中，所述菌種活化步驟中，將50mL的血清瓶中加入培養(yǎng)基20 30mL，所述的培養(yǎng)基為pH 6. 0 7. 0的含有淀粉或者糖類等能提供碳源、氮源以及無機鹽的液體培養(yǎng)基，通入純隊，115 121°C滅菌15 30min，冷卻后接入ImL甘油管中凍存的菌種，靜置于恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為30 40°C，活化時間為12 14h，得到活化的種子液。其中，所述種子培養(yǎng)步驟中，培養(yǎng)時將500mL血清瓶中加入培養(yǎng)基100 400mL，所述的培養(yǎng)基為pH 6. 0 7. 0的含有淀粉或者糖類等能提供碳源、氮源以及無機鹽的液體培養(yǎng)基，通入純隊，115 121°C滅菌15 30min，冷卻后接入活化的種子液，培養(yǎng)溫度為30 40°C，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為8 12h，用于發(fā)酵罐接種。有益效果本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中所用玉米芯稀酸水解液是將玉米芯與稀直接高溫水解過濾而得，水解液中含有酚類抑制劑2. 8^3. lg/L，不經(jīng)脫毒處理工藝直接用于發(fā)酵培養(yǎng)基，添加碳酸氫銨，硫酸亞鐵，碳酸鈣，玉米漿，即可得到適于發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方簡單，廉價易得，操作簡便，培養(yǎng)基成本低廉，以貝氏梭菌C/^irii/i beijerinckiiNCIMB8052在本發(fā)明的培養(yǎng)基上發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，得到的丁醇含量達到5. 8g/L，以誘變菌株Clostridium beijerinckii IB4發(fā)酵可達到9. 5g/L。本發(fā)明降低了丁醇的發(fā)酵成本，提高了碳源的利用率。該方法的最大特點是可以直接利用木質(zhì)纖維素酸解糖液進行丁醇發(fā)酵。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實施例1
將購得的玉米芯120 8與^1(Wt)的!^04600 mL混合，在125°C的高溫下水解150min，冷卻后抽濾洗滌至至相同體積，然后在80°C的水浴鍋中加入Ca (OH)2中和至pH 6.0，然后抽濾洗滌至體積為600mL，得到的濾液即為玉米芯水解糖液(總還原糖為55. 2g/L)。將水解糖液稀釋至還原糖濃度27. 5 g/L、33 g/L、37 g/L分別和不同濃度的碳酸氫銨、硫酸亞鐵、碳酸鈣，玉米漿培養(yǎng)基混合厭氧發(fā)酵，得到丁醇產(chǎn)量如下述實施例所示。實施例2
菌種貝氏梭菌 CZo1SiriiZi腫 beijerinckii NCIMB8052
種子培養(yǎng)基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸銨2g/L，NaCl 2g/L，MgSO4 3g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, pH 6. 0 ；
發(fā)酵培養(yǎng)基玉米芯稀酸水解糖液(總還原糖27. 5 g/L)，碳酸氫銨1.9 g/L，硫酸亞鐵0.25 g/L，碳酸鈣3. 1 g/L，玉米漿1 g/L，其余為水。pH 6. 6 6. 8。5L發(fā)酵罐發(fā)酵時培養(yǎng)基裝液量為3L。將凍存的甘油管中的菌種接入50mL血清瓶中30mL的種子培養(yǎng)基中，通入隊，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為35°C，活化培養(yǎng)。培養(yǎng)1 后，用無菌的移液槍將活化的菌種按5%的比例接入含有300mL種子培養(yǎng)基的500mL血清瓶中，擴大培養(yǎng)，1 后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(5L發(fā)酵罐)，接種量為10% (v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在120rpm，35°C發(fā)酵培養(yǎng)。接種后通入隊，通氣量為0. 25vvm，15min后停止通氣，關(guān)閉通氣口，保證發(fā)酵的厭氧環(huán)境。發(fā)酵時間為60h。采用FULI 9710氣相色譜儀測定溶劑含量，F(xiàn)ID檢測器，色譜柱石英毛細(xì)管柱，固定相SE-30，規(guī)格30 m χ 0.32 mm χ 1 μ m，類型交聯(lián)，最高使用溫度。柱箱溫度900C，檢測器溫度180°C，進樣器180°C，載氣為隊，流速30 mL/min,以異丁醇為內(nèi)標(biāo)物，進樣量0.4 UL0測得本實施例中的丁醇含量為5.75g/L。實施例3
菌種貝氏梭菌 CZo1SiriiZi腫 beijerinckii IB4
種子培養(yǎng)基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸銨2g/L，NaCl 2g/L，MgSO4 3g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, pH 6. 0 ；
發(fā)酵培養(yǎng)基玉米芯稀酸水解糖液(總還原糖27. 5 g/L)，碳酸氫銨1.8 g/L，硫酸亞鐵0. 30 g/L，碳酸鈣3.0 g/L，玉米漿1 g/L，其余為水。pH 6. 6 6. 8。5L發(fā)酵罐發(fā)酵時培養(yǎng)基裝液量為3L。將凍存的甘油管中的菌種接入50mL血清瓶中30mL的種子培養(yǎng)基中，通入隊，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為35°C，活化培養(yǎng)。培養(yǎng)1 后，用無菌的移液槍將活化的菌種按5%的比例接入含有300mL種子培養(yǎng)基的500mL血清瓶中，擴大培養(yǎng)，1 后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(5L發(fā)酵罐)，接種量為10% (v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在120rpm，35°C發(fā)酵培養(yǎng)。接種后通入隊，通氣量為0. 25vvm，15min后停止通氣，關(guān)閉通氣口，保證發(fā)酵的厭氧環(huán)境。發(fā)酵時間為60h。采用FULI 9710氣相色譜儀測定溶劑含量，F(xiàn)ID檢測器，色譜柱石英毛細(xì)管柱，固定相SE-30，規(guī)格30 m χ 0.32 mm χ 1 μ m，類型交聯(lián)，最高使用溫度。柱箱溫度900C，檢測器溫度180°C，進樣器180°C，載氣為隊，流速30 mL/min,以異丁醇為內(nèi)標(biāo)物，進樣量0.4 UL0測得本實施例中的丁醇含量為7.48g/L。實施例4
菌種貝氏梭菌 CZo1SiriiZi腫 beijerinckii IB4
種子培養(yǎng)基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸銨2g/L，NaCl 2g/L，MgSO4 3g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, pH 6. 0 ；
發(fā)酵培養(yǎng)基玉米芯稀酸水解糖液(總還原糖33 g/L)，碳酸氫銨1.4 g/L，硫酸亞鐵0.35 g/L，碳酸鈣2. 5 g/L，玉米漿1 g/L，其余為水。pH 6. 6 6. 8。5L發(fā)酵罐發(fā)酵時培養(yǎng)基裝液量為3L。將凍存的甘油管中的菌種接入50mL血清瓶中30mL的種子培養(yǎng)基中，通入隊，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為35°C，活化培養(yǎng)。培養(yǎng)1 后，用無菌的移液槍將活化的菌種按5%的比例接入含有300mL種子培養(yǎng)基的500mL血清瓶中，擴大培養(yǎng)，1 后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(5L發(fā)酵罐)，接種量為10% (v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在120rpm，35°C發(fā)酵培養(yǎng)。接種后通入隊，通氣量為0. 25vvm，15min后停止通氣，關(guān)閉通氣口，保證發(fā)酵的厭氧環(huán)境。發(fā)酵時間為72h。采用FULI 9710氣相色譜儀測定溶劑含量，F(xiàn)ID檢測器，色譜柱石英毛細(xì)管柱，固定相SE-30，規(guī)格30 m χ 0.32 mm χ 1 μ m，類型交聯(lián)，最高使用溫度。柱箱溫度900C，檢測器溫度180°C，進樣器180°C，載氣為隊，流速30 mL/min,以異丁醇為內(nèi)標(biāo)物，進樣量0.4 UL0測得本實施例中的丁醇含量為7.88g/L。實施例5菌種貝氏梭菌 CZo1SiriiZi腫 beijerinckii IB4
種子培養(yǎng)基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸銨2g/L，NaCl 2g/L，MgSO4 3g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, pH 6. O ；
發(fā)酵培養(yǎng)基玉米芯稀酸水解糖液(總還原糖33 8/1)，碳酸氫銨2.2 g/L，硫酸亞鐵0.25 g/L，碳酸鈣3. 5 g/L，玉米漿1 g/L，其余為水。pH 6. 6 6. 8。5L發(fā)酵罐發(fā)酵時培養(yǎng)基裝液量為3L。將凍存的甘油管中的菌種接入50mL血清瓶中30mL的種子培養(yǎng)基中，通入隊，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為35°C，活化培養(yǎng)。培養(yǎng)1 后，用無菌的移液槍將活化的菌種按5%的比例接入含有300mL種子培養(yǎng)基的500mL血清瓶中，擴大培養(yǎng)，1 后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(5L發(fā)酵罐)，接種量為10% (v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在120rpm，35°C發(fā)酵培養(yǎng)。接種后通入隊，通氣量為0. 25vvm，15min后停止通氣，關(guān)閉通氣口，保證發(fā)酵的厭氧環(huán)境。發(fā)酵時間為72h。采用FULI 9710氣相色譜儀測定溶劑含量，F(xiàn)ID檢測器，色譜柱石英毛細(xì)管柱，固定相SE-30，規(guī)格30 m χ 0.32 mm χ 1 μ m，類型交聯(lián)，最高使用溫度。柱箱溫度900C，檢測器溫度180°C，進樣器180°C，載氣為隊，流速30 mL/min,以異丁醇為內(nèi)標(biāo)物，進樣量0.4 UL0測得本實施例中的丁醇含量為7.92g/L。實施例6
菌種貝氏梭菌 CZo1SiriiZi腫 beijerinckii IB4
種子培養(yǎng)基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸銨2g/L，NaCl 2g/L，MgSO4 3g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, pH 6. 0 ；
發(fā)酵培養(yǎng)基玉米芯稀酸水解糖液(總還原糖33 g/L)，碳酸氫銨1.8 g/L，硫酸亞鐵0. 30 g/L，碳酸鈣3.0 g/L，玉米漿1 g/L，其余為水。pH 6. 6 6. 8。5L發(fā)酵罐發(fā)酵時培養(yǎng)基裝液量為3L。將凍存的甘油管中的菌種接入50mL血清瓶中30mL的種子培養(yǎng)基中，通入隊，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為35°C，活化培養(yǎng)。培養(yǎng)1 后，用無菌的移液槍將活化的菌種按5%的比例接入含有300mL種子培養(yǎng)基的500mL血清瓶中，擴大培養(yǎng)，1 后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(5L發(fā)酵罐)，接種量為10% (v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在120rpm，35°C發(fā)酵培養(yǎng)。接種后通入隊，通氣量為0. 25vvm，15min后停止通氣，關(guān)閉通氣口，保證發(fā)酵的厭氧環(huán)境。發(fā)酵時間為72h。采用FULI 9710氣相色譜儀測定溶劑含量，F(xiàn)ID檢測器，色譜柱石英毛細(xì)管柱，固定相SE-30，規(guī)格30 m χ 0.32 mm χ 1 μ m，類型交聯(lián)，最高使用溫度。柱箱溫度900C，檢測器溫度180°C，進樣器180°C，載氣為隊，流速30 mL/min,以異丁醇為內(nèi)標(biāo)物，進樣量0.4 UL0測得本實施例中的丁醇含量為8.75g/L。實施例7
菌種貝氏梭菌 CZo1SiriiZi腫 beijerinckii IB4
種子培養(yǎng)基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸銨2g/L，NaCl 2g/L，MgSO4 3g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, pH 6. 0 ；
發(fā)酵培養(yǎng)基玉米芯稀酸水解糖液(總還原糖37 g/L)，碳酸氫銨1.8 g/L，硫酸亞鐵0. 30 g/L，碳酸鈣3.0 g/L，玉米漿1 g/L，其余為水。pH 6. 6 6. 8。5L發(fā)酵罐發(fā)酵時培養(yǎng)基裝液量為3L。將凍存的甘油管中的菌種接入50mL血清瓶中30mL的種子培養(yǎng)基中，通入隊，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為35°C，活化培養(yǎng)。培養(yǎng)1 后，用無菌的移液槍將活化的菌種按5%的比例接入含有300mL種子培養(yǎng)基的500mL血清瓶中，擴大培養(yǎng)，1 后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(5L發(fā)酵罐)，接種量為10% (v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在120rpm，35°C發(fā)酵培養(yǎng)。接種后通入隊，通氣量為0. 25vvm，15min后停止通氣，關(guān)閉通氣口，保證發(fā)酵的厭氧環(huán)境。發(fā)酵時間為84h。 采用FULI 9710氣相色譜儀測定溶劑含量，F(xiàn)ID檢測器，色譜柱石英毛細(xì)管柱，固定相SE-30，規(guī)格30 m χ 0.32 mm χ 1 μ m，類型交聯(lián)，最高使用溫度。柱箱溫度900C，檢測器溫度180°C，進樣器180°C，載氣為隊，流速30 mL/min,以異丁醇為內(nèi)標(biāo)物，進樣量0.4 UL0測得本實施例中的丁醇含量為9.45g/L。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征是每升該培養(yǎng)基中含有玉米芯稀酸水解糖液總還原糖27. 5^37g,碳酸氫銨1. Γ2. 2g,硫酸亞鐵0. 2^0. 4g，碳酸鈣2. 5^3. 5g，玉米漿 0. 8^1. 2g，其余為水，pH 6. 6^6. 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的玉米芯稀酸水解糖液是將玉米芯與l°r2%(wt)的H2SO4按質(zhì)量比1:4 1:6混合，在121°C 125°C下水解120 150min， 冷卻后抽濾，Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH為5. 9^6. 1，然后抽濾得到水解糖液。
3.一種用權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵三步驟，其特征在于所述厭氧發(fā)酵步驟中，接種量為8 10% (v/v)，溫度為 35 40°C，發(fā)酵罐在接種后通入純隊，10 20min后停止通氣，攪拌速度在100 300 rpm， 發(fā)酵時間在60 84 h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于所述菌種為貝氏梭菌 Clostridium beijerinckii NCIMB8052 或者其誘變菌株C/osirii/i腫 beijerinckii IB4. CCTCC No. M2010310。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于所述菌種活化步驟中，將 50mL的血清瓶中加入培養(yǎng)基20 30mL，通入純N2,115 121°C滅菌15 30min，冷卻后接入ImL甘油管中凍存的菌種，靜置于恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為30 40°C，活化時間為 12 14h，得到活化的種子液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)步驟中，培養(yǎng)時將500mL血清瓶中加入培養(yǎng)基100 400mL，通入純N2,115 121°C滅菌15 30min， 冷卻后接入活化的種子液，培養(yǎng)溫度為30 40°C，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為8 12h，用于發(fā)酵罐接種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)酵培養(yǎng)基及用該培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征是每升該培養(yǎng)基中含有玉米芯稀酸水解糖液總還原糖27.5~37g，碳酸氫銨1.4~2.2g，硫酸亞鐵0.2~0.4g，碳酸鈣2.5~3.5g，玉米漿0.8~1.2g，其余為水。將貝氏梭菌ClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052或者其誘變菌株ClostridiumbeijerinckiiIB4經(jīng)菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵三步驟發(fā)酵產(chǎn)生丁醇，其中厭氧發(fā)酵步驟中，接種量為8～10%(v/v)，溫度為35～40℃，發(fā)酵罐在接種后通入純N2，以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌速度在100～300rpm，發(fā)酵時間在60～84h。本發(fā)明操作簡單、培養(yǎng)基成本低廉，丁醇產(chǎn)量提高，得到的丁醇6.0~9.5g/L，為木質(zhì)纖維原料的高效利用開辟了新的途徑。
文檔編號C12R1/145GK102559778SQ20121003232
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者吳昊, 姜岷, 杜騰飛, 歐陽平凱, 賀愛永, 郭亭, 韋萍 申請人:南京工業(yè)大學(xué)