2-酮-l-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域，特別涉及2-酮-L-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素C是維持機體生長和代謝所必須的一種水溶性維生素，目前廣泛應(yīng)用于醫(yī) 藥、食品、飼料和化妝品領(lǐng)域，市場穩(wěn)定。目前維生素C的主流生產(chǎn)法是二步發(fā)酵法，主要指 從D-山梨醇開始，經(jīng)過兩步發(fā)酵轉(zhuǎn)化為維生素C前體一2_酮-L-古龍酸的過程。第一步， 利用氧化葡萄糖酸桿菌將D-山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖，第二步利用生酮古龍酸桿菌及其伴 生菌（主要為芽孢桿菌）的混菌體系將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮-L-古龍酸。
[0003] 二步發(fā)酵法生產(chǎn)2-酮-L-古龍酸，需要進行兩步發(fā)酵過程，即需要兩次生產(chǎn)準備， 兩次配培養(yǎng)基，兩次滅菌，兩次接菌，兩次發(fā)酵。時間相對較長，耗能大，占據(jù)較多的設(shè)備和 人力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種2-酮-L-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法。本發(fā)明利用混合菌 株發(fā)酵，在一個反應(yīng)器內(nèi)實現(xiàn)了從D-山梨醇到2-酮-L-古龍酸的一步轉(zhuǎn)化，能夠縮短時 間，減少耗能，解放設(shè)備和人力資源。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種2-酮-L-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，以山梨醇為原料，將氧化葡 萄糖酸桿菌、生酮古龍酸桿菌及其伴生菌混合發(fā)酵培養(yǎng)，制得2-酮-L-古龍酸。
[0007] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供的一種2-酮-L-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn) 方法中，所述伴生菌為芽孢桿菌。
[0008] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供的一種2-酮-L-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn) 方法中，所述伴生菌為巨大芽孢桿菌。
[0009] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供的一種2-酮-L-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn) 方法中，包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。
[0010] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供的一種2-酮-L-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn) 方法中，所述種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括第一種子培養(yǎng)基和第二種子培養(yǎng)基；
[0011] 所述第一種子培養(yǎng)基包括：玉米漿3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素lg/L，磷 酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.2g/L，碳酸鈣lg/L，山梨醇20g/L，pH調(diào)至6.7-7.2，121°C，滅菌 20min，制成第一種子培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基另加20g/L的瓊脂粉；
[0012] 所述第二種子培養(yǎng)基包括：玉米漿3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素lg/L，磷 酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.2g/L，碳酸鈣lg/L，山梨糖20g/L，pH調(diào)至6.7-7.2，121°C，滅菌 20min，制成第二種子培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基另加20g/L的瓊脂粉。
[0013] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供的一種2-酮-L-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn) 方法中，所述種子培養(yǎng)包括如下步驟：
[0014] 步驟1:將活化好的氧化葡萄糖酸桿菌接種于所述第一種子培養(yǎng)基中，經(jīng)第一培 養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接所述第一種子培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)，制成第一種子液；
[0015] 步驟2 :將活化好的生酮古龍酸桿菌及其伴生菌接種于所述第一種子培養(yǎng)基中， 經(jīng)第二培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接所述第二種子培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)，制成第二種子液。
[0016] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供的一種2-酮-L-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn) 方法中，步驟1中所述第一培養(yǎng)為于30°C，200r/min培養(yǎng)24小時；
[0017] 步驟1中所述擴大培養(yǎng)為于30°C，200r/min培養(yǎng)24小時；
[0018] 步驟2中所述第二培養(yǎng)為于30°C，200r/min培養(yǎng)20小時；
[0019] 步驟2中所述擴大培養(yǎng)為于30°C，200r/min培養(yǎng)12小時。
[0020] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供的一種2-酮-L-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn) 方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)為將所述第一種子液和第二種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)， 制得2-酮-L-古龍酸。
[0021] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供的一種2-酮-L-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn) 方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括玉米漿l〇g/L，尿素12g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0. 2g/L， 碳酸鈣lg/L，山梨醇80g/L，加消泡劑lml，pH調(diào)至6. 7-7. 0,121°C，滅菌20min，制成發(fā)酵培 養(yǎng)基。
[0022] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供的一種2-酮-L-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn) 方法中，所述第一種子液中活菌數(shù)為3. 60X101()~3. 6X10 11;以所述發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量為 基準，所述第一種子液的接種量為10% ;
[0023] 所述第二種子液中活菌數(shù)為6. 20XIO113~6. 2X10 n;以所述發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量為 基準，所述第二種子液的接種量為5%;
[0024] 所述發(fā)酵培養(yǎng)為于30°C，500r/min，pH控制7. 0,用2. 5mol硫酸和5mol氫氧化鈉 調(diào)節(jié)pH，通氣1. 5vvm。
[0025] 具體的，本發(fā)明利用氧化葡萄糖酸桿菌將D-山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖，生酮古龍酸 桿菌及其伴生菌（主要為芽孢桿菌）的混菌體系將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮-L-古龍酸的能 力。創(chuàng)造性的將三種菌混合培養(yǎng)發(fā)酵實現(xiàn)D-山梨醇到2-酮-L-古龍酸的一步轉(zhuǎn)化過程。 并通過基因改造菌株獲得較高的產(chǎn)量。
[0026](1)種子培養(yǎng)：
[0027] 玉米漿3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素lg/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂 0? 2g/L，碳酸鈣lg/L，山梨醇20g/L，pH調(diào)至6. 7-7. 2，121°C，滅菌20min，制成種子培養(yǎng)基 1。 固體培養(yǎng)基另加20g/L的瓊脂粉。
[0028] 玉米漿3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素lg/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂 0? 2g/L，碳酸鈣lg/L，山梨糖20g/L，pH調(diào)至6. 7-7. 2，121°C，滅菌20min，制成種子培養(yǎng)基 2。 固體培養(yǎng)基另加20g/L的瓊脂粉。
[0029] 將在固體平板上活化好的氧化葡萄糖酸桿菌接種于培養(yǎng)基1中，30°C，200r/min 培養(yǎng)24小時，轉(zhuǎn)接擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)基1，30°C，200r/min培養(yǎng)24小時，制成種子液1。
[0030] 將固體平板上活化好的生酮古龍酸桿菌及其伴生菌一巨大芽孢桿菌接種于培養(yǎng) 基1中，30°C，200r/min培養(yǎng)20小時，轉(zhuǎn)接擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)基2, 30°C，200r/min培養(yǎng)12小 時，制成種子液2。
[0031] (2)發(fā)酵：
[0032] 玉米漿10g/L，尿素12g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0. 2g/L，碳酸鈣lg/L，山梨醇 40-80g/L，加消泡劑lml，pH調(diào)至6. 7-7. 0,121°C，滅菌20min，制成發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0033] 種子液1接種10 %，種子液2接種1-5 %。發(fā)酵參數(shù)控制：30°C，500r/min，pH控 制7. 0,用2. 5mol硫酸和5mol氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，通氣1. 0-1. 5vvm。
[0034] (3)產(chǎn)物檢測：
[0035] 菌濃度測定：
[0036] 使用75-6型紫外分光光度計測定培養(yǎng)過程中三菌總的生長曲線，波長采用 600nm，即 0D600〇
[0037] 底物及產(chǎn)物測定：
[0038] 高效液相色譜檢測，AminexHPX-87H色譜柱，示差檢測器。0. 5mM硫酸作流動相， 柱溫65°C，檢測器溫度50°C。
[0039] 本發(fā)明利用混合菌株發(fā)酵，在一個反應(yīng)器內(nèi)實現(xiàn)了從D-山梨醇到2-酮-L-古龍 酸的一步轉(zhuǎn)化，能夠縮短時間，減少耗能，解放設(shè)備和人力資源。相比于二步生產(chǎn)法，是一種 新的2-酮-L-古龍酸發(fā)酵生產(chǎn)方法。
[0040] (1)建立了三混合發(fā)酵體系，并能有效的獲得最終產(chǎn)物
[0041] (2)三菌一步發(fā)酵獲得維生素C前體2-酮-L-古龍酸的新工藝流程。
[0042] 減少了生產(chǎn)步驟，相對縮短了時間。減少了由于滅菌和發(fā)酵過程的能耗，提過了設(shè) 備和人力資源利用率，有效的減少了整體成本。
【附圖說明】
[0043] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0044] 圖1示實施例1中標準品的測定結(jié)果；
[0045] 圖2示實施例1中最終產(chǎn)物的測定結(jié)果；
[0046] 圖3示實施例1中最終產(chǎn)物的測定結(jié)果；其中，圖3 (A)示菌體濃度；圖3 (B)示三 種菌發(fā)酵底物的變化；
[0047] 圖4示實施例2中標準品的測定結(jié)果；
[0048] 圖5示實施例2中最終產(chǎn)物的測定結(jié)果；
[0049] 圖6示實施例2中最終產(chǎn)物的測定結(jié)果；其中，圖6 (A)示菌體濃度；圖6 (B)示三 種菌發(fā)酵底物的變化；
[0050] 圖7示實施例3中標準品的測定結(jié)果；
[0051] 圖8示實施例3中最終產(chǎn)物的測定結(jié)果；
[0052] 圖9示實施例3中最終產(chǎn)物的測定結(jié)果；其中，圖9(A)示菌體濃度；圖9(B)示三 種菌發(fā)酵底物的變化。
【具體實施方式】
[0053] 本發(fā)明公開了一種2-酮-L-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本 文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù) 人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳 實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方 法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0054] 本發(fā)明提供的2-酮-L-古龍酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法中所用菌株、原料及試劑均可由市 場購得。
[0055] 下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0056] 實施例1
[0057] (1)種子培養(yǎng)：
[0058] 玉米漿3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素lg/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂 0? 2g/L，碳酸鈣lg/L，山梨醇20g/L，pH調(diào)至6. 7-7. 2，121°C，滅菌20min，制成種子培養(yǎng)基 1。 固體培養(yǎng)基另加20g/L的瓊脂粉。
[0059] 玉米漿3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素lg/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂 0? 2g/L，碳酸鈣lg/L，山梨糖20g/L，pH調(diào)至6. 7-7. 2，121°C，滅菌20min，制成種子培養(yǎng)基 2。固體培養(yǎng)基另加20g/L的瓊脂粉。
[0060] 將在固體平板上活化好的氧化葡萄糖酸桿菌接種于培養(yǎng)基1中，30°C，200r/min 培養(yǎng)24小時，轉(zhuǎn)接擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)基1，30°C，200r/min培養(yǎng)24小時，制成種子液1。種子液 1 中活菌數(shù)為 3. 60X101(]~3. 6X10 n。
[0061] 將固體平板上活化好的生酮古龍酸桿菌及其伴生菌一巨大芽孢桿菌接種于培養(yǎng) 基1中，30°C，200r/min培養(yǎng)20小時，轉(zhuǎn)接擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)基2, 30°C，200r/min培養(yǎng)12小 時，制成種子液2。種子液2中活菌數(shù)為6.20X101(]~6.2X10 11。（2)發(fā)酵：
[0062] 玉米漿10g/L，尿素12g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0. 2g/L，碳酸鈣lg/L，山梨醇 80g/L，加消泡劑lml，pH調(diào)至6. 7-7. 0,121°C，滅菌20min，制成發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0063] 種子液1接種10 %，種子液2接種5 %。發(fā)酵參數(shù)控制：30°C，500r/min，pH控制 7. 0,用2. 5mol硫酸和5mol氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，通氣1. 5vvm。
[0064](3)產(chǎn)物檢測：
[0065] 菌體濃度測定：
[0066] 使用75-6型紫外分光光度計測定培養(yǎng)過程中三菌總的生長曲線，波長采用 600nm，即 0D600〇
[0067] 底物及產(chǎn)物測定：
[0068] 高效液相色譜檢測，AminexHPX-87H色譜柱，示差檢測器。0. 5mM硫酸作流動相， 柱溫65°C，檢測器溫度50°C。
[0069] 標準品測定如圖1所示：
[0070] 保留時間7. 80min山梨醇。