專利名稱：治療肌肉和心血管病癥的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在肌肉和心血管病癥中涉及的新的小RNA(microRNA)、mir-208-2。 本發(fā)明還涉及寡核苷酸治療劑(反義寡核苷酸和/或雙鏈寡核苷酸)及其在治療由 mir-208-2失調(diào)導(dǎo)致的肌肉和心血管病癥中的用途。
背景技術(shù)：
小RNA(miRNA)是一類非編碼的RNA基因，其終產(chǎn)物是約22nt的功能性RNA分子。 它們是從內(nèi)源編碼的不完全發(fā)夾前體加工而成的單鏈RNA。它們似乎通過(guò)對(duì)靶標(biāo)mRNA的 3’-非翻譯區(qū)(UTR)堿基配對(duì)經(jīng)由翻譯抑制而起作用(Griffith-Jones等人,2006、Nucleic Acids Research,卷 34、D140-D144)。小RNA(miRNA)的生物生成是個(gè)復(fù)雜、多步驟的過(guò)程。由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄物大小范圍在幾百至幾千個(gè)核苷酸長(zhǎng)度(pri-miRNA)。MiRNA可以追溯為兩種基因組來(lái)源。一些miRNA位于蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)。其它的位于非編碼RNA 的內(nèi)含子或外顯子之中。有趣的是，pri-miRNA能夠編碼單個(gè)miRNA，也可以含有成簇的多個(gè)miRNA。其后,通過(guò)核內(nèi)核糖核酸酶III (RNaseIII)內(nèi)切核酸酶Drosha將pri-miRNA加工為 70nt發(fā)夾(pre-miRNA)。然后通過(guò)Exporin5/RanGTP將pre-miRNA從核內(nèi)運(yùn)輸出來(lái)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，第二 RNaselll，Dicer，連同其dsRBD蛋白質(zhì)配偶體一起切割 pre-miRNA的發(fā)夾的莖區(qū)域，由此釋放 21核苷酸的RNA-雙螺旋。miRNA雙螺旋的一條鏈進(jìn)入抑制靶基因表達(dá)的蛋白質(zhì)復(fù)合體，即，RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，而另一鏈被降解。鏈的選擇依賴于該miRNA雙螺旋的局部熱力學(xué)穩(wěn)定性。其5’末端較不穩(wěn)定配對(duì)的鏈被載入RISC復(fù)合體。載入RISC復(fù)合體的miRNA似乎通過(guò)堿基配對(duì)于靶標(biāo)mRNA的3’-非翻譯區(qū)(UTR)經(jīng)由翻譯抑制起作用。Du、T. Zamore>P. D.等人micro-Primer the biogenesis and function of microRNA. Development (2005) 132、4645_4652。目前在miRBase (http:// microrna. sanger. ac. uk)保藏了 462條人miRNA序列，且看來(lái)這一目錄將達(dá)到800。迄今為止，大量miRNA的鑒定表明，它們可能在調(diào)節(jié)和精細(xì)調(diào)節(jié)生物過(guò)程中起到復(fù)雜的作用。事實(shí)上，已經(jīng)有幾種miRNA牽涉到細(xì)胞增殖控制(mir-125b和let_7)、造血B-細(xì)胞譜系命運(yùn) (mir-181)、B_細(xì)胞存活(mir_15a和mir-16-l)、腦模式發(fā)育(mir_430)、胰細(xì)胞胰島素分泌 (mir-357)、脂肪細(xì)胞發(fā)育(mir_375)和肌肉增殖和分化(miR-1和miR-133)。許多miRNA 位于涉及癌癥的基因組區(qū)。例如，在大多數(shù)B-細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病中含有mir-16-l 和 mir-15 的族缺失或下調(diào)(B-CLL ;Calin、G.A.,等人。MicroRNA-cancer connection The beginning of a new tale. Cancer Res. (2006)66、7390_7394)。對(duì)于可能由失調(diào)的microRNA引起的疾病或病癥，一直存在著尚未滿足的對(duì)其進(jìn)行有效治療的需要。本發(fā)明提供滿足這一需要并賦予其它益處的化合物。本發(fā)明的化合物是能夠特異性靶向和治療失調(diào)的小RNA的核酸。一類是反義DNA或RNA ;另一類是雙鏈 RNA(dsRNA)，其也包括稱為短干擾RNA(siRNA)的類型。siRNA是新型的治療劑，其已經(jīng)顯示可以以一種稱為RNA干擾(RNAi)的高度保守的調(diào)節(jié)機(jī)制阻斷基因表達(dá)。W099/32619(Fire 等人)公開(kāi)了使用長(zhǎng)度至少為25個(gè)核苷酸的dsRNA在秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans)中抑制基因表達(dá)。已經(jīng)表明，siRNA可以在其它生物體中降解靶標(biāo)RNA，包括植物(見(jiàn)，例如， WO 99/53050, Waterhouse 等人；和 WO 99/61631, Heifetz 等人)，果妮(Drosophila)(見(jiàn)， 例如，Yang, D.等人，Curr. Biol. (2000) 10 :1191_1200)，和哺乳動(dòng)物(見(jiàn) WO 00/44895、 LimmerjPDE 101 00 586. 5,Kreutzer等人)。這一天然機(jī)制現(xiàn)在已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)用于治療由異常或不需要的基因調(diào)節(jié)引起的病癥的新型治療劑的焦點(diǎn)。盡管在RNAi領(lǐng)域的顯著進(jìn)展，仍然需要各種類型的、能夠治療由新的分子病理學(xué)，例如失調(diào)的小RNA引起的疾病的藥劑。發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)鑒定到滿足以上需要的新的miRNA,mir-208-2。因此,本發(fā)明涉及少于500個(gè)核苷酸的分尚的核酸分子,其特征在于所述分尚的核酸分子包含mir-208-2 (SEQ ID NO 7) ο在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，對(duì)于靶向pri-miRNA，包含mir-208-2 (SEQ ID NO:
7)的該分離的核酸分子長(zhǎng)度少于200個(gè)核苷酸。在另一實(shí)施方案中，例如，對(duì)于革巴向 pre-miRNA，包含mir-208-2 (SEQ ID NO 7)的該分離的核酸分子長(zhǎng)度少于80個(gè)核苷酸。本發(fā)明的特定實(shí)施方案是選自由SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3和SEQ ID N0:4組成的組，或由SEQ ID NO 7組成的組的分離的核酸分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將立即意識(shí)到，本發(fā)明的范圍也包括由少于500個(gè)核苷酸的核酸序列組成的分離的核酸分子，所述核酸序列與上述之一互補(bǔ)。例如，由SEQ ID NO :8組成的分離的核酸。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是長(zhǎng)度在8和50個(gè)核苷酸之間的分離的核酸分子，所述分子能夠在生理?xiàng)l件下，例如，在細(xì)胞內(nèi)(細(xì)胞質(zhì)或核)，或在模擬這類條件的條件下，雜交于上述分離的核酸分子，由此抑制mir-208-2 (SEQ ID NO 7)的功能，例如mir-208-2對(duì)其靶標(biāo)的結(jié)合。這類分子的具體的實(shí)例是選自由SEQ ID N0:10至SEQ ID NO :77組成的組的分離的核酸分子。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯而易見(jiàn)的是上述分離的核酸分子能夠帶有一個(gè)或多個(gè)化學(xué)修飾，例如，選自aW帽子、bW帽子、c)修飾的核苷間鍵，或d)修飾的糖或堿基部分。包含上述核酸和至少一個(gè)載體增殖序列的核酸載體也是本發(fā)明的實(shí)施方案。本發(fā)明還涉及包含上述核酸和至少一個(gè)載體增殖序列的核酸載體。本發(fā)明的分離的核酸分子，或本發(fā)明的核酸載體可以在例如基于液體或聚合物的治療遞送體系中做為藥物使用。本發(fā)明的這類藥物可以在患有肌肉病癥的受試者中用于治療肌肉病癥。這類肌肉病癥的一個(gè)具體的實(shí)施方案是心血管病癥。因此，本發(fā)明的藥物用于在受試者中治療心血管病癥，或用于制備治療肌肉病癥或心血管病癥的藥物。本發(fā)明還包括用于診斷心血管病癥或確定其治療策略的試劑盒。典型的，所述試劑盒包含核酸試劑，該核酸試劑含有RNA、DNA、混合的RNA或DNA形式的本發(fā)明核酸分子， 和任選地任何化學(xué)修飾。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子也可以用于任何其它的目的，諸如，實(shí)驗(yàn)的目的。因此，本發(fā)明也包括減少或增加mir-208-2表達(dá)的任何方法，其中例如在細(xì)胞內(nèi)使用根據(jù)本發(fā)明的分離的核酸分子。相似的，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子也可以用作診斷探針或用作實(shí)驗(yàn)探針。本發(fā)明人還認(rèn)識(shí)到兩個(gè)其它的miRNA,mir-208和mir-499,的表達(dá)與mir-208-2的表達(dá)密切關(guān)聯(lián)。因此，本發(fā)明也涉及特征在于包含mir-208 (SEQ ID NO 6)的少于500個(gè)核苷酸的分離核酸分子、和/或特征在于包含mir-499 (SEQ ID NO 9)的少于500個(gè)核苷酸的分離核酸分子、和/或包含mir-208 (SEQ ID NO 6)或mir-499 (SEQ ID NO 9)的互補(bǔ)序列的少于500個(gè)核苷酸的分離核酸分子，用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療肌肉病癥或心血管病癥、或用于診斷肌肉病癥或心血管病癥。附圖簡(jiǎn)述圖I.含有人mir-208的MYH6內(nèi)含子與含有mir-208-2的斑馬魚(yú)、人、黑猩猩、狗和大鼠的MYH7內(nèi)含子的比對(duì)。圖2.在從不同發(fā)育階段的小鼠心臟分離的RNA中對(duì)MYH6、MYH7和18S的RT-PCR。圖3.在從不同發(fā)育階段的小鼠心臟分離的RNA中用northern印跡法分析 mir-208、mir-208-2、mir-499 和 mir-206。使用 U6 snRNA 作為加樣對(duì)照。第 11-14 道對(duì)應(yīng)于50pg合成的miRNA。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及與肌肉和心血管病癥有關(guān)的新的microRNA, mir-208-2的發(fā)現(xiàn)。也涉及寡核苷酸治療劑(反義DNA/RNA和/或雙鏈RNA)及其用于治療肌肉和心血管病癥的用途，所述病癥是由于mir-208-2的失調(diào)而產(chǎn)生的。Mir-208-2是位于MYH7基因的內(nèi)含子30 中的基因。MYH7(基因庫(kù)登錄號(hào)NM_000257 :在14號(hào)染色體)。MYH7是由球形頭部(含有肌動(dòng)蛋白和ATP結(jié)合位點(diǎn))繼之以桿狀的尾序列組成的運(yùn)動(dòng)收縮蛋白，是構(gòu)建粗肌絲的結(jié)構(gòu)單元之一。每個(gè)肌球蛋白絲含有兩個(gè)重鏈和四個(gè)輕鏈。心肌收縮的速率由肌球蛋白分子頭部區(qū)域中三磷酸腺苷酶(ATPase)活性的程度控制。肌球蛋白三磷酸腺苷酶活性的主要決定因素和，因此肌肉收縮的速度，取決于兩個(gè)肌球蛋白重鏈同種型，MYH 6和MYH 7的相對(duì)的量。呈現(xiàn)高三磷酸腺苷酶活性的MYH6同種型，具有超過(guò)MYH7約四倍的酶活性。在人心臟中MYH6和MYH7以不同量表達(dá)。在衰竭的人心臟中，MYH6 mRNA和蛋白質(zhì)水平被下調(diào)而MYH7被上調(diào)。Mir-208-2的轉(zhuǎn)錄與MYH7轉(zhuǎn)錄緊密相連，因?yàn)槠錄](méi)有獨(dú)立的啟動(dòng)子。因此僅當(dāng)產(chǎn)生MYH7的轉(zhuǎn)錄物時(shí)，其才被轉(zhuǎn)錄。據(jù)信當(dāng)加工pre-mRNA和移出內(nèi)含子時(shí)，mir-208-2小 RNA從MYH7轉(zhuǎn)錄物釋放。然后內(nèi)含子30的殘留內(nèi)含子序列經(jīng)過(guò)進(jìn)一步加工而產(chǎn)生全長(zhǎng)的 mir-208-2οMir-208-2在脊椎動(dòng)物中是高度保守的，圖I顯示在多個(gè)物種之間mir-208-2的比對(duì)。與mir-208 (位于MYH6的內(nèi)含子28中的不同小RNA)的相似性也被圖示。由本發(fā)明人鑒定的Mir-208-2基因具有下列序列(包括側(cè)翼區(qū)實(shí)際的 mir-208-2序列以粗體和下劃線表示)智人(Homo sapiens)51 -SEQ ID NO 1
CCCCACCTCCTTCTCCTCTCAGGGAAGCTTTTTGCTCGAATTATGTTTCTGATCCGAATATAAGACGAACAAAAGGTTTGTCTGAGGG~3/黑猩猩(Pantroglodytes)5' -SEQ ID NO 2CCCCACCTCCTTCTCCTCTCAGGGAAGCTTTTTGCTCGAATTATGTTTCTGATCCGAATATAAGACGAACAAAAGGTTTGTCTGAGGG-3'家犬(Canis familiar is)5' -SEQ ID NO 3CCCCAGCTCCTTCTCCTCTCAGGGAAGCTTTTTGCTCGCGTTATGTTTCTCATCCGAATATAAGACGAACAAAAGGTTTGTCTGAGGG-3'褐家鼠(Rattus norvegicus)5' -SEQ ID NO 4CCCCACCTCCTGCTCCTCTCAGGGAAGCTTTTTGCTCGCGTTATGTTTCTCATCCGAATATAAGACGAACAAAAGGTTTGTCTGAGGG-3'斑馬魚(yú)(Daniorerio)5' -GTAAGACGAACAAAAAGTTTTT-3' SEQ ID NO 5為了序列比較，還提供先前已知的來(lái)自MYH6內(nèi)含子28的mir-208智人mir-2085' -ATAAGACGAGCAAAAAGCTTGT-3' SEQ ID NO 6

圖1圖示在脊椎動(dòng)物物種之間mir-208-2的顯著保守性。從這一比對(duì)，可以鑒別 這一小RNA的最高保守的部分，推斷其為如下的功能性引導(dǎo)和反引導(dǎo)序列引導(dǎo)序列(mir-208-2):5' -ATAAGACGAACAAAAGGTTTGT-3' (SEQ IDN0 7)反引導(dǎo)序列5'-ACAAACCTTTTGTTCGTCTTAT-3' (SEQ ID NO 8)與MYH6和MYH7不同，MYH7B(基因庫(kù)登錄號(hào)NM_020884 :在20號(hào)染色體)較少被 表征?；谄渑cMYH7的高度同源性，MYH7B被歸類為慢MYH同種型。至今，在文獻(xiàn)中沒(méi)有對(duì) MYH7B功能的清楚描述。此外，沒(méi)有疾病聯(lián)系被歸因于MYH7B功能障礙。有趣的是，與MYH6 和MYH7相似，MYH7B在其內(nèi)含子之一中也還含有miRNA即mir-499。智人mir-4995' -TTAAGACTTGCAGTGATGTTTAA-3' SEQ ID NO 9以下包括的生物信息學(xué)分析和實(shí)施例表明新型小RNA mir-208-2參與調(diào)節(jié)與心肌 肥大有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。因此，這一小RNA的一個(gè)重要用途是作為治療可能與之有關(guān)的 病癥和疾病的靶標(biāo)。本發(fā)明人在這里公開(kāi)了具有治療用途的多個(gè)方法和組合物。概括而言，認(rèn)為在一 些情況下減少靶標(biāo)小RNA的水平可以提供治療益處?？梢酝ㄟ^(guò)使用反義核酸分子，例如直 接結(jié)合于靶標(biāo)miRNA，例如mir-208-2的反義DNA，容易地實(shí)現(xiàn)此減少。在其它情況下，靶標(biāo) microRNA,例如mir-208-2水平的增長(zhǎng)將提供有益效果?？梢酝ㄟ^(guò)使用有義核酸分子和一 些dsRNA分子，例如一些siRNA (其結(jié)合于miRNA的靶標(biāo)因此與所述miRNA協(xié)同作用)，容易 的獲得這類增長(zhǎng)。本發(fā)明因此涉及兩種類型的治療劑。在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中使用下列定義。“分離的核酸分子”意指該物質(zhì)從其最初環(huán)境(例如，如果其是天然存在的，則自然 的環(huán)境)中移出。例如，在活的動(dòng)物中存在的天然存在的多核苷酸不是分離的，但是從該天然系統(tǒng)中的一些或全部共存在的物質(zhì)中分出的相同的多核苷酸或多肽是分離的，即使接下來(lái)被重新導(dǎo)入該天然系統(tǒng)。這類多核苷酸可以是載體的一部分和/或這類多核苷酸可以是組合物的一部分，且因?yàn)檫@類載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分，故仍然是分離的?！昂怂彷d體”是設(shè)計(jì)在暴露于細(xì)胞環(huán)境，例如細(xì)胞裂解物或全細(xì)胞時(shí)被增殖和/或轉(zhuǎn)錄的核酸序列?！盎蛑委熭d體”指如下核酸載體，其還帶有用于轉(zhuǎn)染進(jìn)入全細(xì)胞的功能方面，意在用于增加一個(gè)或多個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)。在每個(gè)情況下，這類載體通常含有“載體增殖序列”，其通常是被細(xì)胞識(shí)別的復(fù)制起點(diǎn)以允許在細(xì)胞內(nèi)增殖載體。大量的核酸載體和基因治療載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。如這里所使用，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”和“預(yù)防有效量”指在治療、預(yù)防或控制由 mir-208-2失調(diào)介導(dǎo)的病理過(guò)程中提供治療益處的量。治療有效的該特定量可以通過(guò)普通的醫(yī)師容易的確定，并可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的因素，諸如，病理過(guò)程的類型、患者的病史和年齡、病理過(guò)程的階段和與其它物質(zhì)的組合施用，而改變。如這里所使用，“藥物組合物”包含藥理學(xué)有效量的本發(fā)明治療劑和藥物可接受的載體。如這里所使用，“藥理學(xué)有效量”、“治療有效量”或簡(jiǎn)單地“有效量”指有效產(chǎn)生預(yù)期的藥理學(xué)、治療或預(yù)防效果的量。例如，如果當(dāng)與疾病或病癥有關(guān)的可測(cè)量參數(shù)降低至少 25%時(shí)一個(gè)給定的臨床治療被認(rèn)為有效，則對(duì)于治療該疾病或病癥而言藥物的治療有效量是實(shí)現(xiàn)所述參數(shù)的至少25%降低所需的量。術(shù)語(yǔ)“藥物可接受的載體”指用于施用治療劑的載體。這類載體包括，但不限于，鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。該術(shù)語(yǔ)尤其排除細(xì)胞培養(yǎng)基。對(duì)于口服施用的藥物，藥物可接受的載體包括，但不限于藥物可接受的賦形劑，例如惰性稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑。合適的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和磷酸鈣、和乳糖，而玉米淀粉和海藻酸是合適的崩解劑。粘合劑可以包括淀粉和明膠，而潤(rùn)滑劑，如果存在的話，通常是硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。如果期望的話，片劑可以用例如單硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯的材料包被，以延遲在胃腸道中的吸收。如這里所使用，表述“肌肉病癥”包括，但不限于，心臟病理。這一表述涉及任何類型的變性肌肉病癥，其原發(fā)病理可以是喪失橫紋肌肌肉和/或功能。這將包括，但不限于， 肌肉營(yíng)養(yǎng)不良、創(chuàng)傷和重癥肌無(wú)力。如這里所使用，“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”是已導(dǎo)入了可表達(dá)dsRNA分子的載體的細(xì)胞。包含外源提供的核酸，例如本發(fā)明物質(zhì)，的細(xì)胞，無(wú)論是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的，也被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄物由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄并且其長(zhǎng)度大小范圍可以從幾百至幾千個(gè)核苷酸(pri-miRNA)。pri-miRNA可以編碼單個(gè)的miRNA但是也可以含有數(shù)個(gè)miRNA的簇。接著，由核內(nèi)的核糖核酸酶III (RNaseIII)核酸內(nèi)切酶，Drosha，加工該pri-miRNA為 70nt的發(fā)夾(pre-miRNA)。因此，取決于預(yù)期的靶標(biāo)，本發(fā)明的分離的核酸分子將具有各種優(yōu)選的長(zhǎng)度。當(dāng)靶向pri-miRNA時(shí)，可以使用約500個(gè)核苷酸，例如，499、450、400、350、300、 250個(gè)核苷酸的優(yōu)選的長(zhǎng)度。當(dāng)靶向pre-miRNA時(shí)，優(yōu)選的長(zhǎng)度為100至200個(gè)核苷酸，例如100、120、150、180或200個(gè)核苷酸。在細(xì)胞質(zhì)中，第二 RNase III，Dicer，與其dsRBD蛋白質(zhì)配偶體一起，切割pre-miRNA的發(fā)夾的莖區(qū)域，由此釋放 21個(gè)核苷酸的RNA-雙螺旋。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中也考慮例如長(zhǎng)度為80、70、60、50、40、30、25、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9或8個(gè)核苷酸的分離的多核苷酸。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將mir-208-2的抑制劑注射入斑馬魚(yú)(Dario rerio)的受精卵導(dǎo)致心臟功能(血液循環(huán)、心臟搏動(dòng)等)的顯著下降。因此，可以用這一測(cè)定法或相似的測(cè)定法來(lái)評(píng)估“mir-208-2 (SEQ ID NO 7)的功能”。評(píng)估“mir-208-2 (SEQ ID NO 7)的功能” 的另一可能方案是mir-208-2與其靶標(biāo)的相互作用，例如與其的結(jié)合。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，可以使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、和重組DNA中的許多常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)是眾所周知的，并闡述在，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology, 卷 I, II,和 III, 1997 (F. M. Ausubel 編輯)；Sambrook 等人，1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor,N. Y. ；DNA Cloning A Practical Approach,卷 I 和 II, 1985(D. N. Glover編輯)；01igonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait 編輯)；NucleicAcid Hybridization, 1985, (Hames 和 Higgins) !Transcription andTranslation,1984(Hames 和 Higgins 編輯)；Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney 編輯)；Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press) ；Perbal,1984, A Practical Guide to Molecular Cloning ；Methods inEnzymology 系列(Academic Press, Inc. ) ；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells, 1987(J. H. Miller和M. P. Calos編輯，Cold SpringHarbor Laboratory) jPMethods in Enzymology 卷 154 和卷 155 (分別由 Wu 和 Grossman,和 Wu 編輯)。治療劑(治療物質(zhì))本發(fā)明的某些治療劑在這里被描述為用于增加或減少細(xì)胞中mir-208-2活性的、 包含mir-208-2的反引導(dǎo)和引導(dǎo)序列的siRNA。本發(fā)明的其它治療劑是用于減少細(xì)胞中 mir-208-2活性的反義DNA或RNA組合物。dsRNA 治療根據(jù)本發(fā)明的siRNA分子介導(dǎo)RNA干擾("RNAi")。術(shù)語(yǔ)"RNAi"是本領(lǐng)域眾所周知的，通常理解為意指由具有互補(bǔ)于靶標(biāo)基因的區(qū)域的siRNA抑制細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)基因。測(cè)試dsRNA介導(dǎo)RNAi的能力的多種測(cè)定法是本領(lǐng)域公知的(見(jiàn)，例如Elbashir 等人，Methods 26 (2002)、199-213)。根據(jù)本發(fā)明的dsRNA對(duì)基因表達(dá)的影響通常導(dǎo)致，相對(duì)于未用根據(jù)本發(fā)明的RNA分子處理的細(xì)胞而言，靶標(biāo)基因的表達(dá)被抑制至少10%、33%、 50%、90%、95%或99%。根據(jù)本發(fā)明的"siRNA"或"小干擾核糖核酸"具有本領(lǐng)域公知的意義，包括下列方面。siRNA由兩條核糖核苷酸鏈組成，其在生理?xiàng)l件下沿著互補(bǔ)區(qū)雜交。 這些鏈通常是分開(kāi)的。因?yàn)閮蓷l鏈在細(xì)胞中具有不同的功能，一條鏈被稱為“反義”鏈，也稱為“引導(dǎo)”序列，用于作用于RISC復(fù)合體來(lái)弓I導(dǎo)其至正確的mRNA進(jìn)行切割。因?yàn)樯婕癛NA 化合物，“反義”的這一使用與在本說(shuō)明書(shū)其它處提及的反義DNA化合物不同。另一鏈被稱為“反引導(dǎo)”序列并因?yàn)槠浜信c靶標(biāo)序列相同的核苷酸序列，稱為有義鏈。在某些實(shí)施方案中可以由分子接頭將這些鏈連接在一起。核糖核苷酸個(gè)體可以是未修飾的天然存在的核糖核苷酸、未修飾的天然存在的脫氧核糖核苷酸或者它們可以是化學(xué)修飾的或合成的(如在本文其它處所述的)。在本說(shuō)明書(shū)中使用的dsRNA包含兩個(gè)基本的類型。有如上所述的siRNA。再有，當(dāng)兩條鏈?zhǔn)且粋€(gè)更大分子的一部分，并由此兩條鏈在一條鏈的3’-末端和另一鏈的5’末端之間通過(guò)連續(xù)的核苷酸鏈連接而形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)，該連接的RNA鏈被稱為“發(fā)夾環(huán)”、“短發(fā)夾RNA”或“shRNA”。shRNA通常從核酸載體轉(zhuǎn)錄并在目的靶標(biāo)細(xì)胞中表達(dá)。如權(quán)利要求中定義的，本發(fā)明的核酸分子可以是包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO: 8并靶向與mir-208-2相同的細(xì)胞mRNA和/或mir-208-2本身的任何dsRNA。引導(dǎo)序列5' -ATAAGACGAACAAAAGGTTTGT-3' (SEQ ID NO : 7)反引導(dǎo)序列5' -ACAAACCTTTTGTTCGTCTTAT-3' (SEQ ID NO 8)本發(fā)明核酸分子包含基本上與靶標(biāo)基因的mRNA的區(qū)域相同的區(qū)域。與靶標(biāo)基因的對(duì)應(yīng)序列有100%同一性的區(qū)域是合適的。這一情況稱為“完全互補(bǔ)”。然而，考慮到 miRNA及其作用機(jī)制的特性，取決于待靶向的mRNA的區(qū)域的長(zhǎng)度，與靶標(biāo)基因的對(duì)應(yīng)區(qū)域相比，本發(fā)明核酸分子的該區(qū)域也可以含有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)或更多的錯(cuò)配，并由此可以是不完全互補(bǔ)的。然而，最重要的特征是所述分子能夠在生理?xiàng)l件下，例如在細(xì)胞中，特異性的結(jié)合mir-208-2，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA分子特異性靶向一個(gè)給定的基因。為了僅靶向所期望的mRNA，siRNA試劑可以與靶標(biāo)mRNA具有100%同源性，并與細(xì)胞或生物體中的全部其它基因有至少2個(gè)錯(cuò)配核苷酸。分析和鑒定具有足夠序列同一性以能夠有效抑制特定靶標(biāo)序列表達(dá)的siRNA的方法是本技術(shù)領(lǐng)域公知的，例如在WO 2005/059132中所述方法?？梢酝ㄟ^(guò)本技術(shù)領(lǐng)域中公知的序列比較和比對(duì)算法(見(jiàn)Gribskov和Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991,和其中引用的參考文獻(xiàn))，并通過(guò)例如BESTFIT軟件程序中執(zhí)行的Smith-Waterman算法使用默認(rèn)參數(shù)(例如，University of WisconsinGenetic Computing Group)計(jì)算核苷酸序列之間的百分比差異，從而優(yōu)化序列同一I"生。根據(jù)本發(fā)明，與靶標(biāo)互補(bǔ)的siRNA區(qū)域的長(zhǎng)度可以是10-100個(gè)核苷酸、12-25個(gè)核苷酸、14-22個(gè)核苷酸或15、16、17或18個(gè)核苷酸。在與對(duì)應(yīng)靶標(biāo)區(qū)域有錯(cuò)配的情況，互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度通常需要稍微更長(zhǎng)一些。因?yàn)閟iRNA可以帶有突出的末端(其可以與靶標(biāo)互補(bǔ)或不互補(bǔ))、或與其本身而非革巴標(biāo)基因互補(bǔ)的額外的核苷酸，故siRNA的每個(gè)鏈的總長(zhǎng)度可以是10-100個(gè)核苷酸、15-49 個(gè)核苷酸、17-30個(gè)核苷酸或19-25個(gè)核苷酸。短語(yǔ)“每條鏈?zhǔn)?9個(gè)核苷酸或更少”意指在該鏈中的連續(xù)核苷酸的總數(shù)，包括全部修飾的或未修飾的核苷酸，但不包括可以被加入該鏈的3’或5’末端的任何化學(xué)部分。插入該鏈的短的化學(xué)部分不被計(jì)算在內(nèi)，設(shè)計(jì)連接兩個(gè)分開(kāi)鏈的化學(xué)接頭不被認(rèn)為產(chǎn)生連續(xù)的核苷酸。術(shù)語(yǔ)“在5’末端或3’末端的至少一個(gè)上的1-6個(gè)核苷酸突出”指在生理?xiàng)l件下由兩個(gè)分開(kāi)的鏈形成的互補(bǔ)siRNA的結(jié)構(gòu)。如果末端核苷酸是siRNA雙鏈區(qū)的一部分,認(rèn)為該siRNA為平末端。如果在末端的一個(gè)或多個(gè)核苷酸是不配對(duì)的，則產(chǎn)生突出端。通過(guò)突出核苷酸的數(shù)目測(cè)量突出端長(zhǎng)度。突出核苷酸可以在任一鏈的5’末端或3’末端。根據(jù)本發(fā)明的SiRNA表現(xiàn)高體內(nèi)穩(wěn)定性，并可以通過(guò)在至少一條鏈中包括至少一個(gè)修飾的核苷酸而特別適合口服遞送。因此，根據(jù)本發(fā)明的siRNA可以含有至少一個(gè)修飾的或非天然的核糖核苷酸。許多已知的化學(xué)修飾的詳細(xì)描述在公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng) WO 200370918中給出和在這里不再贅述。對(duì)于遞送而言合適的修飾包括選自aW帽子、 bW帽子、c)修飾的核苷間鍵；或d)修飾的糖或堿基部分的化學(xué)修飾。合適的修飾包括，但不限于對(duì)糖部分的修飾(即，糖部分的2’位置，諸如，2' -0-(2-甲氧基乙基)或 2' -Μ0Ε) (Martin 等人，HeIv. Chim. Acta，1995，78，486-504)， 即，烷氧基烷氧基基團(tuán))或?qū)A基部分的修飾(即非天然的或修飾的堿基，其保留與另一核苷酸鏈中的另一特定堿基配對(duì)的能力)。其它的修飾包括所謂的“骨架”修飾，包括，但不限于，替換磷酸酯基團(tuán)(用例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯連接相鄰的核糖核苷酸)。本文有時(shí)稱為3’帽子或5’帽子的末端修飾可以是有意義的。帽子可以由簡(jiǎn)單加入的額外核苷酸，例如“τ-τ”(其已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)能賦予SiRNA穩(wěn)定性)組成。帽子可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的更復(fù)雜化學(xué)。在一個(gè)實(shí)施方案中，3 ’帽子是經(jīng)由3 ’碳綴合于3 ’末端的化學(xué)部分，其選自式I的化合物
R13*O-P-R1 ' ' [式 I]
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X其中X 是 O 或 SRl和1 2獨(dú)立地是0!1、順2、5!1、烷基、芳基、烷基-芳基、芳基-烷基，其中烷基、芳基、烷基-芳基、芳基-烷基可以被另外的雜原子和官能團(tuán)取代，優(yōu)選的，雜原子選自Ν、0或 S，或官能團(tuán)選自0H、NH2、SH、羧酸或酯；或Rl和R2可以是式Y(jié)-Z，其中Y是0、N、S，Z是H、烷基、芳基、烷基-芳基、芳基-烷基，其中烷基、芳基、烷基-芳基、芳基-烷基可以被另外的雜原子取代，優(yōu)選雜原子選自N、 O或S。在糖部分的修飾的實(shí)例包括2,烷氧基核糖核苷酸、2'烷氧基烷氧基核糖核苷酸、鎖式核酸核糖核苷酸(LNA)、2'-氟代核糖核苷酸、嗎啉代核苷酸。也可以修飾核苷間鍵。核苷間鍵的實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和酰胺鍵。Rl 可以是 0H。Rl和R2 一起可以包括1-24個(gè)C-原子、1-12個(gè)C原子、2-10個(gè)C原子、1-8或2-6 個(gè)C原子。在另一實(shí)施方案中，Rl和R2獨(dú)立地是0H、低級(jí)烷基、低級(jí)芳基、低級(jí)烷基-芳基、低級(jí)芳基-烷基，其中低級(jí)烷基、低級(jí)芳基、低級(jí)烷基-芳基、低級(jí)芳基-烷基可以被如上定義的另外的雜原子和官能團(tuán)取代。在另一實(shí)施方案中，Rl和R2不都是0H。術(shù)語(yǔ)“低級(jí)”與有機(jī)基團(tuán)或化合物連用時(shí)意指化合物或基團(tuán)可以是分支的或不分支的，具有不超過(guò)且包括7個(gè)碳原子，優(yōu)選1-4個(gè)碳原子。低級(jí)烷基代表，例如，甲基、乙基、 正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和分支的戊基、正己基和分支的己基。燒氧基的實(shí)例包括0_Met、O-Eth> 0-prop> 0_but、0-pent、0_hex。合成siRNA，包括含有至少一個(gè)修飾的或非天然的核糖核苷酸的siRNA，的方法是眾所周知的，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易的獲得。例如，多種合成化學(xué)法在公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng)W02005021749和W0200370918中有描述，通過(guò)參考將兩文獻(xiàn)并入此處。反應(yīng)可以在溶液、或優(yōu)選的在固相進(jìn)行，或通過(guò)使用聚合物支持的試劑來(lái)進(jìn)行，接著在可以形成能介導(dǎo) RNAi的siRNA分子的條件下混合合成的RNA鏈。本發(fā)明也包括含有至少一個(gè)修飾的核苷酸的siRNA，所述SiRNA適于口服遞送。在功能性術(shù)語(yǔ)中，這意指當(dāng)口服施用時(shí)，SiRNA具有合適的藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布來(lái)實(shí)現(xiàn)遞送至關(guān)心的靶標(biāo)組織。特別地，這需要血清穩(wěn)定性、缺乏免疫反應(yīng)、和藥物樣行為?？梢曰谠诒疚钠渌幑_(kāi)的標(biāo)準(zhǔn)胃酸試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)血清試驗(yàn)預(yù)期siRNA的這些特征中的多種。盡管特定治療劑的設(shè)計(jì)可以采取多種形式，但某些功能性特征可以將優(yōu)選的 dsRNA與其它dsRNA區(qū)分開(kāi)來(lái)。具體的，可以測(cè)試特征例如良好的血清穩(wěn)定性、高效力、缺少誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答、和良好的藥物樣行為(全部可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)量)，以鑒定本發(fā)明的優(yōu)選的dsRNA。在一些情況下，這些功能方面并不是全部都存在于優(yōu)選的dsRNA中。 但是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員能夠優(yōu)化這些變量和其它變量以選擇本發(fā)明的優(yōu)選的化合物。可以使用任何方法來(lái)施用本發(fā)明的dsRNA于含有失調(diào)mir-208-2的哺乳動(dòng)物。例如，施用可以是局部的(例如，陰道的、經(jīng)皮的等等)；口服的；或胃腸外的(例如，通過(guò)皮下、心室內(nèi)、肌肉內(nèi)、或腹膜內(nèi)注射、或通過(guò)靜脈滴注)。施用可以是快速的(例如，通過(guò)注射)、或可以在一段時(shí)間發(fā)生(例如，通過(guò)緩慢輸注或施用緩釋制劑)。例如，可以將用或不用脂質(zhì)體配制的dsRNA直接局部應(yīng)用于目的組織。為了局部施用，可以將dsRNA分子配制成組合物，例如無(wú)菌的和非無(wú)菌的、水溶液、在常用溶劑， 例如乙醇中的非水性溶液、或在液態(tài)或固態(tài)油基質(zhì)中的溶液。這類溶液也可以含有緩沖劑、稀釋劑、和其它合適的添加劑。局部施用的組合物可以配制為透皮貼劑、軟膏、洗劑、霜?jiǎng)?、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體、和粉末?？梢允褂帽炯夹g(shù)領(lǐng)域公知的聚合物和促透劑 (pemeabiIizer)來(lái)配制凝膠和霜?jiǎng)?。?duì)于胃腸外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)的施用，可以將dsRNA分子配制成組合物，例如無(wú)菌的水溶液，其還可以含有緩沖劑、稀釋劑和其它合適的添加劑(例如，通透增強(qiáng)劑、載體化合物和其它藥物可接受的載體)。此外，可以使用非病毒方法，例如生物或非生物的手段，如在例如美國(guó)專利 6，271，359中所述，將dsRNA分子施用于哺乳動(dòng)物。非生物遞送可以通過(guò)多種方法完成，包括，不限于，(I)在脂質(zhì)體上裝截本文提供的dsRNA核酸分子；(2)使dsRNA分子與脂質(zhì)或脂質(zhì)體復(fù)合以形成核酸-脂質(zhì)或核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物；或(3)提供基于聚合物的治療遞送系統(tǒng)。這些技術(shù)是本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的。簡(jiǎn)述如下。脂質(zhì)體可以由通常用于體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞的陽(yáng)離子脂質(zhì)和中性脂質(zhì)組成。陽(yáng)離子脂質(zhì)可以與帶負(fù)電荷的核酸復(fù)合(例如，電荷結(jié)合)來(lái)形成脂質(zhì)體。陽(yáng)離子脂質(zhì)體的實(shí)例包括，不限于，lipofectin、lipofectamine、Iipofectace和D0TAP。形成脂質(zhì)體的操作是本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的?？梢岳鐝牧字Ｄ憠A、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酰甘油或二油酰基磷脂酰乙醇胺形成脂質(zhì)體組合物。眾多親脂物質(zhì)是可商購(gòu)的，包括 Lipofectin. RTM. (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif.) 和Effectene. TM. (Qiagen, Valencia, Calif·)。此外，可以使用可商購(gòu)的陽(yáng)離子脂質(zhì)，例如DDAB或DOTAP來(lái)優(yōu)化全身遞送方法，所述陽(yáng)離子脂質(zhì)均可以與中性脂質(zhì)，例如DOPE或膽固醇混合。在一些情況下，可以使用例如由Templeton等人(Nature Biotechnology, 15 647-652 (1997))所述的脂質(zhì)體。在其它實(shí)施方案中，可以使用多聚陽(yáng)離子，例如聚乙烯亞胺執(zhí)行體內(nèi)和離體的遞送(Boletta等人，J. Am Soc. Nephrol. 7 :1728 (1996))。關(guān)于使用脂質(zhì)體遞送核酸的另外的信息可以在美國(guó)專利6，271，359、PCT公開(kāi)WO 96/40964和Morrissey， D.等人 2005. NatBiotechnol. 23(8) :1002-7 中找到。10/24 頁(yè)可以通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)生物遞送，包括，但不限于，病毒載體的使用。例如，可以使用病毒載體(例如，腺病毒和皰疹病毒載體)來(lái)遞送shRNA分子于皮膚細(xì)胞和宮頸細(xì)胞?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物技術(shù)將本文提供的一個(gè)或多個(gè)shRNA導(dǎo)入先前開(kāi)發(fā)的許多不同病毒載體之一來(lái)遞送核酸至細(xì)胞?？梢允褂糜纱水a(chǎn)生的病毒載體通過(guò)例如感染將一個(gè)或多個(gè) dsRNA遞送至細(xì)胞。可以在藥物可接受的載體或稀釋劑中配制本發(fā)明的dsRNA。“藥物可接受的載體”(這里也稱為“賦形劑”)是藥物可接受的溶劑、懸浮劑、或任何其它藥理學(xué)惰性載體。 藥物可接受的載體可以是液體或固體，并可以依據(jù)計(jì)劃的施用方式選擇從而提供期望的大小、稠度和其它有關(guān)的運(yùn)輸和化學(xué)特性。典型的藥物可接受的載體包括例如，但不限于水； 鹽水溶液；粘合劑(例如，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖和其它糖類、明膠或硫酸鈣)；潤(rùn)滑劑(例如，淀粉、聚乙二醇或乙酸鈉)；崩解劑(例如，淀粉或淀粉乙醇酸鈉)；和濕潤(rùn)劑(例如，十二烷基硫酸鈉)。此外，可以將本發(fā)明的dsRNA配制成含有該dsRNA的組合物，其中該dsRNA與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或核酸混合物混合、被之包囊化、與之綴合、或以另外方式結(jié)合。例如，含有本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)dsRNA物質(zhì)的組合物也可以與在治療相似病癥中使用的其它治療劑組合?？梢栽诩?xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中利用標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法，例如，用于確定LD50(致死群體的50%的劑量)和ED50 (對(duì)群體的50%具有療效的劑量)的方法，來(lái)確定這類化合物的毒性和治療功效。在毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)，其可以表達(dá)為L(zhǎng)D50/ED50 比。優(yōu)選呈現(xiàn)高治療指數(shù)的化合物?？梢允褂脧募?xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)配制人用劑量范圍。本發(fā)明組合物的劑量通常在如下循環(huán)濃度范圍內(nèi)，所述范圍包括ED50且?guī)缀鯖](méi)有或完全沒(méi)有毒性。由使用的藥物劑型和施用途徑?jīng)Q定，劑量可以在此范圍內(nèi)變動(dòng)。對(duì)于本發(fā)明方法中使用的任何化合物，可以最初從細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)估計(jì)治療有效劑量?？梢栽趧?dòng)物模型中配制劑量以獲得該化合物或，如果合適的話，靶標(biāo)序列的多肽產(chǎn)物的如下循環(huán)血漿濃度范圍(例如，獲得降低濃度的多肽)，所述范圍包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中確定的IC50(即，獲得癥狀的半最大抑制的測(cè)試化合物濃度)?？梢允褂眠@類信息更精確的確定在人中有用的劑量?？梢岳缤ㄟ^(guò)高效液相色譜法測(cè)量在血漿中的水平。無(wú)論如何，給藥的醫(yī)師都能夠根據(jù)在本領(lǐng)域已知的或本文描述的標(biāo)準(zhǔn)功效測(cè)量法中觀察到的結(jié)果，調(diào)整dsRNA的施用量和施用時(shí)間。反義DNA治療劑可以設(shè)計(jì)本發(fā)明的反義寡核苷酸(這里有時(shí)稱為“反義分子”)以靶向mir-208-2 和減少其轉(zhuǎn)錄物的水平。同樣地，該反義分子可以靶向這一 mir-208-2的任何部分以在細(xì)胞中減少其水平。反義化合物通常被用作研究試劑和診斷劑，多年來(lái)一直是治療研究的對(duì)象。反義寡核苷酸能夠以精細(xì)的特異性抑制基因表達(dá)，常被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用于闡明特定基因的功能。也可以使用反義化合物，例如以區(qū)別生物途徑的多個(gè)成員的功能。反義分子的特異性和靈敏性也被本領(lǐng)域技術(shù)人員用于治療用途。已經(jīng)應(yīng)用反義寡核苷酸作為治療動(dòng)物和人的疾病狀態(tài)的治療部分。反義寡核苷酸已經(jīng)安全和有效的施用于人，并且目前正在進(jìn)行多個(gè)臨床試驗(yàn)。由此確立了寡核苷酸可以是有用的治療形式，可以對(duì)
12其進(jìn)行配置以用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物、特別是人的治療方案中。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“反義”指脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的寡聚體或多聚體。這一術(shù)語(yǔ)包括由天然存在的核苷堿基、糖和共價(jià)核苷間(骨架)鍵組成的寡核苷酸以及以相似方式行使功能的具有非天然部分的寡核苷酸。這類修飾的或取代的反義分子通常由于期望的性質(zhì)，例如，增加的細(xì)胞攝取、提高的核酸靶標(biāo)親和性和在核酸酶存在下增加的穩(wěn)定性，而比天然形式更為優(yōu)選。盡管反義寡核苷酸是反義化合物的優(yōu)選的形式，但本發(fā)明也考慮其它的寡聚反義化合物，包括但不限于例如如下所述的寡核苷酸模擬物。根據(jù)本發(fā)明的反義化合物優(yōu)選包含約8至約30個(gè)核苷堿基(nucIeobase)。特別優(yōu)選的是包含約8至約30個(gè)核苷堿基(即， 約8至約30個(gè)連結(jié)的核苷)的反義寡核苷酸。如在本技術(shù)領(lǐng)域公知的，核苷是堿基-糖的組合。核苷的堿基部分通常是雜環(huán)堿基。這類雜環(huán)堿基的兩個(gè)最普遍的類型是嘌呤和嘧啶。 核苷酸是還包括共價(jià)連接于核苷的糖部分上的磷酸基團(tuán)的核苷。對(duì)于包括呋喃戊糖的那些核苷，磷酸基團(tuán)可以連接于糖的2'、3'或5'羥基部分。在形成寡核苷酸時(shí)，磷酸基團(tuán)使相鄰核苷彼此共價(jià)連接以形成線性聚合化合物。該線性聚合結(jié)構(gòu)的相應(yīng)末端又可以進(jìn)一步連接以形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，然而，一般優(yōu)選開(kāi)放的線性結(jié)構(gòu)。在寡核苷酸結(jié)構(gòu)內(nèi)，磷酸基團(tuán)通常參與形成寡核苷酸的核苷間骨架。DNA的正常連接或骨架是3'到5'磷酸二酯連接。在本發(fā)明中有用的優(yōu)選反義化合物的特定實(shí)例包括含有修飾的骨架或非天然核苷間鍵的寡核苷酸。如在本說(shuō)明書(shū)中定義的，具有修飾的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中不具有磷原子的那些。出于本說(shuō)明書(shū)的目的，和如有時(shí)在本技術(shù)領(lǐng)域所提及的，在核苷間骨架中沒(méi)有磷原子的修飾的寡核苷酸也可以被認(rèn)為是寡核苷。優(yōu)選的修飾的寡核苷酸骨架包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3’ -亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯(phosphinate)、磷酰胺酯(phosphoramidate)(包括3’ -氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯)、硫逐磷酰胺酯、硫逐烷基膦酸酯、硫逐烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯(boranophosphate)(這些具有普通3’ -5’連接)、它們的2' -5*連接的類似物和具有反轉(zhuǎn)的極性的那些(其中相鄰對(duì)的核苷單位是3' -5'至5' -3'或2' -5"至 5' -2'連接)。還包括多種鹽、混合的鹽和游離酸形式。用于合成含有具有上述修飾的骨架或非天然核苷間鍵的寡核苷酸的反義化合物的技術(shù)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并可以使用常規(guī)方法學(xué)實(shí)現(xiàn)。教導(dǎo)上述含磷鍵的制備的代表性美國(guó)專利包括，但不限于，美國(guó)專利號(hào)3，687，808 ;4，469，863和5，625050 ;每一均以其整體被并入此處作為參考。其中不包括磷原子的優(yōu)選的修飾的寡核苷酸骨架，可以具有這樣的骨架，其由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子的或雜環(huán)的核苷間鍵形成。這些包括具有嗎啉代鍵(部分地從核苷的糖部分形成) 的骨架；娃氧燒骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；formacetyl和thioformacetyl骨架；亞甲基formacetyl和thioformacetyl骨架；含有鏈烯的骨架；氨基磺酸酯(sulfamate)骨架； 亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其它具有混合的N、
O、S和CH2組成部分的骨架。可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)方法，例如，在美國(guó)專利號(hào) 5，034，506 ;5，166，315或5，677，439所述，完成這類寡核苷酸的合成，所述專利各自以其整體被并入作為參考。在其它優(yōu)選的寡核苷酸模擬物中，由新的基團(tuán)代替糖和核苷間鍵兩者，即核苷酸單元的骨架。保持堿基單位以便與合適的核酸靶標(biāo)化合物雜交。已經(jīng)被證實(shí)具有優(yōu)秀的雜交特性的一個(gè)這樣的寡聚化合物，寡核苷酸模擬物，被稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架由含有酰胺的骨架，特別是氨基乙基甘氨酸骨架所代替。核苷堿基被保留并直接或間接結(jié)合于骨架的酰胺部分的氮雜氮原子上。教導(dǎo)制備PNA化合物的代表性美國(guó)專利包括，但不限于，美國(guó)專利號(hào)5，539，082 ;5，714，331 ;和5，719，262，其各自以其整體被并入作為參考。PNA化合物的另外的教導(dǎo)可以在Nielsen等人，Science，1991，254， 1497-1500 中發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案是如在美國(guó)專利號(hào)5，034，506中所述的具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。還優(yōu)選具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和具有雜原子骨架的寡核苷， 所述雜原子骨架尤其是如在美國(guó)專利號(hào)5，489，677中所述的-CH2-NH-0-CH2-、-CH2_N(CH3 )-0-CH2-[稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI 骨架]、-CH2-0-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N( CH3) -CH2-和-O-N (CH3) -CH2-CH2-[其中天然磷酸二酯骨架表示為-0-P-0-CH2-]，和如在美國(guó)專利號(hào)5，602，240中所述的酰胺骨架。修飾的寡核苷酸也可以含有一個(gè)或多個(gè)取代的糖部分。優(yōu)選的寡核苷酸在2’位置包含下列之一 0H ；F ;0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-鏈烯基；0-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、鏈烯基和炔基可以是取代或未取代的Cl至ClO烷基或C2至ClO 鏈烯基和炔基。特別優(yōu)選的是 0[(CH2)n 0]m CH3、0(CH2)n 0CH3、0(CH2)n NH2、0(CH2) nCH3、0(CH2)n 0NH2 和 0(CH2)n 0N[(CH2)n CH3) ] 2，其中 n 和 m 是 I 到約 10。其它優(yōu)選的寡核苷酸在2’位置包含下列之一 C1至ClO低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烷芳基、芳烷基、 O-烷芳基或 O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、0CF3、S0CH3、S02 CH3、0N02、N02、 N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、多聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團(tuán)、報(bào)道基團(tuán)、嵌入劑、用于改善寡核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)、或用于改善寡核苷酸的藥效學(xué)特性的基團(tuán)、和具有相似特性的其它取代基。優(yōu)選的修飾包括2,-甲氧基乙氧基 (2' -0-CH2 CH20CH3，也稱為 2' _0_ (2-甲氧基乙基)或 2' -Μ0Ε) (Martin 等人，HeIv. Chim. Acta，1995，78，486-504) S卩，烷氧基烷氧基。再一優(yōu)選的修飾包括2' -二甲基氨基氧基乙氧基，即，0(CH2)2 0N(CH3)2基團(tuán)，也稱為W -DMA0E。此類的其它優(yōu)選的修飾是如在 Rajwanshi 等人，Angew. Chem. Iht 編輯 2000，39，1656-1659 所述統(tǒng)稱為 LNA (鎖式核酸) 的二環(huán)類修飾。其它優(yōu)選的修飾包括2'-甲氧基(2' -0-CH3)、2'-氨基丙氧基(2' -0CH2CH2 CH2NH2)和2'-氟(2' -F)。還可以在寡核苷酸的其它位置上進(jìn)行相似的修飾，特別是 3’末端核苷酸上或在2’ -5'連接的寡核苷酸中的糖的3’位置，和5'末端核苷酸的5' 位置。寡核苷酸還可以具有糖模擬物，例如代替呋喃戊糖的環(huán)丁基部分。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用常規(guī)方法產(chǎn)生這類修飾的糖結(jié)構(gòu)。教導(dǎo)制備這類修飾的糖結(jié)構(gòu)的代表性美國(guó)專利包括，但不限于，美國(guó)專利號(hào)4，981,957 ;5，118,800和5，700，920，其各自以其整體被并入作為參考。反義寡核苷酸還可以包括核苷堿基(在本技術(shù)領(lǐng)域通常簡(jiǎn)稱為“堿基”)修飾或取代。如這里所使用，“未修飾的”或“天然的”核苷堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤㈧和鳥(niǎo)嘌呤(G)、和嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核苷堿基包括其它的合成和天然的核苷堿基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫脲嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、 5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-氮雜(azo)尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫脲嘧啶，8-鹵代、8-氨基、8-巰基、8-硫代烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤，5-鹵代特別是5-溴代、5-三氟甲基和其它的5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和7-脫氮腺嘌呤和3-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。更多的核苷堿基包括在美國(guó)專利號(hào)3，687，808中公開(kāi)的那些，在 The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering,pages 858-859, Kroschwitz, J. I.編輯 John Wiley & Sons, 1990 中公開(kāi)的那些，由 Englisch 等人，Angewandte Chemie, InternationalEdition, 1991, 30,613 公開(kāi)的那些，和由 Sanghvi, Y. S. , Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke,
S.T.和Lebleu，B.編輯，CRC Press，1993公開(kāi)的那些。這些核苷堿基中的一些對(duì)于增加本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和力是特別有用的。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已經(jīng)表明，5-甲基胞嘧啶取代增加核酸雙螺旋穩(wěn)定性O(shè). 6-1. 2攝氏度(Sanghvi，Y. S.、 Crooke,S. T.和Lebleu,B.編輯,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton, 1993,pp. 276-278)，是目前優(yōu)選的堿基取代，尤其是當(dāng)與2' -O-甲氧基乙基糖修飾組合時(shí)甚至更為優(yōu)選。根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠制備修飾的核苷堿基。例如，教導(dǎo)制備某些上述修飾的核苷堿基以及其它修飾的核苷堿基的代表性的美國(guó)專利，包括，但不限于，以上提到的美國(guó)專利號(hào)3，687，808，以及美國(guó)專利4，845，205 ;5，130，302和 5，134，066，其各自以其整體被并入作為參考。本發(fā)明的寡核苷酸的另一修飾涉及化學(xué)連接于寡核苷酸的一個(gè)或多個(gè)部分或綴合物，其增強(qiáng)寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取。這樣的部分包括，但不限于，脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分(Letsinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989,86,6553-6556)、膽酸(Manoharan 等人，Bioorg. Med. Chem. Let. , 1994,4,1053-1060)、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醚(Manoharan 等人，Ann. N. Y. Acad. Sci.，1992,660, 306-309 ；Manoharan 等人， Bioorg. Med. Chem. Let. , 1993, 3, 2765-2770)、硫代膽固酉享(Oberhauser 等人,Nucl. Acids Res. , 1992, 20, 533-538)、脂肪鏈，例如，十二燒二醇或十一燒基殘基(Saison-Behmoaras 等人，EMBO J.，1991，10，1111-1118 ;Kabanov 等人，F(xiàn)EBS Lett.，1990，259，327-330 ; Svinarchuk等人，Biochimie, 1993, 75,49-54)、磷脂，例如，雙十六燒基-外消旋-甘油(di-hexadecyl-rac-glycerol)或 I, 2_ 二 _0_ 雙十六燒基-外消旋-甘油-3_Η_ 膦酸三乙銨(Manoharan 等人，Tetrahedron Lett. , 1995, 36, 3651-3654 ;Shea 等人，Nucl. Acids Res. , 1990,18, 3777-3783)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan 等人，Nucleosides & Nucleotides, 1995，14，969-973)或金剛燒乙酸(Manoharan 等人，Tetrahedron Lett., 1995，36，3651-3654)、棕櫚基部分(Mishra 等人，Biochim. Biophys. Acta, 1995，1264， 229-237)、或十八燒基胺或己基氨基-羰基-氧基膽固醇部分(Crooke等人,J. Pharmacol. Exp. Ther.，1996，277，923-937)。教導(dǎo)這類寡核苷酸綴合物的制備的代表性美國(guó)專利包括， 但不限于，美國(guó)專利號(hào)4，828，979 ;4，948，882和5，688，941，其各自以其整體被并入作為參考。不需要在給定化合物中的全部位置均一的修飾，實(shí)際上可以在寡核苷酸內(nèi)單個(gè)化合物中或甚至在的單個(gè)核苷上摻入一種以上的上述修飾。本發(fā)明還包括反義化合物，其為嵌合的化合物。在本發(fā)明下，“嵌合的”反義化合物或“嵌合體”是這樣的反義化合物(特別是寡核苷酸)，其含有兩個(gè)或更多個(gè)化學(xué)不同區(qū)域，每一個(gè)區(qū)域均由至少一種單體單元 (即，在寡核苷酸化合物的情況下核苷酸)組成。這些寡核苷酸通常含有至少一個(gè)如下區(qū)域，其中該寡核苷酸被修飾從而賦予該寡核苷酸對(duì)核酶降解的增加抗性、增加的細(xì)胞攝取、 和/或?qū)Π袠?biāo)核酸增加的結(jié)合親和力。寡核苷酸的另外區(qū)域可以充當(dāng)能夠切割RNA:DNA或 RNA = RNA雜合體的酶的底物。例如，RNase H是細(xì)胞內(nèi)切核酸酶，其切割RNA = DNA雙螺旋的 RNA鏈。因此，RNase H的活化導(dǎo)致RNA靶標(biāo)的切割，由此大大增加寡核苷酸對(duì)基因表達(dá)的抑制效率。所以，與雜交于相同靶標(biāo)區(qū)域的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸相比，當(dāng)使用嵌合的寡核苷酸時(shí)，用更短的寡核苷酸經(jīng)常可以獲得可比的效果?？梢砸匀缟纤龅膬蓚€(gè)或更多寡核苷酸、修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模擬物的復(fù)合結(jié)構(gòu)形式，形成本發(fā)明的嵌合反義化合物。這樣的化合物在本領(lǐng)域中也稱作雜合體或gapmer。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)常規(guī)方法制備這些雜合體結(jié)構(gòu)。教導(dǎo)這類雜合體結(jié)構(gòu)的制備的代表性美國(guó)專利包括，但不限于，美國(guó)專利號(hào)5，013，830 ;5，149，797和 5，700, 922，其各自以其整體被并入作為參考?？梢酝ㄟ^(guò)眾所周知的固相合成技術(shù)方便和常規(guī)的制備根據(jù)本發(fā)明使用的反義化合物。這類合成儀器由多家售賣，例如，應(yīng)用生物系統(tǒng)(FosterCity、Calif.)?？梢粤硗獾幕騻溥x的使用在本技術(shù)領(lǐng)域公知的用于這類合成的任何其它手段。使用相似技術(shù)制備寡核苷酸，例如硫代膦酸酯和烷基化衍生物是眾所周知的。此外，技術(shù)人員將立即理解，本發(fā)明的反義分子不必須靶向mir-208-2本身，而也可以祀向包含 mir-208-2 的 mRNA,例如 pri-miRNA 或 pre-miRNA。表I給出下調(diào)mir-208-2的優(yōu)選的反義序列。可以將這里公開(kāi)的任何化學(xué)修飾應(yīng)用于這些序列。表I
權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其包含第一鏈，其中，該第一鏈的序列為SEQIDNO :9的序列、相應(yīng)于SEQ ID NO 9的RNA序列、或與SEQ ID NO 9完全互補(bǔ)的序列。
2.權(quán)利要求I的分尚的核酸分子，其中所述分尚的核酸分子還包括與第一鏈完全互補(bǔ)的第二鏈。
3.包含第一鏈和第二鏈的分離的核酸分子，其中第一鏈和第二鏈各自長(zhǎng)度不超過(guò)大約 50個(gè)核苷酸，且第一鏈的序列包含SEQ ID NO :9的序列或相應(yīng)于SEQ ID NO :9的RNA序列； 且其中第二鏈的序列包含與SEQ IDNO 9完全互補(bǔ)的序列。
4.權(quán)利要求I或3的分離核酸分子，其是反義寡脫氧核苷酸(ASO)或雙鏈寡核糖核苷酸(dsRNA)，可選地包括一個(gè)或多個(gè)化學(xué)修飾，所述修飾選自a) 3'帽子；b)5'帽子、c)修飾的核苷間鍵；和d)修飾的糖或堿基部分。
5.核酸載體，其包含或編碼權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的分離核酸分子、還包含至少一個(gè)載體增殖序列。
6.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-4之任一項(xiàng)的分離的核酸分子和藥物可接受的載體。
7.組合物，其包含權(quán)利要求1-4之任一項(xiàng)的分離核酸分子和基于脂質(zhì)或聚合物的治療遞送體系。
8.藥物組合物,其包含根據(jù)權(quán)利要求5的核酸載體和藥物可接受的載體。
9.細(xì)胞,其包含權(quán)利要求5的核酸載體。
10.權(quán)利要求1-4之任一項(xiàng)的分離的核酸分子的用途，其用于制備治療肌肉病癥或心血管病癥的藥物。
11.用于診斷心血管病癥或確定心血管病癥的治療策略的試劑盒，其包含含有權(quán)利要求I或3的分尚核酸分子的核酸試劑,所述分尚核酸分子任選地還包括一個(gè)或多個(gè)化學(xué)修飾，所述修飾選自a)3'帽子；b)5'帽子、c)修飾的核苷間鍵；和d)修飾的糖或堿基部分。
12.在細(xì)胞中減少或增加mir-499的表達(dá)的方法，包括向細(xì)胞施用包含根據(jù)權(quán)利要求 1-4之任一項(xiàng)的分離的核酸分子的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型小RNA，mir-499。本發(fā)明也涉及寡核苷酸治療劑(反義寡核苷酸和/或雙鏈寡核苷酸，例如dsRNA)及其在治療肌肉和心血管疾患中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102604951SQ201210049950
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2007年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月14日
發(fā)明者C·施內(nèi)爾, F·塞盧卡, I·伯文克, J·哈爾, J·魏勒, M·申克-布勞恩, M·米勒 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司