專利名稱：V5抗原表位融合性酵母表達載體及構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因生物工程領域，具體涉及一種V5抗原表位融合性酵母表達載體及構建方法。
背景技術：
酵母是最常用的基因生物工程宿主細胞，這是酵母是單細胞低等真核生物細胞， 不僅具有易培養(yǎng)、繁殖、生長條件要求不高等特點外，而且具有遺傳背景清楚、基因結構、基因調(diào)控、代謝和蛋白質(zhì)翻譯后加工與哺乳動物細胞相似等特點。所以，用酵母細胞表達外源性基因具有良好的發(fā)展應用前景。驗證外源性基因在酵母中是否表達，通常是選用外源性基因表達產(chǎn)物的特異性抗體或通過測試外源性基因表達產(chǎn)物的功能來實現(xiàn)。但外源性基因種類很多，許多無特異性商品化抗體，即是有特異性抗體也較昂貴；通過外源性基因表達產(chǎn)物的生物功能進行驗證更加復雜，因為對外源性基因表達產(chǎn)物的生物功能有時難以建立方法進行驗證，即是建立了方法也較復雜，特別是難驗證某些新發(fā)現(xiàn)基因在酵母細胞中的表達更加困難。V5抗原是來自副黏液病毒猿猴病毒5的P和V蛋白的抗原表位，多由14個氨基酸(GlyLysProIlePr oAsnProLeuLeuGlyLeuAspSer Thr)組成。V5抗原表位抗體為一種通用性抗體，目前已經(jīng)商品化。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決目前驗證外源性基因在酵母細胞中的表達的困難，本發(fā)明提供了一種V5 抗原表位融合性酵母表達載體，可以有效地解決外源性在酵母細胞表達的驗證問題。本發(fā)明采用的技術方案是1)以hvitrogen公司的pYestrp2載體為基本框架，通過PCR方法從酵母基因組擴增酵母強啟動子GPD，并經(jīng)Swa I和BamH I兩酶切位點，將其插入到pYestrp2載體中，構建成GPD驅(qū)動的酵母表達載體，命名為pGPD ；2)人工合成兩條V5抗原表位DNA單鏈，并分別在各單鏈的5 ‘端增加BamHI和 EcoR I黏性末端(小寫所示)。為了能使V5抗原表位DNA能與下游基因相融合，同時在合成時，分別在正鏈的3'和反鏈5'端分別增設一個G和C (如下方框所示)，使V5抗原表位 DNA通過柔性短肽Gly (甘氨酸)-Ile (異亮氨酸)-即GGA-ATT-與下游基因相融合。人工合成的V5抗原表位(Vkpitope)DNA 正鏈為5 ‘ -gatccATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACA § g_3 ‘；反鏈為5' -aattc ■ TGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCCATg-3 ‘；3)將所合成的V5抗原表位DNA用退火緩沖配成5umol/L，等體積混合，常規(guī)退火形雙股，將插入到PGPD的相應酶切位點，構建成可與V5抗原表位相融合的酵母表達載體 PGPDV5。


圖1本發(fā)明V5抗原表位融合性酵母表達載體示意圖。圖2為本發(fā)明的技術路線示意圖。圖3與V5融合的TR蛋白在酵母細胞中的表達。圖4AR在酵母細胞中的表達。圖5V5抗原表位融合性AR的功能驗證原理。其中各泳道為V5融合性TR在不同克隆酵母細胞中的表達。圖6V5抗原表位融合性AR功能驗證結果。其中各泳道為V5融合性AR在不同克隆酵母細胞中的表達。
具體實施例方式文中所用到的質(zhì)粒pYESTrp2 購自 Invitrogen 公司。pcDNA/TR 購自 Clontech 公司pcDNA3. 1/AR (1、Takeyoshi, Μ. , Kuga, N. , Yamasaki, K. , Development of a highperformance reporter plasmid for detection of chemicals with androgenic activity. Arch. Toxicol. 2003 ；77 :274-279 ；2、徐莉春，孫宏，宋玲，王心如，雄激素受體(hAR) CAT報告基因篩選AR激動劑和拮抗劑的方法研究，環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學，2008 ； 25(3) :259-262 ；3、Li-Chun Xu, Hong Sun, Jian-Feng Chen, Qian Bian, Jie Qian, Ling Song, Xin-Ru Wang. Evaluation of androgen receptor transcriptional activities of bisphenol A, octylphenol and nonylphenol in vitro. Toxicology, 2005 ；216 :197-203 ；4> Li-Chun Xu, Lu Liu, Xiang-Mei Ren, Mei-Rong Zhang, Ning Cong, Ai-Qin Xu, Ji-Hong Shao. Evaluation of androgen receptor transcriptional activities of some pesticides in vitro. Toxicology, 2008 ；243 :59-65 ；5> Hong Sun, Li-Chun Xu, Jian-Feng Chen, Ling Song, Xin-Ru Wang. ^Efffect of bisphenol A, tetrachlorobisphenol A and pentachlorophenol on the transcriptional activities of androgen receptor-mediated reporter gene. Food and Chemical Toxicology. 2006 ； 44 :1916-1921.)由日本 Takeyoshi Masahiro 博士 (Chemical Evaluation and Research Institute)饋贈，申請人實驗室保存。根據(jù)GeneBank中的GPD啟動子DNA序列(gil71M2)，用PCR方法從酵母DNA提取液中擴增 GPD 啟動子，上游引物為 5’ -CTGATTTAAATCGAGTTTA TCATTATCAATA-3，(SEQ ID No. 1)，下游引物為 5’-TCCGGATCCGTCGAAACTAAGTTCTTGGT-3’ (SEQ ID No. 2)。在引物的 5' 端分別設計Swa I和BamH I兩酶切位點(下劃線所示)，并增加3個保護堿基。PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)純化回收后備用。用Swa I和BamH I分別對載體pYESTrp2和GPD的PCR產(chǎn)物雙切， 用T4連接酶將⑶P啟動子與pYESTrp2載體相連，構建成GPD驅(qū)動的酵母表達載體(ρ⑶P)。V5抗原表位(V5印itope) DNA由上海生功合成，正鏈為5 ‘ -gatccATGGGTAAGCCTAT CCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACA g g-3 ‘ (SEQ IDNo. 3)，反鏈為 5 ‘ -aattc ■ TGTAGAAT CGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCCATg-3' (SEQ ID No. 4)。分別在正、反鏈的 5'端增設BamH I和EcoR I黏性末端(小寫所示)。同時在正鏈的3'和反鏈5'端分別增設一個G和C(方框所示)，使V5印itope DNA后增加1個Gly (甘氨酸)密碼子即GGA，以便與下游基因相融合。將單股V5印itope DNA用STES緩沖配成5 μ mol/L,各取20 μ L于PCR管中混合， 置于500m L水中加熱至95°C，維持5min，立即停止加熱，冷卻至室溫(約2h)，使之退火形成雙股。對pGPD用BamH I和EcoR I雙切，用DNA試劑盒回收載體片段，并用T4連接酶與 V5epitope DNA連接，連接產(chǎn)物轉化于DH5 α，用營養(yǎng)瓊脂/Amp平板篩選陽性克隆，轉化子克隆質(zhì)粒進行PCR鑒定，引物分別為GPD上游啟動子引物和反向V5印itope DNA0對鑒定正確的質(zhì)粒測序，將其命名為PGPDV5。實施例1 本發(fā)明對四環(huán)素阻遏蛋白(TR)在酵母細胞中的表達驗證。四環(huán)素阻遏蛋白(TR)為對大腸桿菌四環(huán)素轉座子的一種蛋白質(zhì)，分子量20kD左右，目前未見其在酵母細胞中表達報道。以pcDNA/TR為模板，PCR擴增TR基因開放性閱讀框(ORF)，上游引物為 5' -GTGgaattc @ ATGTCTAGATTAGATAAAAG-3 ‘ (EcoR I) (SEQ ID No. 5)，下游為 5' -AAGctcgagTTAATAAGATCTGAATTCCC-3' (Xhol I) (SEQ ID No. 6)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)DNA試劑盒純化后，用EcoR I和Biol I雙酶切，將切下的TR插入到V5融合酵母表達載體pGPDV5中，通過柔性短肽Gly (甘氨酸)-IIe (異亮氨酸)-Leu (亮氨酸)的密碼子即GGA-ATT-CTG與V5抗原表位相融合，將所構建的載體命名為pGPDV5/TR。將載體pGPDV5/TR用醋酸鋰(LiAC)方法轉染于W303-1A酵母細胞，用SD/trp-平板篩選出陽性克隆，挑取3mm左右克隆，置于SD/-trp培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的酵母細胞，提取蛋白質(zhì)，用Western blot方法進行分析，一抗用小鼠抗V5表位單克隆抗體IgG2aGnvitrogen公司產(chǎn))，二抗用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的羊抗小鼠的多克隆抗體 (IgG-HRP，北京天根公司產(chǎn))。通過驗證發(fā)現(xiàn)TR基因的在酵母細胞表達(圖3)。實施例2 本發(fā)明對人雄激素受體(AR)在酵母細胞中表達及功能的驗證1)人雄激素受體(Al )在酵母細胞中表達驗證。人雄激素受體分子量約為llOkd。用PCR方法從pcDNA3. 1/AR中擴增AR 0RF,引物設計為上游5 ‘ -CAGgaattc [XX ATGGAAGTGCAGTTAGGGCT-3 ‘ (SEQ ID No. 7)，下游為 5' -CTActcgagTCACTGGGTGTGGAAATAGA -3' (SEQ ID No. 8)，各自含有EcoR I和Bio I酶切位點(小寫所示)。PCR產(chǎn)物用試劑盒回收純化，將其插入到PGPDV5的相應酶切位點，構建成pGPDV5/AR。V5抗原表位通過柔性短肽Gly (甘氨酸)-Ile (異亮氨酸)-Gln (谷氨酰氨)的密碼子即GGA-ATT-CAA與AR相融
口 O按實施例1的方法將pGPDV5/AR轉化于W303-1A酵母細胞，用相同的方法驗證AR 在酵母細胞中的表達。由圖4可見AR在酵母細胞中表達。2)人雄激素受體(AR)在酵母細胞中表達的功能驗證。雄激素是通過與雄激素受體(AR)結合而發(fā)揮其功能的。AR與雄激素結合后可發(fā)生變構效應，激活受體復合物并使其能夠與細胞核的DNA受體位點結合，此位點被稱為雄激素效應元件(androgen response element, ARE)或雄激素受體互補核糖核酸，發(fā)揮雄激素效應。為了驗證AR與V5抗原表位相融合后，是否對會AR的生物活性產(chǎn)生影響，我們將PGPDV5/AR轉化于ARE調(diào)控的重組Lac Z酵母細胞(圖5所示)。Lac Z基因編碼β -半乳糖苷酶，但表達量是在ARE的調(diào)控之下。半乳糖苷酶可催化底物ONPG顯黃色，如果AR 的生物活性未受到V5抗原表位影響，則在雄激素作用下，β -半乳糖苷酶表達量會明顯升高，酵母細胞會底物ONPG明顯顯色，反之，則相反。 圖6為V5抗原表位融合性AR功能驗證結果，可見所挑取的6個酵母克隆，經(jīng)雄激素(醋酸丙睪酮5X10_4mg/L)誘導6小時后，用ONPG顯色后，于405nm比色，發(fā)現(xiàn)其OD值與空白對照明顯不同，說明V5抗原表位與AR相融合后，對AR生物活性功能沒有影響。
權利要求
1.一種酵母細胞表達載體，其特征在于該表達載體具有V5抗原表位，V5抗原表位可通過柔性短肽Gly-Ile-與下游基因相融合，將該載體命名為pGPDV5。
2.如權利要求1所說的酵母表達載體PGPDV5，其特征在于V5抗原表位DNA可在酵母強啟動子GPD的驅(qū)動下與下游的外源性基因進行融合表達，且不會影響下游基因表達產(chǎn)物的生物活性。
3.—種酵母表達載體PGPDV5的構建方法，是1)以hvitrogen公司的pYestrp2載體為基本框架，通過PCR方法從酵母基因組擴增酵母強啟動子GPD，并經(jīng)Swa I和BamH I兩酶切位點，將其插入到pYestrp2載體中，構建成 GPD驅(qū)動的酵母表達載體，命名為pGPD ；2)人工合成兩條V5抗原表位DNA單鏈，正鏈為 5 ‘ -gatccATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACAGg-3 ‘；反鏈為 5 ‘ -aattcCTGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCCATg-3 ‘；3)將所合成的V5抗原表位DNA用退火緩沖配成5umol/L，等體積混合，常規(guī)退火形雙股，將插入到PGPD的相應酶切位點，構建成可與V5抗原表位相融合的酵母表達載體 PGPDV5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可與V5抗原表位相融合的酵母表達載體及其構建方法。所說的V5抗原表位相融合的酵母表達載體，是一種含有V5“標簽”(tag)酵母表達載體，該“標簽”可通過一個柔性短肽Gly-Ile-與下游基因相融合，不會影響下游表達蛋白的生物活性。其構建方法是以Invitrogen公司的pYestrp2載體作為基本框架，將酵母強啟動子GPD插入到pYestrp2載體中，構建成酵母表達載體pGPD，再將5′和3′端具有BamHI和EcoRI黏性末端V5抗原表位DNA，插入到pGPD相應的酶切位點，構建成V5融合性酵母表達載體pGPDV5。pGPDV5可通過柔性短肽與下游基因相融合。由于V5抗體已經(jīng)商品化，故本發(fā)明可以方便、特異性、有效地驗證外源性基因的在酵母細胞中的表達，且費用相對較低。
文檔編號C12N15/81GK102533843SQ201210053179
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月2日 優(yōu)先權日2012年3月2日
發(fā)明者李湘鳴, 羅方妮, 葛宜枝 申請人:揚州大學