專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白siRNA干擾序列及其融合表達(dá)載體和該表達(dá)載體的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是用于抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和擴(kuò)散的細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白siRNA干擾序列及其融合表達(dá)載體和該表達(dá)載體的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)錄后的基因沉默是進(jìn)化過(guò)程中一種抵御轉(zhuǎn)錄子和RNA病毒的防御機(jī)制，在植物和動(dòng)物分化之前就已經(jīng)出現(xiàn)。1998年華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的Craig Mello首次將雙鏈dsRNA (double-stranded RNA)注入線(xiàn)蟲(chóng)，結(jié)果誘發(fā)了比正義鏈和反義鏈的單獨(dú)注射都要強(qiáng)的基因沉默。將這種由dsRNA引發(fā)的特定基因表達(dá)受抑制現(xiàn)象稱(chēng)為RNA干擾作用(RNA interference RNAi)。RNA干擾是由雙鏈RNA所引起的序列特異性基因沉默，是真核生物中一種非常保守的機(jī)制，它與協(xié)同抑制、轉(zhuǎn)錄子沉默以及發(fā)育等許多重要的生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)。RNA干擾依賴(lài)于小干擾RNA (Small interferenceRNA, siRNA)與靶序列之間嚴(yán)格的堿基配對(duì)，具有很強(qiáng)的特異性，涉及眾多基因和蛋白復(fù)合物，構(gòu)成了一個(gè)以小RNA為核心的真核基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，它可以在染色質(zhì)水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。 RNA干擾技術(shù)為人們迅速、準(zhǔn)確的剖析基因的功能，分析基因之間錯(cuò)綜復(fù)雜的聯(lián)系和相互作用提供了極為有用的工具，同時(shí)也為人們預(yù)防和治療癌癥和病毒疾病提供了新的思路，例如研究信號(hào)傳導(dǎo)通路和基因功能RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中降低特異性基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間，控制基因表達(dá)的部位，以開(kāi)展基因治療的新途徑。惡性膠質(zhì)瘤是一類(lèi)惡性程度極高的惡性腫瘤，占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的40%和中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤78%。惡性膠質(zhì)瘤向周?chē)ＤX組織侵襲浸潤(rùn)是其致死的主要原因，盡管現(xiàn)代的診斷和治療技術(shù)已經(jīng)有了長(zhǎng)足的發(fā)展，其中位生存時(shí)間仍然不超過(guò)15個(gè)月。迄今為止惡性膠質(zhì)瘤侵襲浸潤(rùn)的分子機(jī)制，尚未完全明確。Girdin是由日本學(xué)者在2005年首次發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。Girdin是一個(gè)由1870個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的大分子蛋白質(zhì)，又被命名為 APE (Akt-phosphorylation enhancer)。研究發(fā)現(xiàn)Girdin在哺乳動(dòng)物組織及多種細(xì)胞系
中普遍表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決惡性膠質(zhì)瘤病人腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和擴(kuò)散問(wèn)題，提供一種細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白siRNA干擾序列及其融合表達(dá)載體和該表達(dá)載體的醫(yī)藥用途。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是設(shè)計(jì)針對(duì)Girdin的siRNA片段，通過(guò)siRNA基因敲除技術(shù)靶向抑制Girdin的表達(dá)，在連接酶作用下連入pGPTO/GFP/Neo載體中，轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，制備Girdin-siRNA融合表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染到惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN-2^中， 用免疫印記等方法檢測(cè)到細(xì)胞中的Girdin的表達(dá)水平降低，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株進(jìn)行一系列細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，確定Girdin-siRNA融合表達(dá)能夠降低腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和擴(kuò)散能力。應(yīng)用Qiagen Plasmid Maxi試劑盒提取純化Girdin-siRNA融合表達(dá)載體質(zhì)粒，確保無(wú)內(nèi)毒素污染，用無(wú)RNA酶水溶解載體，終濃度為10yg/ml，-8(TC凍存，備用。因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成一段細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白SiRNA干擾序列，該序列兩端分別帶有BamH I和Kds I酶切位點(diǎn)，該序列的堿基序列及siRNA作用位點(diǎn)如下5’_GGCTGGCT TGGAGGAGAATTA-3’。一種細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白SiRNA干擾序列的融合表達(dá)載體，該融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN-229中，特異的降解與其互補(bǔ)的細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白mRNA，降低惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN-2^中細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白mRNA的表達(dá)，有效的抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移，粘附以及侵襲能力，該融合表達(dá)載體的堿基序列見(jiàn)序列表。一種細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白SiRNA干擾序列的表達(dá)載體在制備腫瘤基因治療制劑中的應(yīng)用a.細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白siRNA干擾序列的融合表達(dá)載體有效的抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外遷移能力，趨化能力；b.細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白SiRNA干擾序列的融合表達(dá)載體有效的抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外粘附能力，侵襲能力；c.細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白SiRNA干擾序列的融合表達(dá)載體抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞擴(kuò)散和侵襲浸潤(rùn).本發(fā)明的有益效果1. Girdin-siRNA融合表達(dá)載體能夠抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外遷移能力，趨化能力。2. Girdin-siRNA融合表達(dá)載體能夠抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外粘附能力，侵襲能力。3.綜上所述，本發(fā)明提供了 Girdin-siRNA融合表達(dá)載體在抑制人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲方面的藥物用途，可用于腫瘤病人的基因治療，抑制腫瘤擴(kuò)散和侵襲浸潤(rùn)。


圖1本發(fā)明融合表達(dá)載體的圖譜示意圖；圖2是人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染Girdin-siRNA融合表達(dá)載體質(zhì)粒后Girdin蛋白水平圖；圖3a是劃痕實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞遷移情況；圖北是轉(zhuǎn)染組Girdin蛋白表達(dá)降低的細(xì)胞的遷移能力與對(duì)照組比對(duì)圖；圖4是轉(zhuǎn)染組Girdin蛋白表達(dá)降低的細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)能力與對(duì)照組比對(duì)圖；圖5是轉(zhuǎn)染組Girdin蛋白表達(dá)降低的細(xì)胞的粘附能力與對(duì)照組比對(duì)圖；圖6是轉(zhuǎn)染組Girdin蛋白表達(dá)降低的細(xì)胞的侵襲能力與對(duì)照組比對(duì)圖。
具體實(shí)施例方式一 .實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN-2^細(xì)胞株由美國(guó)德克薩斯大學(xué)MD Anderson癌癥中心提供，趨化小室購(gòu)自Neuro Probe公司，EGF購(gòu)自P印rotech公司，intersectinl抗體來(lái)自于 Abcam 公司,G418 購(gòu)自 Invitrogen 公司。二 . Girdin-siRNA 的設(shè)計(jì)與合成依據(jù)Ambion公司在網(wǎng)上提供的siRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異的intersectinl-siRNA， 并由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成以下模版，兩端分別帶有BamH I和Kds I酶切位點(diǎn)， siRNA作用位點(diǎn)5， -GAAGGAGAGGCAACTGGAT-3，。三.Girdin-siRNA融合表達(dá)載體的制備表達(dá)載體pGPTO/GFP/Neo載體其結(jié)構(gòu)為線(xiàn)性，兩端分別為BamH I和Kds I酶切位點(diǎn)的粘性末端。將合成的Girdin-siRNA退火，連接酶作用下連入pGPTO/GFP/Neo載體中， 轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，鋪平板過(guò)夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)增培養(yǎng)提取質(zhì)粒。酶切測(cè)序驗(yàn)證插入序列。應(yīng)用Qiagen Plasmid Maxi試劑盒提取純化Girdin-siRNA融合表達(dá)載體質(zhì)粒，確保無(wú)內(nèi)毒素污染，用無(wú)RNA酶水溶解載體，終濃度為10yg/ml，-80° C凍存，備用， 該融合表達(dá)載體的堿基序列見(jiàn)序列表。陰性對(duì)照control-siRNA載體由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供，含有一段與人類(lèi)已知基因均不同的siRNA，在實(shí)驗(yàn)中我們稱(chēng)其為scr。四.融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞先將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行饑餓處理，2小時(shí)后將4μ g融合表達(dá)載體與IXlO5 細(xì)胞混合，采用脂質(zhì)體2000 (Invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6小時(shí)后換為完全培養(yǎng)液，3天后添加 G418抗生素進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)染不成功的細(xì)胞由于沒(méi)有攜帶抗生素的抗性基因則逐漸死亡，剩余存活的細(xì)胞為轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。針對(duì)這些存活細(xì)胞進(jìn)行單克隆篩選，那些能夠使Girdin 的表達(dá)顯著降低的克隆為下面實(shí)驗(yàn)所用。五.檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中Girdin的表達(dá)水平免疫印跡方法檢測(cè)Girdin的表達(dá)水平將對(duì)照細(xì)胞和Girdin-siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，并應(yīng)用超聲破碎儀輔助裂解，然后置于沸水中靜置10分鐘。 處理后的樣本進(jìn)行離心以取出沉淀。隨后應(yīng)用蛋白定量檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，然后進(jìn)行蛋白電泳，并將樣本蛋白傳遞至硝酸纖維素薄膜上，用5%煉乳溶液進(jìn)行室溫封閉1小時(shí)，然后加入Girdin抗體，在4°C冰箱中靜置過(guò)夜，第二天用二抗進(jìn)行室溫孵育1 小時(shí)，然后應(yīng)用ECL方法進(jìn)行X光片曝光處理，以得到蛋白條帶。根據(jù)曝光條帶的深淺判斷蛋白的表達(dá)量。通過(guò)此方法檢測(cè)結(jié)果，表明經(jīng)過(guò)Girdin-siRNA融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后調(diào)選出的細(xì)胞克隆，其Girdin的表達(dá)量由顯著降低，見(jiàn)圖2。六.檢測(cè)轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力采用劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自主運(yùn)動(dòng)能力。劃痕實(shí)驗(yàn)是指在單層生長(zhǎng)的細(xì)胞中間用ΙΟμΙ的微量槍頭劃出粗細(xì)均勻的一條痕跡，然后在不同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞向劃痕中間遷移的距離，這是檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的一種重要的技術(shù)手段。根據(jù)實(shí)驗(yàn)照片，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在M小時(shí)遷移的距離比對(duì)照組有明顯降低，進(jìn)一步在不同時(shí)間點(diǎn)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力比對(duì)照有明顯降低(P < 0. 05)，見(jiàn)圖3a，b。表明該融合表達(dá)載體制備成藥物可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。七.檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨化能力
趨化運(yùn)動(dòng)是指細(xì)胞在趨化因子的作用下，向趨化因子的方向進(jìn)行遷移的運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象，它是一種檢測(cè)細(xì)胞定向運(yùn)動(dòng)的重要指標(biāo)和方法。在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用腫瘤細(xì)胞的一種趨化因子表皮生長(zhǎng)因子EGF作為誘導(dǎo)因子，觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的趨化能力。實(shí)驗(yàn)中EGF的使用濃度為0，1，10，100，lOOOng/mL·采用Neuroprobe公司的48孔趨化小室進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別在實(shí)驗(yàn)前用無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓3小時(shí)，然后在37°C培養(yǎng)箱中趨化3 小時(shí)。趨化實(shí)驗(yàn)中用到的薄膜購(gòu)自Neuroprobe公司，并且在使用前預(yù)先用10 μ g/ml的纖維粘連蛋白進(jìn)行包被，以使細(xì)胞能夠很好的粘附與薄膜。趨化實(shí)驗(yàn)完畢后，薄膜進(jìn)行固定和染色，然后在400倍顯微鏡下觀察穿過(guò)薄膜的細(xì)胞數(shù)，鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并取平均值。對(duì)照組細(xì)胞在最佳濃度的趨化因子存在下，其趨化細(xì)胞數(shù)約為150，而實(shí)驗(yàn)組則約為50，兩者有顯著的差異(P<0. 05)，見(jiàn)圖4。表明該融合表達(dá)載體制備成藥物可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨化能力。八.檢測(cè)轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的粘附能力粘附能力是腫瘤細(xì)胞侵襲浸潤(rùn)的一個(gè)先決條件，粘附能力的高低在一定程度上決定著侵襲浸潤(rùn)能力的強(qiáng)弱。取相同細(xì)胞數(shù)目的培養(yǎng)的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，分別用IOng/ ml的EGF作為刺激因子加入到細(xì)胞懸液中，然后把細(xì)胞種入細(xì)胞培養(yǎng)皿(內(nèi)置有預(yù)先用纖維粘連蛋白包被過(guò)的玻片)，再分別在5分鐘，15分鐘，30分鐘，45分鐘的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行洗滌， 只有粘附在玻片上的細(xì)胞存留在培養(yǎng)皿中，沒(méi)有粘附的細(xì)胞全部被清洗掉，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定并進(jìn)行封片，最后用顯微鏡觀察粘附細(xì)胞的數(shù)量。200倍鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并取平均值。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞由于Girdin表達(dá)的降低，在5分鐘和15分鐘時(shí)的粘附能力比對(duì)照組有顯著降低，見(jiàn)圖5。表明該融合表達(dá)載體制備成藥物可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的粘附能力。九.檢測(cè)轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力在研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外侵襲能力的研究中，Matrigel基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)通常被用來(lái)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)中采用M孔insert板，內(nèi)置有8微米的薄膜，購(gòu)自于 Costar公司。將從sigma公司購(gòu)買(mǎi)的Matrigel基質(zhì)膠預(yù)先均勻涂布在薄膜上，然后將相同數(shù)目的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞種于M孔insert板內(nèi)，至于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3小時(shí)，實(shí)驗(yàn)完畢后，取出薄膜進(jìn)行固定和染色，計(jì)數(shù)方法與趨化實(shí)驗(yàn)相同。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力與對(duì)照組有顯著降低，見(jiàn)圖6。表明該融合表達(dá)載體制備成藥物可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。
權(quán)利要求
1.一段細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白SiRNA干擾序列，其特征在于該序列兩端分別帶有BamHI和^sI酶切位點(diǎn)，該序列的堿基序列及siRNA作用位點(diǎn)如下 5’ -GAAGGAGAGGCAACTGGAT-3’。
2.一種細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白siRNA干擾序列的融合表達(dá)載體，其特征在于該融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN-229中，特異的降解與其互補(bǔ)的細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白mRNA， 降低惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN-229中細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白mRNA的表達(dá)，有效的抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移，粘附以及侵襲能力，該融合表達(dá)載體的堿基序列見(jiàn)序列表。
3.細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白siRNA干擾序列的表達(dá)載體在制備腫瘤基因治療制劑中的應(yīng)用a.細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白siRNA干擾序列的融合表達(dá)載體有效的抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外遷移能力，趨化能力；b.細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白siRNA干擾序列的融合表達(dá)載體有效的抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外粘附能力，侵襲能力；c.細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白siRNA干擾序列的融合表達(dá)載體抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞擴(kuò)散和侵襲浸潤(rùn)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白siRNA干擾序列及其融合表達(dá)載體和該表達(dá)載體的醫(yī)藥用途，屬于生物制藥領(lǐng)域。本發(fā)明設(shè)計(jì)一段細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白siRNA干擾序列，并合成細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白siRNA干擾序列的融合表達(dá)載體，該融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系后，能夠特異的降解與其互補(bǔ)的細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白mRNA，降低人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白的表達(dá)，而且可以有效的抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移，粘附以及侵襲能力，具有抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和擴(kuò)散的作用，為腫瘤病人的基因治療提供一種可行的技術(shù)手段。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102242116SQ20101017032
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月12日
發(fā)明者王靜, 谷峰, 馬勇杰 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院