專利名稱：抑癌基因編碼蛋白序列及其融合表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是對DNA損傷敏感的抑癌基因的蛋白核心功能區(qū) 域及其融合表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
腫瘤細(xì)胞的特征是基因組不穩(wěn)定性(genomic instability)，DNA損傷修復(fù)異常和 細(xì)胞周期調(diào)控異常是造成基因組不穩(wěn)定性的原因。腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化是以錨定非依賴性 生長(anchor-independent growth)為特征。以基因組DNA為研究對象的微陣列比較基因組雜交(microarray-based comparative genomic hybridization, Array-CGH)技術(shù)是目前國際上發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)新基 因的強(qiáng)有力手段。Array-CGH技術(shù)將覆蓋全基因組且已知順序的DNA克隆做成微陣列，代 替?zhèn)鹘y(tǒng)CGH檢測中將中期染色體作為雜交靶，大大提高了檢測DNA拷貝數(shù)異常位點(diǎn)的分辨 率；再分別提取腫瘤組織和正常組織的基因組DNA，用cy3和cy5熒光染料分別標(biāo)記腫瘤組 織和正常組織的DNA，進(jìn)行雜交檢測，在雜交系統(tǒng)中加入Cotl-DNA用于抑制基因組中重復(fù) 序列的干擾，并用自動化的掃描儀分析雜交靶上熒光信號的相對強(qiáng)弱，最后用自動化分析 軟件進(jìn)行定量分析。Array-CGH不僅使檢測染色體異常的分辨率提高，而且還可以確定腫瘤 相關(guān)基因并提供精確的定位。對DNA損傷敏感的基因(FATS)，編碼一個在進(jìn)化上極其保守的蛋白，在多種癌細(xì) 胞中發(fā)生缺失及表達(dá)異常，是一個抑癌基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為進(jìn)一步研究FATS抑癌分子機(jī)制，以及為FATS在腫瘤基因治療中的應(yīng) 用，而提供一段抑癌基因編碼蛋白序列及其融合表達(dá)載體。本發(fā)明通過比較基因組雜交技術(shù)(CGH)和以細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC)為基礎(chǔ)的DNA芯片技術(shù)，系統(tǒng)分析腫瘤基因組中DNA拷貝 數(shù)的異常變化，在DNA缺失區(qū)域確認(rèn)一個命名為FATS(Eragile-site Associated lumor Suppressor)的基因。微陣列CGH分析結(jié)果表明FATS最大的編碼外顯子區(qū)在腫瘤基因組 中的缺失頻率比下游外顯子區(qū)高7倍，并以開放讀碼框架(open reading frame, 0RF)的形 式存在，并將其命名為mini-FATS，顯示mini-FATS核酸序列是FATS基因發(fā)揮抑癌功能的關(guān) 鍵區(qū)域。ORF編碼蛋白序列如下MISPVVISRLIDEKKSMENGAILPQAIAQPQLCPTKPALARRDGVSMHRRFALSPDRLGILTPSDDQGLETEPLSTGDNLGKGSHSGFSSITITARRVGPPASSLVWDTFRDPLCPKCKAKDALFQEPPVLAGDARLCQHNRPFTCTESPSNGSVEGMKVFQAHSRLSARQDYWVTHTNDNEDSFSSDNSPSRKVPLVFSSCVHFRVSQQ
CPNAIYYLDKSLSVPLERPQIASPKMHRSVLSLSLRCSSHQLTADGVDSSANGEPISTALSQELSEGKQD
LLGPQWGQPQGGHWKESPALVPVHLGSGTCPRTGSPPLENVKFADVGRNQVPVRKEKEDHATCTSSSHTN
QLSIHIPGffSYR一段抑癌基因編碼蛋白序列，其是由對DNA損傷敏感抑癌基因最大外顯子區(qū)編碼，蛋白產(chǎn)物具有體外和體內(nèi)抗腫瘤活性，其編碼蛋白見序列表1。所述抑癌基因編碼蛋白序列，該序列由對DNA損傷敏感抑癌基因中的微型抑癌基 因區(qū)域編碼，蛋白產(chǎn)物具有體外和體內(nèi)抗腫瘤活性。所述抑癌基因編碼蛋白序列，其具有的抗腫瘤活性包括抑制癌細(xì)胞體外生長，抑 制裸鼠移植瘤的生長。一種抑癌基因編碼蛋白序列的融合表達(dá)載體，其是由微型對DNA損傷敏感抑癌基 因的核酸序列與PCDNA3載體連接而成，該融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后能抑制腫瘤細(xì)胞 的惡性轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增。所述的抑癌基因編碼蛋白序列的融合表達(dá)載體，該融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后，抑制 Hela癌細(xì)胞在裸鼠異體移植瘤模型中的生長。本發(fā)明通過脂質(zhì)體將融合表達(dá)載體pcDNA3-FATS和空載體pcDNA3分別轉(zhuǎn)入Hela 人宮頸癌細(xì)胞系中，通過新霉素壓力篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞株，用MTT，軟瓊脂分析和裸鼠動物 實(shí)驗(yàn)方法檢測mini-FATS的抗腫瘤活性。本發(fā)明提供了 FATS蛋白具有的體外(in vitro)和體內(nèi)(in vivo)抗腫瘤功能， 為腫瘤基因治療和模擬mini-FATS編碼蛋白三維結(jié)構(gòu)的抗癌化學(xué)藥物設(shè)計提供了基礎(chǔ)。


圖1是微陣列CGH分析結(jié)果；圖2是為融合表達(dá)載體pcDNA3-FATS的構(gòu)建示意圖；圖3是MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖4是為軟瓊脂實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖5是體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。一 .實(shí)驗(yàn)材料來源小鼠模型用p53雜合子近交系C57BL/6小鼠建立。用Y -射線(4Gy)單劑量照射， 4-6月后收集胸腺淋巴瘤組織，提取基因組DNA。Hela細(xì)胞購自美國American Type Culture Collection (ATCC)。表達(dá)載體 pcDNA3、脂質(zhì)體 Lipofactamine2000 和 G418 購自 Invitrogen 公司。3-(4,5)-dimethylthiahiazo(_z_yl)_3，5-di-phenytetrazoliumromide(MTT) i式 齊U購自Sigma公司。 果鼠購自Jackson Laboratory0二.實(shí)施方法1. Array-CGH 實(shí)驗(yàn)用覆蓋小鼠全基因組的BAC文庫DNA制備DNA芯片，每張玻璃芯片含19000個 微陣列BAC克隆。提取小鼠胸腺淋巴瘤組織DNA，以正常小鼠的基因組DNA作為對照， 分別用cy3和cy5熒光染料分別標(biāo)記腫瘤組織和正常組織的DNA，進(jìn)行雜交檢測，在雜交系統(tǒng)中加入Cotl-DNA用于抑制基因組中重復(fù)序列的干擾，并用自動化的掃描儀ImaGene 4. O (BioDiscovery公司)分析雜交靶上熒光信號的相對強(qiáng)弱，最后用自動化分析軟件 Excel-Macro進(jìn)行定量分析。2.生物信息學(xué)分析通過比較基因組學(xué)分析，用美國國家國家衛(wèi)生研究所網(wǎng)上提供的分析軟件(// www.nebi. nlm. nih. gov)分析CGH結(jié)果，確定FATS新基因外顯子分布和mRNA核酸序列，參 見序列表。圖1中RP23-35I7和RP23-34H14為BAC克隆名稱。3. pcDNA3-FATS融合表達(dá)載體構(gòu)建融合表達(dá)載體pcDNA3-FATS其結(jié)構(gòu)為環(huán)狀，將mini-FATS雙鏈核酸序列以平末端 正向連接到PCDNA3載體中CMV啟動子下游，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，鋪平板過夜培養(yǎng)， 挑取轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)增培養(yǎng)提取質(zhì)粒，酶切測序驗(yàn)證插入序列。mini-FATS雙鏈核酸序列通過PCR 擴(kuò)增得到，弓丨物序列為 5 ‘ -CTGGCATCACAGAACACAAGAATGA-3 '和 5 ‘ -CTACTCACCAGCCCTGTA ACTCCAG-3‘。用PCR儀GeneAmp 9700上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為94°C預(yù)變性2min，94°C變 性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)30次。用瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，參見圖2， mini-FATS被置于CMV啟動子下游，在末端含有翻譯終止密碼。4.融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞株應(yīng)用EndoFree Plasmid Maxi試劑盒提取純化質(zhì)粒，用200 μ 1低滲液將2 μ g重 組質(zhì)粒與4μ 1脂質(zhì)體LipofactamindOOO混合，靜置15分鐘，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，5% CO2 溫箱孵育。添加500 μ g/μ 1 G418壓力篩選至非轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞完全死亡，約20天，將表 達(dá)pcDNA3-FATS的單克隆挑出擴(kuò)大培養(yǎng)。結(jié)果表明表達(dá)mini-FATS的Hela癌細(xì)胞生長速度，與對照組相比顯著下降，錨 定非依賴性惡性生長特征基本消失，在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的成瘤速率與對照組相比顯著下 降，呈現(xiàn)體外(in vitro)和體內(nèi)(invivo)抗腫瘤活性。5. MTT 實(shí)驗(yàn)接種細(xì)胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔10000個細(xì)胞 接種到96孔板，每孔體積200ul。每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配)20ul，繼續(xù)孵育4小 時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMS0，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分 融解。利用酶標(biāo)儀測定570nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。6.軟瓊脂實(shí)驗(yàn)這一培養(yǎng)法選擇性地使已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行增殖，而抑制正常細(xì)胞的增殖。將含有 0.5%瓊脂的培養(yǎng)基作為營養(yǎng)層鋪在底部，然后再將含有細(xì)胞(Hela-pcDNA或Hela-FATS) 的少量軟瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂量約0.3% )倒在上面。14天后，正常細(xì)胞仍停留在接種時的 狀態(tài)，幾乎不進(jìn)行增殖，但已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則以半浮游狀態(tài)增殖，而形成多細(xì)胞集落。參見圖4，在軟瓊脂介質(zhì)中轉(zhuǎn)染pcDNA3的Hela細(xì)胞(Hela-pCDNA3)能形成多細(xì)胞 集落，但轉(zhuǎn)染PCDNA3-FATS的Hela細(xì)胞(Hela-FATS)幾乎沒有多集落形成。統(tǒng)計結(jié)果基于 至少300個細(xì)胞(P < 0. 001)。7.裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)將5X IO6細(xì)胞(Hela-pcDNA或Hela-FATS)接種于免疫缺陷裸鼠皮下，測量腫瘤體積大小。SEQUENCE LISTING<110>天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院<120>抑癌基因編碼蛋白序列及其融合表達(dá)載體<130>1<160>1<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>362<212>PRT<213>2 Ambystoma laterale χ Ambystoma jeffersonianum<220><221>protein<222>(1). . (362)<223><400>1Met lie Ser Pro Val Val lie Ser Arg Leu lie Asp Glu Lys Lys Ser151015Met Glu Asn Gly Ala lie Leu Pro Gln Ala lie Ala Gln Pro Gln Leu202530Cys Pro Thr Lys Pro Ala Leu Ala Arg Arg Asp Gly Val Ser Met His354045Arg Arg Phe Ala Leu Ser Pro Asp Arg Leu Gly lie Leu Thr Pro Ser505560Asp Asp Gln Gly Leu Glu Thr Glu Pro Leu Ser Thr Gly Asp Asn Leu65707580Gly Lys Gly Ser His Ser Gly Phe Ser Ser lie Thr lie Thr Ala Arg859095Arg Val Gly Pro Pro Ala Ser Ser Leu Val Trp Asp Thr Phe Arg Asp100105110Pro Leu Cys Pro Lys Cys Lys Ala Lys Asp Ala Leu Phe Gln Glu Pro115120125Pro Val Leu Ala Gly Asp Ala His Leu Cys Gln His Asn Arg Pro Phe130135140Thr Cys Thr Glu Ser Pro Ser Asn Gly Ser Val Glu Gly Met Lys Val145150155160Phe Gln Ala His Ser Arg Leu Ser Ala Arg Gln Asp Tyr Trp Val Thr165170175His Thr Asn Asp Asn Glu Asp Ser Phe Ser Ser Asp Asn Ser Pro Ser
180185190
Arg Lys Val Pro Leu Val Phe Ser Ser Cys Val His Phe Arg Val Ser195200205Gln Gln Cys Pro Asn Ala lie Tyr Tyr Leu Asp Lys Ser Leu Ser Val210215220Pro Leu Glu Arg Pro Gln lie Ala Ser Pro Lys Met His Arg Ser Val225230235240Leu Ser Leu Ser Leu Arg Cys Ser Ser His Gln Leu Thr Ala Asp Gly245250255Val Asp Ser Ser Ala Asn Gly Glu Pro lie Ser Thr Ala Leu Ser Gln260265270Glu Leu Ser Glu Gly Lys Gln Asp Leu Leu Gly Pro Gln Trp Gly Gln275280285Pro Gln Gly Gly His Trp Lys Glu Ser Pro Ala Leu Val Pro Val His290295300Leu Gly Ser Gly Thr Cys Pro Arg Thr Gly Ser Pro Pro Leu Glu Asn305310315320Val Lys Phe Ala Asp Val Gly Arg Asn Gln Val Pro Val Arg Lys Glu325330335Lys Glu Asp His Ala Thr Cys Thr Ser Ser Ser His Thr Asn Gln Leu340345350Ser lie His lie Pro Gly Trp Ser Tyr Arg355360
權(quán)利要求
一段抑癌基因編碼蛋白序列，其特征在于由對DNA損傷敏感抑癌基因最大外顯子區(qū)編碼，蛋白產(chǎn)物具有體外和體內(nèi)抗腫瘤活性，其編碼蛋白見序列表1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述抑癌基因編碼蛋白序列，其特征在于該序列由對DNA損傷敏感 抑癌基因中的微型抑癌基因區(qū)域編碼，蛋白產(chǎn)物具有體外和體內(nèi)抗腫瘤活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述抑癌基因編碼蛋白序列，其特征在于具有的抗腫瘤活性包 括抑制癌細(xì)胞體外生長，抑制裸鼠移植瘤的生長。
4.一種如權(quán)利要求1所述抑癌基因編碼蛋白序列的融合表達(dá)載體，其特征在于該融合 表達(dá)載體是由微型對DNA損傷敏感抑癌基因的核酸序列與pcDNA3載體連接而成，該融合表 達(dá)載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后能抑制腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抑癌基因編碼蛋白序列的融合表達(dá)載體，其特征在于該融合 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后，抑制Hela癌細(xì)胞在裸鼠異體移植瘤模型中的生長。
全文摘要
本發(fā)明公開了一段抑癌基因編碼蛋白序列及其融合表達(dá)載體，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域?；趯NA損傷敏感抑癌基因(mini-FATS)中的微型抑癌基因區(qū)域編碼的氨基酸順序進(jìn)化上保守，利用mini-FATS與pcDNA3載體連接構(gòu)建pcDNA3-FATS表達(dá)載體，將pcDNA3-FATS轉(zhuǎn)染HeLa癌細(xì)胞后能顯著抑制Hela癌細(xì)胞的體外生長和惡性轉(zhuǎn)化，并抑制HeLa癌細(xì)胞在裸鼠異體移植瘤模型中的生長。本發(fā)明提供了FATS蛋白具有的體外和體內(nèi)抗腫瘤功能，為腫瘤基因治療和模擬mini-FATS編碼蛋白三維結(jié)構(gòu)的抗癌化學(xué)藥物設(shè)計提供了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/85GK101798343SQ200910067828
公開日2010年8月11日 申請日期2009年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月6日
發(fā)明者李政 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院