專利名稱：快速套式pcr瘧疾分子診斷試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及ー種快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
瘧疾是世界上危害最嚴(yán)重的三大傳染病(愛滋病，結(jié)核和瘧疾)之一，世界衛(wèi)生組織(WHO)已把控制瘧疾列入本世紀(jì)行動(dòng)目標(biāo)。感染人的瘧原蟲有4種S卩惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、間日痕原蟲(P. vivax)、三日痕原蟲(P. malariae)和卵形痕原蟲(P. ovale)。由于4種瘧原蟲的生物學(xué)和免疫學(xué)特性，致病性，對(duì)抗瘧藥的治療效應(yīng)各不相同，對(duì)媒介按蚊的敏感性以及它們?cè)谌蛄餍械膮^(qū)域分布各異。毎年全球瘧疾感染病人數(shù)以億計(jì)，其中因惡性瘧疾喪生者超過百萬。及時(shí)準(zhǔn)確地診斷和鑒別診斷各種瘧疾是臨床 正確治療、挽救病人生命和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的關(guān)鍵、也是制訂防制措施以及抗瘧藥和疫苗研制的迫切需要。瘧疾診斷方法包括臨床診斷、病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子(基因)診斷。由于瘧疾的主要臨床表現(xiàn)與其他傳染病相似難于鑒別，單憑臨床癥狀極易誤診。常用的血清學(xué)方法如間接熒光抗體試驗(yàn)等，其陽性只反映近年曾感染瘧疾，主要應(yīng)用于瘧疾血清流行病學(xué)調(diào)查評(píng)價(jià)；ELISA等檢測(cè)抗原的方法，因其敏感性和特異性不高，難于實(shí)際應(yīng)用。因此兩者均不能作為瘧疾病人的確診依據(jù)。目前，已沿用50多年的鏡檢法仍然是瘧疾病人確診的主要依據(jù)。鏡檢法雖然較簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，結(jié)果判斷主觀性強(qiáng)，其靈敏性與準(zhǔn)確性決定于鏡檢員的素質(zhì)和經(jīng)驗(yàn)；特別是檢出低原蟲血癥的敏感性差，WHO瘧疾專家在《瘧疾診斷的新展望》報(bào)告中指出有經(jīng)驗(yàn)的鏡檢員可能檢出5-10個(gè)蟲/μ I低原蟲血癥，但是一般鏡檢員的實(shí)際檢出低限僅為100-150個(gè)蟲/μ I。按目前常規(guī)血檢，每張血片僅檢查100-200個(gè)油鏡視野，甚至達(dá)不到100個(gè)視野(約占整個(gè)血膜的1/10-1/20)，低密度帶蟲者漏檢是不可避免的。顯然，基于上述固有缺陷，鏡檢法已不能滿足現(xiàn)代瘧疾防治與研究中檢出低原蟲血癥的需要，特別是不適合流行病學(xué)調(diào)查監(jiān)測(cè)、疫苗研制、抗瘧藥物試驗(yàn)和篩選獻(xiàn)血員等大規(guī)模血樣的檢測(cè)。從上世紀(jì)七十年代起，研究較多的吖啶橙染色熒光顯微鏡檢查瘧原蟲，其中比較成功的有我國(guó)的吖啶橙直接滴染法和國(guó)外的QBC法(毛細(xì)管定量血沉棕黃層吖啶橙染色)，能提高工作效率，檢出率接近普通鏡檢法的水平；但是無法鑒定蟲種，另與鏡檢法一祥，以技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)、結(jié)果作主觀性判斷，并需使用價(jià)格昂貴的熒光顯微鏡或適當(dāng)?shù)臒晒饧ぐl(fā)光源 等原因難于實(shí)際應(yīng)用。上世紀(jì)末在世界衛(wèi)生組織(WHO)積極倡導(dǎo)和資助下，發(fā)展起來的抗原捕獲快速診斷試驗(yàn)(RDTs)即免疫層析色譜試紙法。因免疫層析色譜試紙法操作簡(jiǎn)便、快速，且不須專業(yè)技術(shù)只要簡(jiǎn)單培訓(xùn)的基層人員可以操作，適用于基層醫(yī)院特別是缺乏顯微鏡及鏡檢人員的農(nóng)村診所，便能快速診斷及時(shí)對(duì)病人抗瘧治療。但是，免疫層析色譜試紙法敏感性和特異性較差且費(fèi)用較高，另報(bào)告指出三種RDT(ParaSight-F ;0ptiMal ;ICT Pf/Pv)均顯示很高的假陽性和假陰性，假陽性高達(dá) 29. 2% (Rubio JM, et al·,Limited level of accuracyprovided by available rapid diagnosis tests for malaria enhances the need forPCR-based reference laboratories. J. Clin. Microbiol, July 2001,p. 2736-2737)。特別是治療后55%的病例在10-17天內(nèi)仍存在可檢出的抗原，而鏡檢法和PCR均陰性，表明誤診、漏診較多。因此RDT不能滿足瘧疾防治與研究中要求精確診斷的需要，也不能滿足臨床要求靈敏準(zhǔn)確地檢出各類病人的需要，不適用于要求檢出低原蟲血癥的藥物和疫苗研究、防治方案的考核評(píng)價(jià)和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)等(Metzger WG, Vivas-Martinez S, Rodriguez I, etal. , Malaria diagnosis under field conditions in tne Venezuelan Amazon, i'rans RSoc Trop Med Hyg. 20070ct 3 ；Tham, J. M. , Lee, S. H. , Tan, T. M C. , et al. , Detection andspecies determination of malaria parasites by PCR !comparison with microscopyand with parabight—F and ICT malaria Pf tests in a cl inical environment. Journalof Cl inical Microbiology. 199937 :1269-1273)。近十多年分子診斷技術(shù)的研究和應(yīng)用發(fā)展很快，PCR為基礎(chǔ)的診斷試驗(yàn)已公認(rèn) 是最有前途的新瘧疾診斷方法，其中套式PCR在檢出低原蟲血癥和混合感染的敏感性超 過鏡檢法及現(xiàn)有其他實(shí)驗(yàn)診斷方法。Zaman S, Tan L, Chen HH, et al. , The detectionof Plasmodium ialciparum and P.vivax in DNA—extracted olood samples usingpolymerase chain reaction (Trans R Soc Trop Med Hyg. 200195 :391-397)和 SinghB, Bobogare A, Cox-Singh J, Snounou G, Abdul Iah MS, Rahman HA. A genus—andspecies-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assayfor epidemiologic studies (Am J Trop Med Hyg. 1999Apr ；60(4) :687-92.)在痕疾流行病學(xué)、抗瘧藥物試驗(yàn)、疫苗研究、獻(xiàn)血員的篩選等方面已有應(yīng)用報(bào)告，在有條件的臨床實(shí)驗(yàn)室已開始用于瘧疾的確診和鑒別診斷Johnston等(美國(guó)⑶C 2006)提出應(yīng)當(dāng)考慮在參考實(shí)驗(yàn)室和一切具有分子實(shí)驗(yàn)基本條件的實(shí)驗(yàn)室采用套式PCR作為瘧疾的確診手段(btephanie P. Johnston,Norman J. Pieniazek,Maniphet V. Xayavong,busan B. blemenda,Patricia P. Wilkins, and Alexandre J. da Silva PCR as a Confirmatory Techniquefor Laboratory Diagnosis of Malaria Journal OF Clinical Microbiology,Mar. 2006,p. 1087-1089)。但是，現(xiàn)行套式PCR瘧疾診斷試驗(yàn)多數(shù)仍參照十多年前Snounou，G.，S.等(1993，1996)報(bào)告的傳統(tǒng)套式PCR方法，以小亞單位核糖體RNA(SSUrRNA)基因作為靶基因，檢出2種或2種以上人瘧原蟲，需使用I對(duì)屬特異引物和2-4對(duì)種特異引物；使用屬特異引物的第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物需移入2-4個(gè)新試劑管作為模板，分別用2-4對(duì)種特異引物作第二輪擴(kuò)增，一份血樣需要做3-5管擴(kuò)增，同時(shí)有2-4份擴(kuò)增產(chǎn)物需做電泳才能得出結(jié)果；試驗(yàn)時(shí)間最少需要一整天以上，且試劑和實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、步驟繁多，容易出錯(cuò)，也極易造成污染、以及嚴(yán)重的非特異擴(kuò)增常影響結(jié)果判斷，限制了高靈敏的套式PCR瘧疾診斷試驗(yàn)在瘧疾防治與研究領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為克服傳統(tǒng)套式PCR瘧疾診斷試驗(yàn)需多管兩步擴(kuò)増，試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，且試劑操作復(fù)雜，中間需開管加樣容易污染，ニ聚體等非特異擴(kuò)增嚴(yán)重影響結(jié)果判斷等缺陷；使試劑和操作標(biāo)準(zhǔn)化，統(tǒng)ー配制組合試劑，把絕大部分試劑操作完成在試劑盒預(yù)制階段，以確保試驗(yàn)的快速、重復(fù)性和降低檢測(cè)成本，提供ー種快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是①設(shè)計(jì)具有自我封閉功能的新型引物，這種新型引物的5’端均具有特殊設(shè)計(jì)的與3端(第1、2或3核苷酸起至第5-12核苷酸)互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，低于其退火溫度時(shí)它們的3’ 5’端互補(bǔ)退火形成自身封閉的ニ級(jí)結(jié)構(gòu)，有效地防止引物之間或引物與其他非靶核酸鏈之間錯(cuò)配退火；②選用位于多拷貝、短線狀(僅約6kb)的瘧原蟲線粒體基因組內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶(coxi)基因作靶基因，不僅有利于提高敏感性，且在反應(yīng)程序中可使用較低的解鏈溫度，使細(xì)胞核染色體基因組DNA處于未解鏈(或不充分解鏈)狀態(tài)，避免了特異引物與人或其他細(xì)胞核基因組DNA的錯(cuò)配； ③在COXl基因瘧原蟲屬、種特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)雙向半套式新型引物4個(gè)，通過試劑盒專用反應(yīng)體系和新型引物的特殊作用，成功組合為3對(duì)引物，其中I對(duì)屬特異引物，2對(duì)種特異引物；④革新緩沖系統(tǒng)建立模板制備緩沖液與組合試劑緩沖液互相配合的緩沖系統(tǒng)。通過上述多項(xiàng)創(chuàng)新技術(shù)的聯(lián)合作用實(shí)現(xiàn)單管套式/多重PCR —?dú)i完成擴(kuò)增，簡(jiǎn)化試劑和操作步驟，降低成本，同時(shí)進(jìn)ー步提高敏感性、特異性和穩(wěn)定性；研制出簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確而又價(jià)廉的單管一步法套式/多重PCR瘧疾診斷試劑盒，使瘧疾分子診斷試驗(yàn)?zāi)芡茝V應(yīng)用于一切有基本條件的實(shí)驗(yàn)室，為瘧疾臨床、流行病學(xué)調(diào)查研究、瘧疾監(jiān)測(cè)以及抗瘧藥和疫苗研制試驗(yàn)等領(lǐng)域提供ー個(gè)常規(guī)診斷、確診與鑒別診斷的可靠工具。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的ー種快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒，包括含了樣本模板DNA制備和檢測(cè)瘧原蟲DNA的套式PCR反應(yīng)所需的全套試劑，其組成包含①I X模板緩沖液I. 5ml X I支，可供制備20份濾紙血樣模板DNA ；②預(yù)裝套式PCR單ー組合加酶試劑10 μ 1X20管，可供檢測(cè)20份血樣，另設(shè)置非預(yù)裝管未加酶試劑盒，內(nèi)含套式PCR單ー組合未加酶試劑200 μ 1X1支，同樣可供檢測(cè)20份血樣。③陽性對(duì)照間日瘧原蟲陽性模板DNA IO μ I X I支；惡性瘧原蟲陽性模板DNAlO μ 1X1 支。自備試劑預(yù)裝管試劑盒只需自備純水和陰性對(duì)照的正常人濾紙血樣；非預(yù)裝管試劑盒則需另自備Taq酶。以上所述的I X模板緩沖液包括下列組分①20mmol/L Tris-HCl pH8. 4 ；②20mmol/L KCl，IOmmoI/L (NH4) 2SO4 ；③3. 2mmol/L MgCl2。以上所述的預(yù)裝套式PCR單ー組合試劑包含模板DNA和其它反應(yīng)組分①具有自我封閉功能的新型引物4條；②緩沖系統(tǒng)；③4 種核苷酸(4dNTP 各 200umol/L)；
④DNA 聚合酶(Taq 酶 O. 5U)；⑤石蠟油15 μ I。以上所述的新型引物是根據(jù)4種瘧原蟲線粒體細(xì)胞色素氧化酶(coxi)基因種、屬特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)，包括瘧原蟲屬特異新型引物一対，惡性瘧原蟲種特異新型引物ー個(gè)，間日瘧原蟲種特異新型引物ー個(gè)；在它們的5’端均具有特殊設(shè)計(jì)的與3端(第1、2或3核苷酸起至第5-12核苷酸)互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度低于其最佳退火溫度5-10°C或以下吋，引物5’ 3’端互補(bǔ)退火自我封閉，從而防止了引物-引物、引物與其他非靶核酸鏈之間的錯(cuò)配退火。以上所述的新型引物選用位于多拷貝、短線狀(約6kb)的瘧原蟲線粒體基因組內(nèi)coxi基因作靶基因，不僅有利于提高敏感性，且在反應(yīng)程序中可使用較低的解鏈溫度，使細(xì)胞核染色體基因組DNA處于未解鏈或不充分解鏈狀態(tài)，避免了特異引物與人或其他細(xì)胞核基因組DNA的錯(cuò)配。
以上所述的4條新型引物的序列為Umf-18685，CATGGCGCACACTTCCCTTCTCGCCATT 3，Umr-28385’ CTAAGAAGGTGTTATCCCCGGCGAACCTTCTTAC 3’Fmr-24965’ GATAATACATATCCATTAAGTAATGAAGGTATTATCA-3’Vmf-25395’ CGTCAGGATATAATTATAGATAACATTCCTGATAC 3’以上所述的緩沖系統(tǒng)包括下列組分①20mmol/L Tris-HCl pH 8. 4 ；②20mmol/L KCl ；③IOmmo I/L(NH4) 2SO4 ;④1%甲酰胺；⑤O. 075% Tween-20。以上所述的引物是根據(jù)coxi基因內(nèi)屬、種特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)的雙向半套式引物，通過試劑盒專用反應(yīng)體系和新型引物的特殊作用，組合為3對(duì)引物，其中瘧原蟲屬特異引物Umf-1868和Umr-2838的濃度均為105nmol/L ;惡性瘧原蟲種特異引物Fmr_2496的濃度為105nmol/L ;間日瘧原蟲種特異引物Vmf-2539的濃度為87. 5nmol/L。ー種快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒的檢測(cè)方法，包括樣本模板DNA制備、PCR擴(kuò)增反應(yīng)和產(chǎn)物電泳分析鑒定；以上所述的樣本模板DNA制備，包括如下步驟①采用濾紙法采集血樣，自然風(fēng)干后可室溫郵寄；干燥條件下4°C可長(zhǎng)期保存；②濾紙血樣用打孔器打出6mm直徑園片，放入0.5ml錐形管內(nèi)，加入O. IX模板緩沖液400 μ I浸泡5-10分鐘，離心洗脫血紅蛋白，吸去全部上清；③重新加入I X模板緩沖液30 μ 1，置入微量加熱器，95°C加熱10分鐘，期間漩渦震蕩30秒X2次；簡(jiǎn)短離心10秒，吸取上清作為PCR模板DNA ;或放入4°C冰箱保存?zhèn)溆茫褂们氨仨氈匦录訜?5°C，時(shí)間5-10分鐘，漩渦震蕩30秒，簡(jiǎn)短離心后，再吸取上清作PCR模板。以上所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)只進(jìn)行一次加樣操作，先從試劑盒內(nèi)取出所需的凍存預(yù)裝試劑PCR管，每管含單ー組合試劑10 μ 1，點(diǎn)動(dòng)離心使試劑集中管底井置回冰盒，吸取上述制備的模板DNA 5 μ I加至PCR管底部，再次點(diǎn)動(dòng)離心置回冰盒，傳遞至擴(kuò)增室，按預(yù)編PCR程序上機(jī)連續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)49個(gè)循環(huán)得到擴(kuò)增產(chǎn)物。以上所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)49個(gè)循環(huán)的反應(yīng)條件如下起始解鏈溫度(94/90s)第1-14 循環(huán)(94で /10s,70°C /15s,67°C /15s,62°C /01s,72°C /60s) X 14 ；第1δ-18 循環(huán)(86 °C /05s,62 °C /10s,58 °C /10s,72 °C /60s,86 °C /05s ；65°C /20s，72°C /40s) X4 ；第19-48 循環(huán)(86で /05s, 70°C /02s，65で /20s, 72°C /40s) X 30 ；

第49 循環(huán)(72°C /3，，10。。/3，)XI。④擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10-15 μ I作2%瓊脂糖凝膠電泳，在248um紫外透射分析儀或凝膠成像分析儀上觀察和攝像。采用花青核酸染料染色，染色采用后染法即泡染法或膠染法；作蟲種鑒定，必須采用后染法進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析鑒定，以便根據(jù)片段的大小正確判定蟲種。以上所述的電泳分析鑒定，結(jié)果是瘧原蟲陽性有三種條帶人瘧原蟲屬公共帯971bp,惡性痕原蟲特異帶629bp,間日痕原蟲特異帶300bp ;各條帶之間距離300bp以上,極易鑒別；健康人血樣陰性對(duì)照不出現(xiàn)IOObp以上的任何擴(kuò)增條帶只有較輕的60-70bp的ニ聚體積累帶，不會(huì)影響結(jié)果判斷。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果I、本發(fā)明專為快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒設(shè)計(jì)的預(yù)裝套式PCR單ー組合試劑反應(yīng)管(簡(jiǎn)稱預(yù)裝管)，它包含了除模板DNA外原來2輪PCR所需的所有組分，包括新型引物(瘧原蟲屬特異一対，惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲種特異引物各ー個(gè))，專用的緩沖系統(tǒng)，4dNTP，Taq酶和石蠟油等；嚴(yán)格定量集合了于ー個(gè)預(yù)裝管內(nèi)，應(yīng)用時(shí)每管只需加入按照說明提取的濾紙血樣模板DNA 5 μ 1，即可上機(jī)反應(yīng)，連續(xù)擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)約需I小時(shí)50分鐘；從而在保證高靈敏、高特異和高度穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，在高度簡(jiǎn)化試劑和操作的同時(shí)，大大縮短了出結(jié)果的報(bào)告時(shí)間；適用于具備PCR儀和電泳設(shè)備的各級(jí)實(shí)驗(yàn)室，為瘧疾臨床、流行病學(xué)調(diào)查研究、瘧疾監(jiān)測(cè)以及抗瘧藥和疫苗研制試驗(yàn)等領(lǐng)域提供ー個(gè)常規(guī)診斷、確診與鑒別診斷的有力工具。2、本發(fā)明所述的新型引物5’端均具有獨(dú)特設(shè)計(jì)的與3端(第1、2或3核苷酸起至第5-12核苷酸)互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，低于其退火溫度時(shí)它們的3’ 5’端互補(bǔ)退火形成自身封閉的ニ級(jí)結(jié)構(gòu)，有效地防止引物之間或引物與其他非靶核酸鏈之間錯(cuò)配退火產(chǎn)生的ニ聚體等非特異擴(kuò)增產(chǎn)物；3、本發(fā)明選用位于多拷貝、短線狀(僅約6kb)的瘧原蟲線粒體基因組內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶基因(coxi)作靶基因，不僅有利于提高敏感性，且在反應(yīng)程序中可使用較低的解鏈溫度，使細(xì)胞核染色體基因組DNA處于未解鏈(或不充分解鏈)狀態(tài)，進(jìn)ー步減少了特異引物與人或其他細(xì)胞核基因組DNA的錯(cuò)配退火引發(fā)的非特異擴(kuò)增的機(jī)會(huì)。3、本發(fā)明提供ー種簡(jiǎn)易而又高效的濾紙血樣模板DNA制備方法包括特制的模板緩沖液，使濾紙血樣模板DNA制備時(shí)間縮短到30分鐘之內(nèi)，即使僅含I個(gè)蟲/μ I的微量DNA血樣也能提取檢出。如果少數(shù)幾份血樣完全可能在半天內(nèi)(4小吋)出結(jié)果。實(shí)現(xiàn)單管套式/多重PCR —?dú)i完成擴(kuò)增，減少了擴(kuò)增產(chǎn)物污染機(jī)會(huì)，實(shí)現(xiàn)高敏感性、特異性和穩(wěn)定性，不僅可同時(shí)檢出并鑒定惡性瘧原蟲和/或間日瘧原蟲単獨(dú)或混合感染，還能檢出其他兩種人瘧原蟲(三日瘧，卵形瘧)単獨(dú)感染；是ー種操作簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確而又快速的檢測(cè)方法。4、本試劑盒適用于檢測(cè)濾紙血樣本，也適用于檢測(cè)其他方法提取的DNA。5、本診斷試劑盒成本低，穩(wěn)定性好，容易保存，適應(yīng)エ業(yè)化生產(chǎn)，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。


圖I :雙向半套式引物設(shè)計(jì)示意圖。附圖I的說明帶數(shù)字的半箭頭分別代表4個(gè)引物在coxi基因的種、屬特異位點(diǎn)，橫實(shí)線分別代表3個(gè)擴(kuò)增片段。圖2 :應(yīng)用快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒檢測(cè)系列稀釋惡性瘧和間日瘧原蟲 感染血樣的電泳圖譜。附圖2的說明M = DNA標(biāo)志，F(xiàn) =惡性瘧原蟲，V =間日瘧原蟲，W = 10000個(gè)蟲/μ I,Q = 1000 個(gè)蟲/μ 1，B = 100 個(gè)蟲/μ 1，10 = 10 個(gè)蟲/μ 1,1 = I 個(gè)蟲/μ 1，O =健康人濾紙血樣模板(陰性對(duì)照)。圖3 :應(yīng)用快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒檢測(cè)瘧疾病人和疑似瘧疾病人血樣的電泳圖譜。附圖3的說明M = DNA分子量標(biāo)志；單純惡性瘧感染共9例(6368199S67151485051FQ+)均同時(shí)出現(xiàn)971bp和629bp的兩條帶;單純間日瘧感染共21例，其中 11 例(S4246608011115916320121217844)同時(shí)出現(xiàn) 971bp 和 300bp 的兩條帶；另10例(10317217387150153160169202VW+)只有300bp的一條帶；惡性瘧與間日瘧混合感染
I例(158)同時(shí)出現(xiàn) 971bp、629bp 和 300bp 的三條帶；陰性 7 例(2672682692702712720)除有少量ニ聚體(く IOObp)外無任何非特異擴(kuò)増。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :應(yīng)用快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒檢出惡性瘧和間日瘧原蟲——敏感度檢測(cè)，結(jié)果見圖2。模擬瘧原蟲密度梯度感染血濾紙血樣的制備分別從靜脈采集鏡檢確診單純惡性瘧和單純間日瘧感染病人(原蟲密度10000個(gè)蟲/μ I血以上)含蟲全血各ー份，用健康人抗凝全血按10倍系列稀釋法分別稀釋上述惡性瘧和間日瘧含蟲血，獲得10000/μ 1，1000/μ 1，100/μ 1，10/μ 1，I/μ I梯度含蟲血，用移液器定量滴制瘧原蟲密度梯度含蟲血濾紙血樣(5 μ I/每片6_直徑濾紙圓片)，自然風(fēng)干后分裝密封管4°C保存?zhèn)溆谩V紙血樣DNA模板的制備上述瘧原蟲密度梯度濾紙血樣每片放入I個(gè)標(biāo)志含蟲密度的O. 5ml錐形管內(nèi)，加入O. I X模板緩沖液400 μ I浸泡5_10分鐘，離心洗脫血紅蛋白，吸去全部上清；重新加入IX模板緩沖液30μ 1，置入微量加熱器，95°C加熱10分鐘，期間漩渦震蕩30秒X 2次；簡(jiǎn)短離心10秒，吸取上清作為PCR模板DNA ;或放入4°C冰箱保存?zhèn)溆?，但使用前必須重新加?5°C,加熱時(shí)間5-10分鐘,鏇渦震蕩30秒,簡(jiǎn)短離心后,再吸取上清作PCR模板。單管ー步法套式PCR試驗(yàn)步驟自試劑盒內(nèi)取出所需的凍存預(yù)裝PCR試劑管(每管含單ー組合加酶試劑10 μ I)，用記號(hào)筆逐管標(biāo)志原蟲密度，點(diǎn)動(dòng)離心使試劑集中管底井置回冰盒，依次吸取上述制備的原蟲密度梯度模板DNA 5μ I加至對(duì)應(yīng)標(biāo)志PCR管底部，再次點(diǎn)動(dòng)離心置回冰盒，傳遞至擴(kuò)增室，即可按下列預(yù)編PCR程序上機(jī)連續(xù)反應(yīng)49個(gè)循環(huán)。起始解鏈溫度(94/90s)第1-14 循環(huán)(94で /10s，70°C /15s,67°C /15s,62°C /01s,72°C /60s) X 14 ；第1δ-18 循環(huán)(86 0C /05s,62 °C /10s,58 °C /10s,72 °C /60s,86 °C /05s ；65°C /20s，72°C /40s) X4 ；第19-48 循環(huán)(86で /05s, 70°C /02s，65で /20s, 72°C /40s) X 30 ；第49 循環(huán)(72°C /3，，10。。/3，)XI。每次試驗(yàn)除待檢樣本外，另設(shè)陽性(惡性瘧和間日瘧病人血樣)和陰性(健康人血樣)模板各I管；電泳鑒定取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10-15 μ I作2%瓊脂糖凝膠電泳，在248um紫外透射分析儀上觀察和攝像。瘧原蟲陽性可出現(xiàn)三種條帶類型人瘧原蟲屬公共帶971bp，惡性瘧原蟲特異帶629bp,間日痕原蟲特異帶300bp ;各條帶之間距離300bp以上,極易鑒別。單純惡性痕感染可同時(shí)出現(xiàn)971bp和629bp兩條帶,或只有629bp—條帶(原蟲密度較低100個(gè)蟲以下);單純間日痕感染可同時(shí)出現(xiàn)971bp和300bp兩條帶,或只有300bp—條帶(原蟲密度較低100個(gè)蟲以下);惡性瘧與間日瘧混合感染可同時(shí)出現(xiàn)971bp、629bp和300bp三條帶；或629bp和300bp兩條種特異帶。單純?nèi)寨懟蚵研委懜腥緝H出現(xiàn)971bp —條帶；非瘧疾病人或健康人血樣除少量ニ聚體(60_70bp)之外，不出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帯。實(shí)施例2 :應(yīng)用快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒檢出惡性瘧和間日瘧原蟲——在瘧疾監(jiān)測(cè)中檢測(cè)瘧疾發(fā)熱病人血樣，結(jié)果見圖3。血樣采集用濾紙法采集臨床診斷瘧疾、疑似瘧疾病人血液樣本，常規(guī)消毒耳垂或指端刺血均可，濾紙片中央直接接觸血滴，使血液滲透濾紙達(dá)2-4cm直徑，自然風(fēng)干后用白紙間隔放入薄膜袋內(nèi)，可室溫郵寄或4°C保存；或用活頁紙打孔器，打出6_直徑小圓片(約含4-5 μ I全血)，置O. 5-1. 5ml錐型管內(nèi)4°C保存。濾紙血樣DNA模板的制備濾紙血樣用打孔器打出6mm直徑圓片,放入O. 5ml錐形管內(nèi)，加入O. IX模板緩沖液400 μ I浸泡5-10分鐘，離心洗脫血紅蛋白，吸去全部上清；重新加入I X模板緩沖液30 μ 1，置入微量加熱器，95°C加熱10分鐘，期間漩渦震蕩30秒X 2次；簡(jiǎn)短離心10秒，吸取上清作為PCR模板DNA ;或放入4°C冰箱保存?zhèn)溆?，但使用前必須重新加?5°C，加熱時(shí)間5-10分鐘，漩渦震蕩30秒，簡(jiǎn)短離心后，再吸取上清作PCR模板。單管ー步法套式PCR試驗(yàn)步驟批量檢測(cè)大量樣本時(shí)，可使用未加酶的凍存單ー組合試劑，以下在冰盒上操作，根據(jù)樣本數(shù)(η) ΧΙΟμ I吸取所需量組合試劑至另管中，カロ入所需Taq酶=η X O. 5U,簡(jiǎn)短振蕩混勻尚心后按姆管10 μ I分布各已標(biāo)志PCR管并置回冰盒，吸取上述制備的模板DNA 5 μ I加至對(duì)應(yīng)編號(hào)PCR管底部，再次點(diǎn)動(dòng)離心置回冰盒，傳遞至擴(kuò)增室，即可按下列預(yù)編PCR程序上機(jī)連續(xù)反應(yīng)49個(gè)循環(huán)。 始解鏈溫度(94/90s)
第1-14 循環(huán)(94で /10s,70°C /15s,67°C /15s,62°C /01s,72°C /60s) X 14 ；第1δ-18 循環(huán)(86 °C /05s,62 °C /10s,58 °C /10s,72 °C /60s,86 °C /05s ；65°C /20s，72°C /40s) X4 ；第19-48 循環(huán)(86で /05s, 70°C /02s，65で /20s, 72°C /40s) X 30 ；第49 循環(huán)(72°C /3’ ；10°C /3’)XI。每次試驗(yàn)除待檢樣本外，另設(shè)陽性(惡性瘧和間日瘧 病人血樣)和陰性(健康人血樣)模板各I管；電泳鑒定取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10-15 μ I作2%瓊脂糖凝膠電泳，在248um紫外透射分析儀上觀察和攝像。瘧原蟲陽性可出現(xiàn)三種條帶類型人瘧原蟲屬公共帶971bp，惡性瘧原蟲特異帶629bp,間日痕原蟲特異帶300bp ;各條帶之間距離300bp以上,極易鑒別。單純惡性痕感染可同時(shí)出現(xiàn)971bp和629bp兩條帶,或只有629bp—條帶(原蟲密度較低100個(gè)蟲以下);單純間日痕感染可同時(shí)出現(xiàn)971bp和300bp兩條帶,或只有300bp—條帶(原蟲密度較低100個(gè)蟲以下);惡性瘧與間日瘧混合感染可同時(shí)出現(xiàn)971bp、629bp和300bp三條帶；或629bp和300bp兩條種特異帶。單純?nèi)蘸刍蚵研魏鄹腥緝H出現(xiàn)971bp—條帶；非瘧疾病人或健康人血樣除少量ニ聚體(60_70bp)之外，不出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帯。
權(quán)利要求
1.ー種快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒，其特征在于試劑盒包含了樣本模板DNA制備和檢測(cè)瘧原蟲DNA的套式PCR反應(yīng)所需的全套試劑，其組成包含 ①IX模板緩沖液I. 5ml X I支； ②預(yù)裝套式PCR單ー組合加酶試劑10μ I X 20管； ③陽性對(duì)照間日瘧和惡性瘧陽性濾紙血模板DNA10 μ I各一支。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒，其特征在于所述的 IX模板緩沖液包括下列組分①20mmol/L Tris-HCl pH8. 4 ；②20mmol/L KCl, IOmmoI/L (NH4) 2SO4 ；③ 3. 2mmol/L MgCl2。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒，其特征在于所述的預(yù)裝套式PCR單ー組合試劑包含模板DNA和其它反應(yīng)組分 ①具有自我封閉功能的新型引物4條； ②緩沖系統(tǒng)； ③4種核苷酸(4dNTP各200umol/L)； ④DNA聚合酶(Taq酶O.5 U); ⑤石臘油15μ I。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒，其特征在干所述的引物是根據(jù)4種瘧原蟲線粒體細(xì)胞色素氧化酶(coxi)基因內(nèi)屬、種特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)，包括瘧原蟲屬特異新型引物一対，惡性瘧原蟲種特異新型引物ー個(gè)，間日瘧原蟲種特異新型引物一個(gè)；在它們的5’端均具有特殊設(shè)計(jì)的與3端(第1、2或3核苷酸起至第5-12核苷酸)互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度低于其最佳退火溫度5-10°C或以下時(shí)，引物5’ 3’端互補(bǔ)退火自我封閉，從而防止了引物-引物、引物與其他非靶核酸鏈之間的錯(cuò)配退火。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒，其特征在干所述的引物序列為Umf-I868 5’ CATGGCGCACACTTCCCTTCTCGCCATT 3’Umr-2838 5’ CTAAGAAGGTGTTATCCCCGGCGAACCTTCTTAC 3’Fmr-2496 5’ GATAATACATATCCATTAAGTAATGAAGGTATTATCA-3’Vmf-2539 5’ CGTCAGGATATAATTATAGATAACATTCCTGATAC 3’ 。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒，其特征在干所述的緩沖系統(tǒng)包括下列組分①20 mmol/L Tris-HCl pH 8. 4 ；②20 mmol/L KCl ；③10 mmol/L (NH4)2SO4 ； ④1%甲酰胺；⑤O. 075% Tween-20。
7.根據(jù)權(quán)利要求3、4和5任一項(xiàng)所述的快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒，其特征在于所述的引物組合為3對(duì)，其中瘧原蟲屬特異引物Umf-1868和Umr-2838的濃度均為105 nmol/L ;惡性瘧原蟲種特異引物Fmr-2496的濃度為105 nmol/L ;間日瘧原蟲種特異引物 Vmf-2539 的濃度為 87. 5 nmol/L。
8.ー種快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于包括樣本模板DNA制備、PCR擴(kuò)增反應(yīng)和擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析鑒定； 所述的樣本模板DNA制備，包括如下步驟 ①采用濾紙法采集血樣，自然風(fēng)干后可室溫郵寄；干燥條件下4°C可長(zhǎng)期保存； ②濾紙血樣用打孔器打出6mm直徑園片，放入O.5 ml錐形管內(nèi)，加入O. I X模板緩沖液400 μ I浸泡5-10分鐘，離心洗脫血紅蛋白，吸去全部上清； ③重新加入IX模板緩沖液30 μ 1，置入微量加熱器，95°C加熱10分鐘，期間漩渦震蕩30秒X 2次；簡(jiǎn)短離心10秒，吸取上清作為PCR模板DNA ;或放入4°C冰箱保存?zhèn)溆?，使用前必須重新加?5°C，時(shí)間5-10分鐘，漩渦震蕩30秒，簡(jiǎn)短離心后，再吸取上清作PCR模板。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)只進(jìn)行一次加樣操作，先從試劑盒內(nèi)取出所需的凍存預(yù)裝試劑PCR管，每管含單ー組合試劑10 μ 1，點(diǎn)動(dòng)離心使試劑集中管底井置回冰盒，吸取上述制備的模板DNA 5 μ I加至PCR管底部，再次點(diǎn)動(dòng)離心置回冰盒，傳遞至擴(kuò)增室，按預(yù)編PCR程序上機(jī)連續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)49個(gè)循環(huán)得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)49個(gè)循環(huán)的反應(yīng)條件如下 起始解鏈溫度(94/90s)第 1-14 循環(huán)(94で / IOs, 700C /15s,67°C /15s,62°C /01s,72°C /60s) X 14 ；第 15-18 循環(huán)(86 で /05s, 62 0C /10s，58 で /10s，72 で /60s, 86 °C /05s ；65 V /20s,72V /40s) X 4 ；第 19-48 循環(huán)(86で /05s, 70°C /02s,65°C /20s,72°C /40s) X 30 ； 第 49 循環(huán)(72°C /3’ ；10°C /3’)XI。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析鑒定，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10-15 μ I作2%瓊脂糖凝膠電泳，在248um紫外透射分析儀或凝膠成像分析儀上觀察和攝像；采用花青核酸染料染色，染色采用后染法即泡染法或膠染法；作蟲種鑒定，必須采用后染法進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析鑒定。
12.根據(jù)權(quán)利要求8或11所述的快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析鑒定，結(jié)果是瘧原蟲陽性有三種條帶人瘧原蟲屬公共帶971 bp,惡性瘧原蟲特異帶629 bp,間日瘧原蟲特異帶300 bp ;健康人血樣陰性對(duì)照不出現(xiàn)100 bp以上的任何擴(kuò)增條帶，只有較輕的60-70 bp的ニ聚體積累帶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速套式PCR瘧疾分子診斷試劑盒及檢測(cè)方法，包括具有自我封閉功能的新型引物，選用瘧原蟲線粒體基因組內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶基因(cox1)作靶基因，在瘧原蟲屬、種特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)雙向半套式引物4個(gè)，組合成1對(duì)屬特異和2個(gè)種特異引物；使試劑復(fù)雜操作繁重的傳統(tǒng)套式/多重PCR簡(jiǎn)化為單一試劑、單管一步反應(yīng)，可同時(shí)檢出和鑒定惡性瘧與間日瘧原蟲單獨(dú)或混合的感染和三日瘧和卵形瘧的單獨(dú)感染，其敏感性與特異性均超過顯微鏡檢查法，達(dá)到可檢出1個(gè)蟲/每μl血的水平。是各級(jí)醫(yī)院瘧疾確診和鑒別診斷的可靠手段，也為瘧疾防治監(jiān)測(cè)、抗瘧藥物試驗(yàn)和瘧疾疫苗研究以及獻(xiàn)血員篩選提供一個(gè)簡(jiǎn)易、經(jīng)濟(jì)、靈敏、準(zhǔn)確的瘧疾診斷工具。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102676651SQ20121006113
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月9日
發(fā)明者郭傳坤, 黃天誼, 黎學(xué)銘 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心