專利名稱：從麥曲中提取微生物總dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸提取技術(shù)，尤其是指從固體麥曲中提取微生物總DNA。
背景技術(shù)：
黃酒與啤酒、葡萄酒并稱為世界三大發(fā)酵古酒，黃酒源于中國，有文字記載的釀酒歷史達(dá)2500年，享有“國酒”的美譽(yù)。黃酒低耗糧、低酒度、高營養(yǎng)，是一種集營養(yǎng)和保健為一體的釀造酒，并具有烹飪、藥用等功效，符合酒類市場低度、營養(yǎng)、保健的消費(fèi)趨勢，因而被國家列為重點(diǎn)扶植和發(fā)展的飲料酒之一。從2002年起，我國黃酒的產(chǎn)量每年都以兩位數(shù)的速度增長，2005年國內(nèi)黃酒產(chǎn)量突破200萬噸。黃酒自身源遠(yuǎn)流長的釀造工藝相當(dāng)復(fù)雜而獨(dú)特，堪稱世界一絕，而麥曲又是中國黃酒生產(chǎn)敞開式發(fā)酵最為經(jīng)典和獨(dú)創(chuàng)之作。麥曲是小麥經(jīng)軋碎加水制成塊狀，在夏末初秋的氣候下，對自然生境中的多種微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，形成了包含所產(chǎn)生各種酶及代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)物體系。而正是源于多菌種多酶系及其協(xié)同作用形成的豐富的代謝產(chǎn)物奠定了黃酒的品質(zhì)和風(fēng)格。處于這些不同釀造環(huán)境中的微生物，在生產(chǎn)過程中通過不同的代謝途徑相互組合、切斷、阻遏和調(diào)節(jié)，完成了多種微生物混合發(fā)酵過程的復(fù)雜代謝和代謝產(chǎn)物的多樣性，富集了大量讓酒出香顯味的物質(zhì)和前體，而正是這些才形成了具有數(shù)千年酒文化歷史且只有中國有之的黃酒的特殊魅力?？梢哉f，參與黃酒釀造過程的多種微生物是黃酒典型的特征和獨(dú)一無二的資源，是黃酒生產(chǎn)和發(fā)展的基礎(chǔ)。對這些釀酒微生物進(jìn)行研究和發(fā)掘，對黃酒的資源保護(hù)以及科學(xué)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展均有重要的價(jià)值。釀造黃酒離不開乳酸菌參與生化反應(yīng)，在一定程度上由乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸與酵母發(fā)酵生成的酒精反應(yīng)生成乳酸乙酯的含量，決定了黃酒的風(fēng)味。乳酸菌群與酵母菌、曲霉菌共同參與黃酒發(fā)酵，俗稱“三邊發(fā)酵”。在黃酒發(fā)酵過程中，降低和維持低PH值，形成黃酒中有效成分乳酸。黃酒為開放式發(fā)酵，而乳酸桿菌的大量生長，能夠產(chǎn)生并累積乳桿菌素以及維持低PH值，抑制其他細(xì)菌的生長繁殖，而對酵母無抑制作用。在黃酒前發(fā)酵與主發(fā)酵期間，主要是高溫乳酸菌生長、繁殖、發(fā)酵。而在釀酒發(fā)酵的后期，主要是低溫乳酸菌群的生長、繁殖、發(fā)酵。由于厭氧乳酸菌的繁殖，代謝產(chǎn)生較多乳酸，使酒醪酸度上升，有效地抑制了其他的部分雜菌的代謝活動。同時(shí)在乳酸菌生長代謝過程中，會產(chǎn)生一些具有抗微生物活性的物質(zhì)，如有機(jī)酸、過氧化氫、二氧化碳等。這些物質(zhì)均在體外表現(xiàn)出抑菌活性，而且很多乳酸菌都能產(chǎn)生細(xì)菌素，如乳鏈菌素、噬酸菌素、乳酸桿菌素等，這些物質(zhì)在保持和改善黃酒釀造微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定與協(xié)調(diào)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。而且在后發(fā)酵中由于醪溫降低，形成部分高溫乳酸菌死亡、自溶，給酵母和低溫乳酸菌發(fā)酵提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。建國以來對于黃酒制曲、制酒以及地域環(huán)境中的微生物，已有了許多研究并取得了一定成果。但是這些研究都是采用的傳統(tǒng)技術(shù)和方法，如先分離再用培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株、以及采用平板計(jì)數(shù)和生物量測定等分析方法，而這些方法都有著自身的局限性和偏差性。一方面，參與黃釀造過程的微生物多種多樣，而目前能分離得到的不過三百余種，還有大量菌株是不可分離和培養(yǎng)的，這些微生物變成了研究的盲區(qū)，但是這其中有許多可能是參與釀造的關(guān)鍵所在。隨著高通量測序技術(shù)和宏基因組學(xué)研究的興起，目前的技術(shù)已經(jīng)能對不能分離培養(yǎng)的微生物進(jìn)行基因分析，然而如何從固體的麥曲中，將所有微生物的DNA都有效的提取出來，以及避免麥曲本身小麥的基因組污染，以防止測序時(shí)，產(chǎn)生大量的小麥基因組數(shù)據(jù)，成為了目前的技術(shù)關(guān)鍵?，F(xiàn)有的一些核酸提取試劑盒，有從土壤、糞便等提取細(xì)菌總 DNA，但尚未出現(xiàn)針對釀酒麥曲中提取所有細(xì)菌以及真菌的DNA提取試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能提取麥曲中所有細(xì)菌以及真菌的基因組 DNA的方法，其能實(shí)現(xiàn)小麥的DNA污染非常低，并且成本低廉，得到的DNA總量高，足夠用于后續(xù)的高通量測序，real time PCR鑒定等研究。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種從麥曲中提取微生物總DNA的方法，依次包括以下步驟①、向Ig固體麥曲中加入2. 5 3. 5ml的Tris-EDTA浸泡，均勻混合后靜置；吸取浸泡液；將浸泡液低速離心，得首次上清液(低速離心的目的是將一些固體顆粒除去，而細(xì)菌比較小，在低速離心下，不會沉淀下來，所以還在首次上清液中)；將首次上清液高速離心，得沉淀(高速離心將所有細(xì)菌都離心下來，然后重懸于后續(xù)少量的TriS-EDTA中，目的是濃縮體積)；將沉淀重懸在180 220 ill的Tris-EDTA中，均勻混合；②、將20ul濃度為15-20mg/ml的溶菌酶和20ul濃度為15_20mg/ml蛋白酶K加入到步驟①所得的產(chǎn)物中，于36. 5 37. 5°C孵育20 40min ;備注說明溶菌酶、蛋白酶K 均用Tris-EDTA來配制；③、向步驟②所得的產(chǎn)物中加入50 70iU質(zhì)量濃度為10%的SDS (十二烷基磺酸鈉)溶液，于36. 5 37. 5°C孵育20 40min ；④、向步驟③所得的產(chǎn)物中加入140 160 ill濃度為5mol/l的NaCl溶液，渦旋震蕩，混勻；再加入140 150iU提前預(yù)熱至60 70°C的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)， 于60 70°C孵育I 13min ；⑤、向步驟④所得的產(chǎn)物中加入等體積的試劑混合液(即，試劑混合液與步驟④ 所得的產(chǎn)物的體積比為I : I)，上下顛倒混勻，于3 5°C 10000 14000rcf/min離心10 20min;所述試劑混合液由酚氯仿異丙醇按照25 24 I的體積比混合而得；⑥、將步驟⑤離心所得的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管并加入等體積氯仿(即，氯仿與步驟⑤離心所得的上清液的體積比為I : I),于3 5°C 10000 14000rcf/min離心 10 20min ；⑦、將步驟⑥離心所得的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管并加入400 600iU的異丙醇，上下顛倒混勻后，-18 -22°C沉淀30 40min ；⑧、將步驟⑦的所得物于3 5°C 10000 14000rcf/min離心10 20min,去上清；再加入體積濃度為70 80%的乙醇0. 8 I. 2ml，于3 5°C 10000 14000rcf/min 離心10 20min ;去上清，并在室溫下干燥10 20min ；⑨、在步驟⑧所得的沉淀中加入50 100 ill的Tris-EDTA溶解后，取I U I測濃度，其余于_20°C保存?zhèn)溆谩Ｗ鳛楸景l(fā)明的從麥曲中提取微生物總DNA的方法的改進(jìn)步驟①低速離心為 300 500rcf/min 離心 4 6min ;高速離心為 12000 14000rcf/min 離心 0. 8 I. 2min。本發(fā)明的從麥曲中提取微生物總DNA的方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)I、成本低廉，平均提取每樣品不足2元；2、得率高，從Ig麥曲中，可以提取到4. 6ug以上的微生物總DNA ；3、質(zhì)量好，蛋白質(zhì)污染少，提取到的DNA的260/280值都在2. 0左右；綜上所述，本發(fā)明提供了一種可以從黃酒釀造的麥曲中，提取所有細(xì)菌以及真菌的總DNA的方法，該方法成本低、提取的DNA得率高、污染低；適合為大規(guī)模麥曲的微生物研究做樣品準(zhǔn)備工作；也可以為進(jìn)一步研制相應(yīng)的快速提取試劑盒提供研究基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I、從麥曲中提取微生物總DNA的方法，分別用麥曲自然發(fā)酵1-6天，共6個樣本，編號分別為kql, kq2, kq3, kq4, kq5, kq6 ;對上述6個樣本分別進(jìn)行以下步驟的操作①、無菌條件下，在超凈工作臺各稱取麥曲固體樣本lg，加入3ml TE(Tris-EDTA)， 上下顛倒5次混勻并靜置5min。吸取液體部分(即浸泡液)，400rcf/min離心5min,得首次上清液。吸取首次上清液轉(zhuǎn)移到新的管子中，13000rcf/min離心Imin ;棄去上清,將沉淀重懸在200 的TE中，渦旋震蕩混勻。TE為Tris-EDTA簡稱，為公知技術(shù)。例如可按照以下方法進(jìn)行配制Iml IM Tris-HCl加0. 2ml 0. 5M EDTA，加18. 2M歐姆的超純水定容至100ml。②、將20 ii L濃度為15mg/ml的溶菌酶與20 U I的濃度為15mg/ml的蛋白酶K加入到步驟①所得產(chǎn)物中，37°C孵育30min;備注說明上述溶菌酶和蛋白酶K均用TE進(jìn)行稀釋。③、向步驟②所得的產(chǎn)物中加入60 ill質(zhì)量濃度為10%的SDS，并在37°C孵育 30min ；④、向步驟③所得的產(chǎn)物中加入160 U I濃度為5mol/l的NaCl，渦旋震蕩，混勻； 再加入144 ill提前預(yù)熱至65°C的CTAB，65°C下孵育IOmin ；⑤、向步驟④所得產(chǎn)物中加入等體積的試劑混合液(由酚氯仿異丙醇= 25 : 24 : I的體積比混合而得)，上下顛倒8次混勻，4°C 12000rcf/min離心15min ;⑥、將步驟⑤離心所得的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管并加入等體積氯仿， 4°C 12000rcf/min 離心 15min ；⑦、將步驟⑥離心所得的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管并加入500 U I異丙醇，上下顛倒 5 次，_20°C沉淀 35min ；⑧、將步驟⑦的所得物取出后4°C下12000rcf/min離心lOmin，去上清，再加入 Iml 75% (體積濃度)的乙醇，4°C下12000rcf/min離心IOmin ;去上清,并在室溫下干燥 15min ；⑨、在步驟⑧所得的沉淀中加入TE定容至80 iil，溶解后，取I ill測濃度，其余于-20°C保存?zhèn)溆?。⑩、用NanoDrop測得濃度為表I所示
表I
權(quán)利要求
1.從麥曲中提取微生物總DNA的方法，其特征是依次包括以下步驟①、向Ig固體麥曲中加入2.5 3. 5ml的Tris-EDTA浸泡，均勻混合后靜置；吸取浸泡液；將浸泡液低速離心，得首次上清液；將首次上清液高速離心，得沉淀；將沉淀重懸在180 220 μ I的Tris-EDTA中，均勻混合；②、將20ul濃度為15-20mg/ml的溶菌酶和20ul濃度為15_20mg/ml蛋白酶K加入到步驟①所得的產(chǎn)物中，于36. 5 37. 5°C孵育20 40min ；③、向步驟②所得的產(chǎn)物中加入50 70μ I質(zhì)量濃度為10%的SDS溶液，于36. 5 37. 5°C 孵育 20 40min ；④、向步驟③所得的產(chǎn)物中加入140 160μ I濃度為5mol/l的NaCl溶液，渦旋震蕩， 混勻；再加入140 150 μ I提前預(yù)熱至60 70°C的CTAB，于60 70°C孵育7 13min ；⑤、向步驟④所得的產(chǎn)物中加入等體積的試劑混合液，上下顛倒混勻，于3 5°C 10000 14000rcf/min離心10 20min ;所述試劑混合液由酹氯仿異丙醇按照 25 : 24 : I的體積比混合而得；⑥、將步驟⑤離心所得的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管并加入等體積氯仿，于3 5°C 10000 14000rcf/min 離心 10 20min ；⑦、將步驟⑥離心所得的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管并加入400 600μ I的異丙醇，上下顛倒混勻后，-18 -22 沉淀30 40min ；⑧、將步驟⑦的所得物于3 5°C10000 14000rcf/min離心10 20min,去上清；再加入體積濃度為70 80 %的乙醇O. 8 I. 2ml,于3 5°C 10000 14000rcf/min離心 10 20min ;去上清，并在室溫下干燥10 20min ；⑨、在步驟⑧所得的沉淀中加入50 100μ I的Tris-EDTA溶解后，取I μ I測濃度，其余于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從麥曲中提取微生物總DNA的方法，其特征是所述步驟①低速離心為300 500rcf/min離心4 6min ；高速離心為12000 14000rcf/min 離心 O. 8 I. 2min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從麥曲中提取微生物總DNA的方法，包括以下步驟①向固體麥曲中加入Tris-EDTA浸泡，浸泡液多次離心，所得沉淀重懸在Tris-EDTA中；②加入溶菌酶和蛋白酶K孵育；③加入SDS溶液孵育；④加入NaCl溶液和CTAB孵育；⑤加入由酚、氯仿和異丙醇混合而得的試劑混合液，離心；⑥將步驟⑤離心所得的上清液加入氯仿后，離心；⑦將步驟⑥離心所得的上清液加入異丙醇，沉淀30～40min；⑧將步驟⑦的所得物離心，去上清；再加入乙醇后，離心，去上清，干燥；⑨在步驟⑧所得的沉淀中加入Tris-EDTA溶解后，取1μl測濃度，其余于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 文檔編號C12N15/10GK102586232SQ201210062008
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月9日
發(fā)明者余文菁, 宓婭娜, 洪旭濤, 程小璇, 謝廣發(fā) 申請人:浙江加州國際納米技術(shù)研究院紹興分院