專利名稱：一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及ー種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法。
背景技術(shù)：
副溶血性弧菌是ー種重要的食源性致病菌，人一旦食用被該菌污染的水產(chǎn)品，易引起腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)熱等典型胃腸道癥狀。因此，對副溶血性弧菌的檢測是水產(chǎn)品安全檢測的重要內(nèi)容，如在進(jìn)出口水產(chǎn)品檢測的項(xiàng)目，在飲用水、食品檢測和食品中毒源、傳染病源調(diào)查等工作中，都需對該菌進(jìn)行檢測。副溶血性弧菌的傳統(tǒng)檢測需經(jīng)過增菌、 選擇性培養(yǎng)、生理生化鑒定和血清學(xué)反應(yīng)等過程，操作繁瑣、耗時(shí)長、檢出率低，不利于及時(shí)診斷和流行病學(xué)溯源。近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展，PCR,DNA探針、ELISA等相關(guān)技術(shù)已應(yīng)用于副溶血性弧菌的檢測，但是食品樣品和臨床樣品中的復(fù)雜組分往往會干擾副溶血性弧菌檢測的準(zhǔn)確性；且在低污染水平下，通常需要經(jīng)過增菌培養(yǎng)以達(dá)到檢測限，因此檢測時(shí)間也大大的延長。免疫磁分離(Immonumagnetic Separation, IMS)技術(shù)是一種對細(xì)胞和微生物進(jìn)行分離和富集捕獲的免疫學(xué)方法。它具備快速富集捕獲目的靶標(biāo)和減少其它雜質(zhì)干擾的優(yōu)勢。免疫磁珠由載體微球和免疫配基通過共價(jià)基團(tuán)偶聯(lián)而成。目標(biāo)菌體細(xì)胞表面抗原與連有磁珠的抗體結(jié)合形成菌體細(xì)胞和免疫磁珠復(fù)合物，該復(fù)合物在磁場作用下會發(fā)生定向移動，聚集在磁場周圍，從而與其它物質(zhì)分離。IMS可以有效的分離目的細(xì)胞，井能夠有效的去除食品樣品或臨床樣品中的抑制因子，是有效的樣品前處理方法。該技術(shù)和PCR，ELISA等技術(shù)連用能夠有效的提高檢出率和靈敏度。目前，利用MS對目的細(xì)菌的分離多采用人工操作的方法進(jìn)行，操作過程繁瑣，容易污染樣品，反應(yīng)耗時(shí)長，單個樣品的處理量有限，且不能實(shí)現(xiàn)樣品的批量處理。Pathatrix 系統(tǒng)是由英國Matrix公司根據(jù)免疫磁富集的原理研發(fā)設(shè)計(jì)，可進(jìn)行高通量細(xì)胞分選和免疫富集的儀器。它由兩部分構(gòu)成，一次性反應(yīng)套裝和反應(yīng)支架；反應(yīng)套裝包括反應(yīng)管和洗脫管，通過無菌管路連接，安裝在反應(yīng)支架上，在磁場的作用下，經(jīng)過富集和洗脫，將磁珠和菌體細(xì)胞的復(fù)合物聚集，從而完成免疫富集。該系統(tǒng)完全自動化操作， 16min內(nèi)完成頂S，單個樣品的處理量可達(dá)25_50ml，并可同時(shí)處理5個樣品，可實(shí)現(xiàn)高通量處理樣品，且較好地避免了人工操作MS引起的資源損耗和樣品污染等問題。目前，采用 Pathatrix 進(jìn)行免疫富集的報(bào)道僅有甲型肝炎病毒HAV(Efstathia et al，2008)、沙門氏菌 (Warren BR et al，2007)、大腸桿菌 0157:H7 (Willis et al，2011)。借助Pathatrix :系統(tǒng)對副溶血性弧菌高通量富集捕獲的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是在于提供ー種免疫磁珠，該免疫磁珠適用于 Pathatrix 系統(tǒng)高通量富集捕獲副溶血性弧菌。這種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法，采用副溶血性弧菌的多克隆抗體，利用EDC/NHS活化法將所述副溶血性弧菌的多克隆抗體偶聯(lián)在表面包被著羧基的磁珠上，獲得制備副溶血性弧菌的免疫磁珠；重懸已偶聯(lián)多抗的免疫磁珠，將其加入到反應(yīng)管中，再加入反應(yīng)液和樣品液，在洗脫管中加入洗滌液，采用Pathatrix 系統(tǒng)進(jìn)行免疫富集。免疫磁珠的制備方法磁珠活化用2-(N-嗎啉代)こ磺酸(pH 5)洗滌磁珠1-3次，然后加入50mg/ml 的碳ニ亞胺溶液和50mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺溶液，室溫反應(yīng)20-40分鐘，得到活化的磁珠；磁珠與多抗偶聯(lián)將副溶血弧菌多抗加入到活化的磁珠中，室溫培養(yǎng)2-4小時(shí)；加入含有1% (w/v)牛血清白蛋白的PBS溶液，封閉反應(yīng)20-40分鐘；加入以含0.02% (w/v) 疊氮化鈉NaN3、0. 1% (w/v)牛血清白蛋白BSA的PBS作為保存液，配成終濃度為15mg/ml 的免疫磁珠溶液。本發(fā)明中還需要解決的技術(shù)問題是提供ー套適用于Pathatrix 系統(tǒng)運(yùn)行的方案， 用于對副溶血性弧菌高通量富集捕獲。解決上述技術(shù)問題的方案為應(yīng)用pathatrix 系統(tǒng)高通量富集捕獲副溶血性弧菌的方法，其反應(yīng)步驟如下(I)取濃度為15mg/ml的免疫磁珠溶液不少于50 yl于PBS洗滌緩沖液中反復(fù)洗滌1-3次，再加入100 U I PBS重懸免疫磁珠。(2)安裝反應(yīng)套裝將50ml反應(yīng)液和如步驟⑴所述100 U I免疫磁珠置于樣品管，在洗脫管中加入35ml的洗脫液。(3)打開Pathatrix 儀器，將反應(yīng)套裝安裝在反應(yīng)支架中，進(jìn)行富集捕獲。優(yōu)選地 步驟⑴中免疫磁珠的用量為15mg/ml，100 U I ;步驟⑵中反應(yīng)液為pH 6. 4的Tris-HCl， 洗脫液為 PBS+0. 05% Tween-20。應(yīng)用上述方法捕獲副溶血性弧菌后，可以采用選擇性培養(yǎng)或PCR的方法檢測該方法對副溶血性弧菌的富集捕獲能力和特異性。本發(fā)明的方法同現(xiàn)有技術(shù)相比，建立了基于Pathatrix 系統(tǒng)對副溶血性弧菌的高通量富集捕獲方法，操作過程簡便、耗時(shí)短、特異性強(qiáng)、靈敏度高，且能與諸多檢測技術(shù)聯(lián)合使用，有效地提高檢出率和靈敏度。該發(fā)明所需免疫磁珠制備簡易，且能在4°C保存數(shù)月， 有較好的穩(wěn)定性；Pathatrix 系統(tǒng)單個樣品的處理容量比普通方法擴(kuò)大25-50倍，能有效的分析樣品帶菌狀態(tài)；且該系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)高通量處理樣品，大大節(jié)省勞動力。該方法可廣泛應(yīng)用于各級食品藥品監(jiān)瞀管理機(jī)構(gòu)、疾病預(yù)防控制實(shí)驗(yàn)室等對水產(chǎn)品和臨床病人胃腸道嘔吐物、血液、糞便等樣品中副溶血性弧菌的富集捕獲和后續(xù)檢測。它可為靈敏、快速、早期診斷副溶血性弧菌污染及感染狀況提供可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I一、副溶血性弧菌多抗的制備取副溶血性弧菌ATCC33846新鮮菌液，離心收集菌體，紫外燈下滅活處理后，免疫新西蘭大白兔(購自于西普爾必凱公司)，間接ELISA檢測血清，待效價(jià)> I : 4000，終止免疫，10天后取血。采用硫酸銨多步沉淀法純化兔抗血清，并采用SDS-PAGE檢測抗血清的分子量和純度。ニ、免疫磁珠的制備羧基磁珠偶聯(lián)副溶血性弧菌多克隆抗體的具體操作如下取Iml磁珠于2ml的離心管中，用25mM的2_(N-嗎啉代)こ磺酸MES(pH5)洗滌磁珠兩次。再加入500 u I EDC (碳ニ亞胺，50mg/ml)和500 u I NHS (N-羥基琥珀酰亞胺， 50mg/ml),混合均勻，室溫反應(yīng)30min。將200 U 16. 39mg/ml的多抗加入到經(jīng)過活化的磁珠， 再加入MES補(bǔ)足1ml，混合均勻，室溫下培養(yǎng)3h。加入Iml封閉液(含有I %牛血清白蛋白 BSA的PBS)，封閉未反應(yīng)位點(diǎn)30min。加入Iml PBS洗滌兩次。加入保存液(含0. 02%疊氮化鈉NaN3,0. I %牛血清白蛋白BSA的PBS) I. 5ml，配置成終濃度為15mg/ml的免疫磁珠溶液，4 °C冰箱保存?zhèn)溆?。三、?yīng)用Pathatrix 系統(tǒng)(英國Matrix公司)對副溶血性弧菌進(jìn)行富集捕獲，步驟如下I.取免疫磁珠溶液100 ill于滅菌的2ml離心管中，置于磁力架上，靜置2min，待磁珠完全吸附在帶磁場的ー側(cè)后，去除上清液，再加入同樣體積的PBS，混合均勻，于垂直混合儀上洗漆5min。2.取 Tris-HCl (pH 6. 4) 50ml 置于一次性樣品管(sample tube)中，加入 Iml 試驗(yàn)用菌液和IOOu I磁珠，在洗脫管(elution tube)中加入35ml的PBST(PBS+0. 05% Tween-20),將一次性套裝(consumable)用無菌管路連接。3.打開Pathatrix 儀器，待顯不“Pathatrix ”時(shí)，即可取下反應(yīng)槽(cartridge), 將已安裝好的一次性套裝放置在反應(yīng)槽中，按下紅色按鈕，15min后，待紅綠燈交替顯示吋， 再按一次，約Imin后完成IMS。4.取下整套裝置，取出洗脫管，置于磁力管架上，待磁珠被吸附在ー側(cè)時(shí)，去除上清液，加入200 u I PBS,保存在_20°C。四.副溶血性弧菌捕獲量的檢測對捕獲到的菌體細(xì)胞和磁珠的復(fù)合物，分別取100 U I重懸液直接涂布TCBS平板， 于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲量。實(shí)施例2富集副溶血性弧菌的免疫磁珠最優(yōu)化選擇羧基免疫磁珠的制備步驟參照實(shí)施例I。甲苯磺?；胖镈-280-T、鏈酶親和素磁珠D-280-S和D-100-S的制備步驟參照使用說明(三種磁珠均購自于美國Invitrogen公司)。采用Pathatrix 系統(tǒng)富集捕獲副溶血性弧菌和對其進(jìn)行的顯色培養(yǎng)步驟參照實(shí)施例I。免疫磁珠對副溶血性弧菌捕獲能力的檢測結(jié)果見表1，在起始菌液量為6. 641og CFU/ml時(shí)，各個磁珠捕獲副溶血性弧菌的量均在4-51og CFU/ml水平。羧基磁珠捕獲能力最優(yōu)，為5. 761og CFU/ml，因此選用羧基免疫磁珠富集副溶血性弧菌。表I :免疫磁珠捕獲能力的檢測
權(quán)利要求
1.一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法，其特征在于采用副溶血性弧菌的多克隆抗體，利用EDC/NHS活化法將所述副溶血性弧菌的多克隆抗體偶聯(lián)在表面包被著羧基的磁珠上，獲得制備副溶血性弧菌的免疫磁珠；重懸已偶聯(lián)多抗的免疫磁珠，將其加入到反應(yīng)管中，再加入反應(yīng)液和樣品液，在洗脫管中加入洗滌液，采用Pathatrix 系統(tǒng)進(jìn)行免疫富集。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法，其特征在于所述免疫磁珠的制備方法為磁珠活化用2-(N-嗎啉代)乙磺酸(pH 5)洗漆磁珠1-3次,然后加入50mg/ml的碳二亞胺溶液和50mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺溶液，室溫反應(yīng)20-40分鐘，得到活化的磁珠；磁珠與多抗偶聯(lián)將副溶血弧菌多抗加入到活化的磁珠中，室溫培養(yǎng)2-4小時(shí)；加入含有1% (w/v)牛血清白蛋白的PBS溶液，封閉反應(yīng)20-40分鐘；加入以含O. 02% (w/v)疊氮化鈉NaN3、0. 1% (w/v)牛血清白蛋白BSA的PBS作為保存液，配成終濃度為15mg/ml的免疫磁珠溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法，其特征在于應(yīng)用Pathatrix 系統(tǒng)高通量富集捕獲副溶血性弧菌的反應(yīng)過程如下A.取免疫磁珠溶液于PBS洗滌緩沖液中反復(fù)洗滌1-3次，再加入100μ I PBS重懸免疫磁珠；B.安裝反應(yīng)體系將50ml反應(yīng)液和如步驟A所處理后的免疫磁珠溶液置于樣品管,加入待檢測樣品拍打液，在洗脫管中加入35ml的洗脫液；C.打開Pathatrix 儀器，將反應(yīng)套裝安裝在反應(yīng)支架中，進(jìn)行免疫富集。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法，其特征在于應(yīng)用Pathatrix 系統(tǒng)進(jìn)行高通量富集捕獲副溶血性弧菌的反應(yīng)條件為免疫磁珠的用量為不少于 O. 75mg ;反應(yīng)液為 Tris-HCl 或PBS ;洗脫液為 PBS、PBS+0. 05% Tween-20 或 PBS+0. 1% Tween-20。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法，其特征在于應(yīng)用Pathatrix 系統(tǒng)高通量富集捕獲副溶血性弧菌的最優(yōu)化反應(yīng)條件，具體為免疫磁珠的用量為 I. 5mg ;反應(yīng)液為 pH 6. 4 的 Tris-HCl ;洗脫液為 PBS+0. 05% Tween-20
全文摘要
本發(fā)明涉及的一種高通量富集、捕獲副溶血性弧菌的方法，其特征在于采用副溶血性弧菌的多克隆抗體，利用EDC/NHS活化法將所述副溶血性弧菌的多克隆抗體偶聯(lián)在表面包被著羧基的磁珠上，獲得制備副溶血性弧菌的免疫磁珠；重懸已偶聯(lián)多抗的免疫磁珠，將其加入到反應(yīng)管中，再加入反應(yīng)液和樣品液，在洗脫管中加入洗滌液，采用系統(tǒng)進(jìn)行免疫富集。
文檔編號C12N1/20GK102586157SQ20121006321
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者盧瑛, 孫曉紅, 潘迎捷, 蘇晨曦, 趙勇 申請人:上海海洋大學(xué)