專利名稱：一種海南霉素的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗生素的發(fā)酵方法，具體涉及一種采用微生物菌種發(fā)酵海南霉素的方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
海南霉素是白色或類白色粉末，無臭無味，英文名Hainanmycin,分子式C47H80O15H2O,分子量884。海南霉素是中國自主開發(fā)的單價離子載體類抗生素獸藥，在防止雞球蟲感染和提高反芻動物飼料轉(zhuǎn)化率上具有顯著效果，為高效抗球蟲藥物。它對革蘭氏陽性菌如桿菌、球菌有廣泛的抗菌譜，對厭氧及某些植物病原菌、水稻紋枯病和油菜菌核病等真菌也有抗菌作用；對革蘭氏陰性菌不顯活性。南海霉素還能提高飼料轉(zhuǎn)化率，增進肉雞體重，改善雞肉品質(zhì)，促進牛、羊等反芻動物的增長，被稱為長肉素。海南霉素是從我國海南島土壤中分離的一種稠李鏈霉菌東方變種(Streptomycespadanus Var dangfangeusls)培養(yǎng)液中提取出的,現(xiàn)今制備方法是取沙土管中的孢子，接種于斜面，28°C培養(yǎng)7天，接種2 3代斜面，備用，采用挖塊法接種，發(fā)酵主要原料為淀粉、魚粉。此方法孢子需在斜面上培養(yǎng)2-3代，難以保持菌種穩(wěn)定，發(fā)酵單位無法達到生產(chǎn)要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對背景技術(shù)中提到的現(xiàn)有發(fā)酵海南霉素的不足，提供了一種海南霉素的發(fā)酵方法，該方法海南霉素發(fā)酵單位穩(wěn)定，較現(xiàn)有發(fā)酵工藝發(fā)酵單位高，具備生產(chǎn)要求。本發(fā)明采用發(fā)酵法生產(chǎn)海南霉素，所用的稠李東方鏈霉菌(Streptomycespadanus var. dangfangeusls) SDSL-HNl 109 已于 2011 年 9 月 29 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 5308。該SDSL-HN1109菌株是通過以下幾個階段選育出來的
一、從稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls) HNl 菌株出發(fā)，經(jīng)連續(xù)亞硝基胍誘變得到比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高20 %的SDSL-HN337號高產(chǎn)菌株。二、將SDSL-HN337號高產(chǎn)菌株經(jīng)氮離子注入誘變，得到較SDSL-HN337菌株產(chǎn)量提高15%的SDSL-HNl 109菌株，產(chǎn)量在5210ug/ml左右。本發(fā)明采用上述菌種生產(chǎn)海南霉素，其技術(shù)方案如下
一種海南霉素的發(fā)酵方法，其特征是以稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanusvar. dangfangeusls) SDSL-HN1109 CGMCC NO. 5308為菌種進行發(fā)酵制備，包括以下步驟
(1)將冷藏的稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls)SDSL-HNl 109 CGMCC NO. 5308沙土孢子接種到斜面培養(yǎng)基上，在28°C下培養(yǎng)7天；
(2)用無菌水洗下步驟(I)斜面培養(yǎng)所得的孢子，加入甘油配成孢子懸浮液，在-70°C _80°C下保存?zhèn)溆茫?br> (3)將孢子懸浮液O. 2ml接種到45-60ml種子培養(yǎng)基中，在28°C培養(yǎng)40 42小時，得種子液；
(4)將種子液按照10 20%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C培養(yǎng)90 144小時，得發(fā)酵液。上述方法中，稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls)HNl 109沙土孢子的制備方法是將菌種進行斜面培養(yǎng)，用接種針將所得孢子刮下，送入滅菌的沙土管中，攪動沙土，使粘附在接種針上的孢子與沙土充分混合，塞緊棉塞，敲松沙土，將沙土管放入真空干燥器內(nèi)，常溫下保持真空度O. 08 O. IMpa連續(xù)抽干40 60分鐘，然后敲松沙土，將沙土管放入盛有變色硅膠的干燥器中，置于O 8°C冰箱中保藏備用。 上述方法中，斜面培養(yǎng)基組分包括玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸鈣O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,瓊脂2. 0wt%,飲用水余量。在配制斜面培養(yǎng)基時，玉米淀粉在70 80°C糊化10分鐘再與其他成分混合。上述方法中，種子培養(yǎng)基組分包括玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸鈣
O.8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%，飲用水余量，pH7. 4 7. 9。上述方法中，發(fā)酵培養(yǎng)基組分包括豆油6 10wt%，黃豆餅粉2. O 3. 0wt%，葡萄糖2. 0wt%,碳酸I丐O. 5wt%,酵母粉O. 5wt%,硫酸鎂O. 08wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,氯化鈉
O.2 wt%，飲用水余量，ρΗ7· 4 7. 9。上述步驟(2)中，制得的孢子懸浮液中，每毫升孢子懸浮液含有IXlO8 IXIOiq個孢子。上述步驟(2)中，甘油的濃度為20wt%，甘油與無菌水的體積比為1:1。上述步驟(3)中，優(yōu)選的，孢子懸浮液O. 2ml接種到50ml種子培養(yǎng)基中。本發(fā)明通過誘變選育得到了高產(chǎn)量的稠李東方鏈霉菌變異菌株，利用此菌株發(fā)酵制備海南霉素，發(fā)酵結(jié)果穩(wěn)定，重復性好，海南霉素產(chǎn)量大大提高。此外，與現(xiàn)有工藝相比，本發(fā)明在制備發(fā)酵種子時僅需要一次斜面培養(yǎng)，避免了傳2 3代斜面，保證了菌種的純度，避免了菌種污染，簡化了操作，并且優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基組成及接種量，進一步的提高了海南霉素的產(chǎn)量。菌種保藏信息
稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls) SDSL-HN1109 已于2011年9月29日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為 CGMCC NO. 5308。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明進行進一步闡述，應該明白的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。本發(fā)明的變異菌株是由我國海南島土壤中分離的稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls)誘變選育得來的，主要經(jīng)兩步得到。第一步，從稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls) HNl 菌株出發(fā)，經(jīng)連續(xù)亞硝基胍誘變得到比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高20 %的SDSL-HN337號高產(chǎn)菌株；第二步，將SDSL-HN337號高產(chǎn)菌株經(jīng)氮離子注入誘變，得到較SDSL-HN337菌株產(chǎn)量提高15%的SDSL-HNl 109菌株，產(chǎn)量在5000 ug/ml左右，隨著工藝條件的變化發(fā)酵產(chǎn)量有所不同，尤其是發(fā)酵時間的變化對發(fā)酵產(chǎn)量具有重要影響，在一定范圍內(nèi)，發(fā)酵量隨發(fā)酵時間的增加而變大。
本發(fā)明在生產(chǎn)時，將選育所得海南霉素產(chǎn)生菌種放入沙土管中進行保存，其保存方法是將菌種進行斜面培養(yǎng)，用接種針將所得孢子刮下，送入滅菌的沙土管中，攪動沙土，使粘附在接種針上的孢子與沙土充分混合，塞緊棉塞，敲松沙土，將沙土管放入真空干燥器內(nèi)，常溫下保持真空度O. 08 O. IMpa連續(xù)抽干40 60分鐘，然后敲松沙土，將沙土管放入盛有變色硅膠的干燥器中，置于O 8°C冰箱中保藏備用。 所用斜面培養(yǎng)基為玉米淀粉1. 0wt%,酵母粉1. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,瓊脂 2. 0wt%o下面以上述制得的沙土孢子為菌種，進行發(fā)酵生產(chǎn)海南霉素，通過下列實施例進一步的解釋、詳述本發(fā)明。若無特別說明，下述實施例中所用培養(yǎng)基的組分含量均為重量百分比。實施例I
I、孢子斜面培養(yǎng)
在無菌條件下，用接種勺在沙土管內(nèi)取出一勺沙土均勻散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均勻，瓶口用棉塞塞緊，外扎紗布，在28°C下培養(yǎng)7天；
所用斜面培養(yǎng)基為玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,瓊脂2. 0wt%，飲用水余量。2、孢子懸浮液制備
使用50ml無菌水洗下培養(yǎng)所得的斜面孢子，然后加入等體積無菌的20wt%甘油，混合均勻后，制得孢子懸浮液，每毫升懸浮液中約含IO9個孢子，將懸浮液分裝與5ml耐低溫帶蓋塑料管中，在-70°C _80°C保存?zhèn)溆谩?、種子液制備
按50ml種子液接種O. 2ml孢子懸浮液的比例接種種子培養(yǎng)基，在28°C培養(yǎng)40小時，得種子液。種子培養(yǎng)基為玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,飲用水余量4取.4 7.9。4、發(fā)酵培養(yǎng)
將種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C下培養(yǎng)90小時，發(fā)酵單位為3852u/ml。所用配方為豆油6wt%，黃豆餅粉2. 0wt%,葡萄糖2. 0wt%,碳酸鈣
O.5wt%，酵母粉O. 5wt%，硫酸鎂O. 08wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,氯化鈉O. 2 wt%，飲用水余量，pH7. 4 7. 9。實施例2
I、孢子斜面培養(yǎng)在無菌條件下，用接種勺在沙土管內(nèi)取出一勺沙土均勻散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均勻，瓶口用棉塞塞緊，外扎紗布，在28°C下培養(yǎng)7天；
所用斜面培養(yǎng)基為玉米淀粉I. Owt%,酵母粉I. Owt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. Owt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,瓊脂2. Owt%，飲用水余量。2、孢子懸浮液制備 使用50ml無菌水洗下培養(yǎng)所得的斜面孢子，然后加入等體積無菌的20wt%甘油，混合均勻后，制得孢子懸浮液，每毫升懸浮液中約含IO9個孢子，將懸浮液分裝與5ml耐低溫帶蓋塑料管中，在-70°C _80°C保存?zhèn)溆谩?、種子液制備
按50ml種子液接種O. 2ml孢子懸浮液的比例接種種子培養(yǎng)基，在28°C培養(yǎng)40小時，得種子液。種子培養(yǎng)基為玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,飲用水余量4取.4 7.9。4、發(fā)酵培養(yǎng)
將種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，所用配方為豆油8wt%，黃豆餅粉2. 5wt%,葡萄糖2. 0wt%,碳酸I丐O. 5wt%,酵母粉O. 5wt%,硫酸鎂O. 08wt%,磷酸氫二鉀
O.02wt%，氯化鈉O. 2 wt%，飲用水余量，pH7. 4 7. 9。在28°C下培養(yǎng)120小時，發(fā)酵單位為5063u/ml。實施例3
I、孢子斜面培養(yǎng)
在無菌條件下，用接種勺在沙土管內(nèi)取出一勺沙土均勻散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均勻，瓶口用棉塞塞緊，外扎紗布，在28°C下培養(yǎng)7天；
所用斜面培養(yǎng)基為玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,瓊脂2. 0wt%，飲用水余量。2、孢子懸浮液制備
使用50ml無菌水洗下培養(yǎng)所得的斜面孢子，然后加入等體積無菌的20wt%甘油，混合均勻后，制得孢子懸浮液，每毫升懸浮液中約含109_101(1個孢子，將懸浮液分裝與5ml耐低溫帶蓋塑料管中，在_70°C _80°C保存?zhèn)溆谩?、種子液制備
按50ml種子液接種O. 2ml孢子懸浮液的比例接種種子培養(yǎng)基，在28°C培養(yǎng)40小時，得種子液。種子培養(yǎng)基為玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,飲用水余量4取.4 7.9。4、發(fā)酵培養(yǎng)
將種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的20%接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，所用配方為豆油1(^丨％，黃豆餅粉3wt%,葡萄糖2. Owt%,碳酸I丐O. 5wt%,酵母粉O. 5wt%,硫酸鎂O. 08wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%，氯化鈉O. 2 wt%，飲用水余量，pH7. 4 7. 9。在28°C下培養(yǎng)144小時，發(fā)酵單位為6770u/ml。實施例4
I、孢子斜面培養(yǎng)
在無菌條件下，用接種勺在沙土管內(nèi)取出一勺沙土均勻散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均勻，瓶口用棉塞塞緊，外扎紗布，在28°C下培 養(yǎng)7天；
所用斜面培養(yǎng)基為玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,瓊脂2. 0wt%，飲用水余量。2、孢子懸浮液制備
使用50ml無菌水洗下培養(yǎng)所得的斜面孢子，然后加入等體積無菌的20wt%甘油，混合均勻后，制得孢子懸浮液，每毫升懸浮液中含IO8-IO9個孢子，將懸浮液分裝與5ml耐低溫帶蓋塑料管中，在-70°C -80V保存?zhèn)溆谩?、種子液制備
按45ml種子液接種O. 2ml孢子懸浮液的比例接種種子培養(yǎng)基，在28°C培養(yǎng)40小時，得種子液。種子培養(yǎng)基為玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,飲用水余量4取.4 7.9。4、發(fā)酵培養(yǎng)
將種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的20%接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，所用配方為豆油8wt%，黃豆餅粉2. 5wt%,葡萄糖2. 0wt%,碳酸I丐O. 5wt%,酵母粉O. 5wt%,硫酸鎂O. 08wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%，氯化鈉O. 2 wt%，飲用水余量，pH7. 4 7. 9。在28°C下培養(yǎng)144小時，發(fā)酵單位為6870u/ml。實施例5
按照實施例2的方法發(fā)酵生產(chǎn)海南霉素鈉，不同的是種子培養(yǎng)時，按60ml種子液接種O. 2ml孢子懸浮液的比例接種種子培養(yǎng)基,最終發(fā)酵單位為4876u/ml。
權(quán)利要求
1.一種海南霉素的發(fā)酵方法，其特征是以稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanusvar. dangfangeusls) SDSL-HNl 109 CGMCC NO. 5308為菌種進行發(fā)酵制備，包括以下步驟 (1)將冷藏的稠李東方鏈霉菌(Streptomycespadanus var. dangfangeusls)SDSL-HNl 109 CGMCC NO. 5308沙土孢子接種到斜面培養(yǎng)基上，在28°C下培養(yǎng)7天； (2)用無菌水洗下步驟(I)斜面培養(yǎng)所得的孢子，加入甘油配成孢子懸浮液，在-70°C _80°C下保存?zhèn)溆茫? (3)將孢子懸浮液0.2ml接種到45-60ml種子培養(yǎng)基中，在28°C培養(yǎng)40 42小時，得種子液； (4)將種子液按照10 20%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C培養(yǎng)90 144小時，得發(fā)酵液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的發(fā)酵方法，其特征是稠李東方鏈霉菌(Streptomycespadanus var. dangfangeusls)沙土孢子的制備方法是將菌種進行斜面培養(yǎng)，用接種針將所得孢子刮下，送入滅菌的沙土管中，攪動沙土，使粘附在接種針上的孢子與沙土充分混合，塞緊棉塞，敲松沙土，將沙土管放入真空干燥器內(nèi)，常溫下保持真空度0. 08 0. IMpa連續(xù)抽干40 60分鐘，然后敲松沙土，將沙土管放入盛有變色硅膠的干燥器中，置于0 8°C冰箱中保臧備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的發(fā)酵方法，其特征是，斜面培養(yǎng)基組分包括玉米淀粉I.0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐0. 8wt%,氯化鈉0. 3wt%,黃豆餅粉0. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨0. lwt%，硫酸鎂0. 05wt%，磷酸氫二鉀0. 02wt%，瓊脂2. 0wt%，飲用水余量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵方法，其特征是斜面培養(yǎng)基在配制時，玉米淀粉在70 80°C糊化10分鐘再與其他成分混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的發(fā)酵方法，其特征是，種子培養(yǎng)基組分包括玉米淀粉I.0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐0. 8wt%,氯化鈉0. 3wt%,黃豆餅粉0. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨0. lwt%，硫酸鎂0. 05wt%，磷酸氫二鉀0. 02wt%，飲用水余量，pH7. 4 7. 9。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的發(fā)酵方法，其特征是，發(fā)酵培養(yǎng)基組分包括豆油6 10wt%，黃豆餅粉2. 0 3. 0wt%,葡萄糖2. 0wt%,碳酸I丐0. 5wt%,酵母粉0. 5wt%,硫酸鎂0. 08wt%,磷酸氫二鉀0. 02wt%,氯化鈉0. 2 wt%，飲用水余量，pH7. 4 7. 9。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的發(fā)酵方法，其特征是制得的孢子懸浮液中，每毫升孢子懸浮液含有I X IO8 I X 101°個孢子。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的發(fā)酵方法，其特征是步驟(2)中，甘油的濃度為20wt%，甘油與無菌水的體積比為1:1。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的發(fā)酵方法，其特征是步驟(3)中，孢子懸浮液0.2ml接種到50ml種子培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海南霉素的發(fā)酵方法，步驟為將冷藏的稠李東方鏈霉菌SDSL-HN1109沙土孢子接種到斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7天；洗下斜面培養(yǎng)所得的孢子，加入甘油配成孢子懸浮液，在-70℃～-80℃下保存?zhèn)溆?；將孢子懸浮?.2ml接種到45-60ml種子培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)40～42小時，得種子液；將種子液按照10～20%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)90～144小時，得發(fā)酵液。本發(fā)明利用高產(chǎn)量的稠李東方鏈霉菌變異菌株制備海南霉素，發(fā)酵結(jié)果穩(wěn)定，重復性好，產(chǎn)量高。此外，在制備發(fā)酵種子時僅需要一次斜面培養(yǎng)，保證了菌種的純度，避免了菌種污染，簡化了操作。
文檔編號C12R1/465GK102634553SQ20121006496
公開日2012年8月15日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者劉寧, 張旭, 李承鈺, 王煒, 趙碩珍, 馬景武 申請人:山東勝利股份有限公司