專利名稱：一種西索霉素發(fā)酵過程中補入種子液的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種西索霉素發(fā)酵過程中補入種子的方法，它是以玉米淀粉、黃豆餅粉等為原材料，在微生物伊尼奧小單孢放線菌的作用下，種子經(jīng)過三級擴大培養(yǎng)，在已發(fā)酵培養(yǎng)20—24小時的發(fā)酵罐中補入種子進行再發(fā)酵，當發(fā)酵培養(yǎng)48小時后，進行一次半料補入，當發(fā)酵培養(yǎng)80小時后，進行一次到二次的補水，來制備較高和穩(wěn)定的西索霉素發(fā)酵液。
背景技術：
西索霉素英文名Sisomicin，分子式=C19H37N5O7，分子量447. 53，西索霉素為白色或類白色粉末，無臭，有引濕性。在水中易溶，在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶，西索霉素常以鹽酸鹽存在。西索霉素(Sisomicin，SIS0)是典型的次級代謝產(chǎn)物合成過程，是一種重要的含有雙鍵的水溶性、多元弱堿性氨基糖苷類抗生素，屬慶大霉素-西索霉素型的假三糖慶大霉胺類抗生素，為抗生素JI-20A的脫羥基化衍生物，西索霉素還是合成藥物奈替米星 (Netilmicin, NET)和新型化合物氫化西索霉素(即5‘-差向慶大霉素Cla)的生產(chǎn)原料， 中國生產(chǎn)的西索霉素約占世界產(chǎn)量的80%?，F(xiàn)有生產(chǎn)西索霉素發(fā)酵液的方法是以玉米淀粉、黃豆餅粉等為原材料，在微生物伊尼奧小單孢放線菌的作用下，多采用三級發(fā)酵，在發(fā)酵過程中進行適時補料生產(chǎn)西索霉素發(fā)酵液，利用薄層層析生物顯影測定西索霉素效價，西索霉素的生物效價一般在 700-1200ug / ml，西索霉素主組份在70-80%，提取純化收率只能達到50-60%，發(fā)酵周期長144小時左右。現(xiàn)有生產(chǎn)西索霉素發(fā)酵液的方法，其不足之處在于
1、西索霉素生產(chǎn)過程中發(fā)酵液生物效價較低，高低懸殊較大，生產(chǎn)不穩(wěn)定，西索霉素的主組份不高，提取純化收率低；
2、西索霉素生產(chǎn)過程中發(fā)酵周期較長，水、電等能源浪費，生產(chǎn)成本高。

發(fā)明內容
本發(fā)明一種西索霉素發(fā)酵過程中補入種子的方法，它是以玉米淀粉、黃豆餅粉等為原材料，在微生物伊尼奧小單孢放線菌的作用下，種子經(jīng)過三級擴大培養(yǎng)，在已發(fā)酵培養(yǎng) 20-24小時的發(fā)酵罐中補入種子進行再發(fā)酵，當發(fā)酵培養(yǎng)48小時后，進行一次半料補入， 當發(fā)酵培養(yǎng)80小時后，進行一次到二次的補水，來制備較高和穩(wěn)定的西索霉素發(fā)酵液。其目的在于克服上述的不足之處，提供一種能降低生產(chǎn)成本、又能提高西索霉素效價，利用在已發(fā)酵培養(yǎng)20— 24小時的發(fā)酵罐中補入種子進行雙種再發(fā)酵的方法。本發(fā)明補入種子(即雙種發(fā)酵法)進行發(fā)酵再培養(yǎng)后生產(chǎn)的西索霉素發(fā)酵液，解決了現(xiàn)有技術中存在的西索霉素效價高低不一的難題，提高了西索霉素的效價，效價穩(wěn)定在 1300-1500ug / ml,西索霉素的主組份由現(xiàn)有技術的70-80%提高到了 80-90%，提取純化收率由現(xiàn)有技術的50-60%提高到了 60-70%，西索霉素平均效價比現(xiàn)有技術提高了 20%。本發(fā)明由于發(fā)酵周期縮短了 24小時左右，發(fā)酵過程中水、電用量也就相應地得到減少，節(jié)約了能源，降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明一種西索霉素發(fā)酵過程中補入種子的方法，它是以雙種子發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)較高和穩(wěn)定的西索霉素發(fā)酵液。本發(fā)明設計的各培養(yǎng)組成分別為
1、搖瓶種子培養(yǎng)基組成玉米淀粉0.8 1. 2%、黃豆餅粉0. 8 1. 2%、酵母粉0. 08 0. 12%、硫酸鎂 0. 03 0. 07%,玉米菜 0. 03 0. 07%、淀粉酶 0. 0008 0. 0012%;
2、一級種子培養(yǎng)基組成玉米淀粉2.8 3. 2%、黃豆餅粉0. 6 1. 0%、玉米漿0. 03 0. 07%、酵母粉0. 13 0. 17%、硫酸鎂0. 03 0. 07%、碳酸鈣0. 3 0. 7%、淀粉酶0. 00008 0. 00012%、泡敵 0. 008 0. 012%;
3、二級種子培養(yǎng)基組成玉米淀粉5.8 6. 2%、黃豆餅粉1. 2 1. 6%、酵母粉0. 13 0. 17%、硫酸鎂0. 03 0. 07%、玉米菜0. 03 0. 07%、碳酸鈣0. 3 0. 7%、氯化鈷0. 0003 0. 0007%、淀粉酶 0. 00008 0. 00012%、泡敵 0. 008 0. 012%;
4、三級種子培養(yǎng)基組成玉米淀粉5.8 6. 2%、黃豆餅粉1. 2 1. 6%、酵母粉0. 13 0. 17%、玉米菜0. 03 0. 07%、硫酸鎂0. 03 0. 07%、碳酸鈣0. 3 0. 7%、氯化鈷0. 0003 0. 0007%、淀粉酶 0. 00008 0. 00012%、泡敵 0. 008 0. 012%;
5、發(fā)酵培養(yǎng)基組成玉米淀粉5.8 6. 2%、黃豆餅粉1. 8 2. 2%、玉米漿0. 03 0. 07%、碳酸鈣0. 03 0. 07%.、蛋氨酸0. 003 0. 007%.、氯化鈷0. 0003 0. 0007%、淀粉酶 0. 00008 0. 00012%、泡敵 0. 008 0. 012%;
6、半料培養(yǎng)基組成玉米淀粉2.8 3. 2%、黃豆餅粉0.6 1.0%、玉米漿0.01 0. 05%、碳酸鈣0. 01 0. 05%、蛋氨酸0. 001 0. 005%、氯化鈷0. 0001 0. 0005%、淀粉酶 0. 00003 0. 00005%、泡敵 0. 008 0. 012%。其發(fā)酵生產(chǎn)工藝主要分為以下四步
1、單種子發(fā)酵制備將上一級的種子經(jīng)過培養(yǎng)合格后移入下一級種子罐中培養(yǎng)，最終移入發(fā)酵罐中，操作步驟如下
1.1搖瓶種子的制備搖瓶種子培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌冷卻后，在無菌條件下，用接種針刮下斜面菌絲體于種子瓶中，置34士 1°C搖床上培養(yǎng)40-48小時后，下?lián)u床備用；
1. 2 一級種子的制備一級種子培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌冷卻后，在無菌條件下將搖瓶種子接入一級種子罐中34士 1°C培養(yǎng)24-36小時；
1. 3 二級種子的制備二級種子培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌冷卻后，通過已滅菌過的移種管道將一級種子移入二級種子罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度34士 1°C，培養(yǎng)時間18-24小時；
1.4三級種子的制備三級種子培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌冷卻后，通過已滅菌過的移種管道將二級種子移入三級種子罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度34士 1°C，通氣量1 :1 v/v / min,培養(yǎng)時間 18-24小時；
1.5發(fā)酵罐培養(yǎng)基的制備發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌冷卻后，通過已滅菌過的移種管道將三級種子移入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度34士 1°C，通氣量1 :1 v/v / min,培養(yǎng)時間100-120 小時；
2、備用種子的制備間隔20-24小時重復制備步驟1中所述工序1.1到1. 4的各級種子的制備，將培養(yǎng)好的備用種子移入步驟1中所述工序1. 5已發(fā)酵培養(yǎng)20-24小時的發(fā)酵
5罐中再培養(yǎng)80-100小時；
3、半料培養(yǎng)基補入上述步驟1中所述1.5工序中發(fā)酵液培養(yǎng)48小時后，將已滅菌冷卻后的半料培養(yǎng)基一次或多次性補入，優(yōu)先選擇48—55小時補入；
4、無菌水的補入上述1中所述1.5工序中發(fā)酵液培養(yǎng)80小時后，將已滅菌冷卻后的無菌水無菌水一次或多次補入，優(yōu)先選擇80小時和88小時補入。與現(xiàn)有單種發(fā)酵技術相比，本發(fā)明(可以簡稱為雙種發(fā)酵法)具有顯著的優(yōu)點
1、由于西索霉素發(fā)酵是產(chǎn)物合成和菌體生長非耦聯(lián)型，產(chǎn)物合成期維持高濃度的菌體量對西索霉素產(chǎn)物的合成有利，采用雙種發(fā)酵工藝即將備用種子移入已培養(yǎng)20-24小時的發(fā)酵罐中再培養(yǎng)，能有效提高菌體量同時對產(chǎn)抗有利；
2、由于西索霉素的菌體長菌期和產(chǎn)抗期都需要消耗大量的碳源和氮源，當發(fā)酵在雙種子條件下培養(yǎng)48小時后，在顯微鏡下觀察菌絲體粗壯，大部分菌絲體已經(jīng)進入產(chǎn)抗，可發(fā)酵糖濃度下降較大，需要進行一次半料培養(yǎng)基補入來提供菌絲體的碳源和氮源以及菌絲體產(chǎn)抗所必須的氨基酸和微量元素等；
3、由于西索霉素發(fā)酵過程中存在明顯的產(chǎn)物抑制效應，西索霉素濃度大于0.050g/ L 將明顯抑制產(chǎn)物合成，當發(fā)酵在雙種子條件下培養(yǎng)80小時后，由于淀粉酶酶活力不足，菌絲體已進入衰退期，大量的西索霉素產(chǎn)物吸附在菌絲體上，進行一次到二次的補水有利于降低菌體上西索霉素產(chǎn)物的吸附量，削弱西索霉素產(chǎn)物的抑制效應，來獲取較高和穩(wěn)定的西索霉素發(fā)酵液，獲得較高的效價和較高的產(chǎn)量。
具體實施例方式為了更好的闡述本發(fā)明一種西索霉素發(fā)酵過程中補入種子的方法，通過以下具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1
以35立方米發(fā)酵罐為例作進一步的說明，具體實施以下步驟 1、12L搖瓶種子的制備
1.1菌種的選擇我公司使用的菌種是伊尼奧小單孢放線菌；
1.2搖瓶種子培養(yǎng)基組成玉米淀粉1. 0%、黃豆餅粉1. 0%、酵母粉0. 1%、硫酸鎂0. 05%, 玉米漿0. 05%、淀粉酶0. 001%,按以上配方準確稱取所需原材料，加水定容至所需體積，分裝于3000ml三角瓶中80士2ml/瓶，瓶口塞蘑菇塞，外包牛皮紙。置于壓力0. 10-0. IlMPa, 溫度120—121°C消毒鍋中維持30分鐘，冷卻待用。在無菌條件下，用接種針刮下斜面菌絲體于種子瓶中，置34士 1 °C，搖床培養(yǎng)40-48小時；
2、120L—級種子的制備一級種子培養(yǎng)基組成玉米淀粉3. 0%、黃豆餅粉0. 8%、玉米漿 0. 05%、酵母粉0. 15%、硫酸鎂0. 05%、碳酸鈣0. 5%、淀粉酶0. 0001%、泡敵0. 01%。經(jīng)過滅菌的一級種子培養(yǎng)基冷卻到34°C后，將培養(yǎng)好的12L搖瓶種子在無菌條件下接入一級種子罐中培養(yǎng)。一級種子培養(yǎng)條件溫度34士 1°C，PH6. 8-7.0，通氣量1 :1 v/v / min,培養(yǎng)時間 30-36小時；
3.800L 二級種子的制備二級種子培養(yǎng)基組成玉米淀粉6. 0%、黃豆餅粉1. 4%、酵母粉0. 15%、硫酸鎂0. 05%、玉米漿0. 05%、碳酸鈣0. 5%、氯化鈷0. 0005%、淀粉酶0. 0001%、泡敵 0. 01%。經(jīng)過鏡檢及無菌檢查合格的一級種子罐的種子，經(jīng)過已滅菌過的移種管道移入已滅菌的二級種子罐中培養(yǎng)。二級種子培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度34 士 1°C，PH6. 8-7.0，通氣量1 :1 ν/ ν / min,培養(yǎng)時間18-24小時；
4.4000L三級種子的制備三級種子培養(yǎng)基組成玉米淀粉6. 0%、黃豆餅粉1. 4%、酵母粉0. 15%、玉米漿0. 05%、硫酸鎂0. 05%、碳酸鈣0. 5%、氯化鈷0. 0005%、淀粉酶0. 0001%、泡敵 0. 01%。經(jīng)過鏡檢及無菌檢查合格的二級種子罐的種子，經(jīng)過已滅菌過的移種管道移入已滅菌的三級種子罐中培養(yǎng)。三級種子培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度34士 l°C，PH7.0-7. 1，通氣量1 :1 ν/ ν / min,培養(yǎng)時間18-24小時；
5、16000L發(fā)酵培養(yǎng)基的制備發(fā)酵培養(yǎng)基組成玉米淀粉6. 0%、黃豆餅粉2. 0%、玉米漿 0. 05%、碳酸鈣0. 05%.、蛋氨酸0. 005%.、氯化鈷0. 0005%、淀粉酶0. 0001%、泡敵0. 01%。經(jīng)過鏡檢及無菌檢查合格的三級種子移入經(jīng)滅菌的并冷卻到34°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件溫度34士 1°C，通氣量1 1 v/v / min,培養(yǎng)時間100-120小時；
6.4000L備用種子液間隔20-24小時重復上述1_4的工序中進行各級種子的制備，經(jīng)過鏡檢及無菌檢查合格的4000L備用種子移入上述5工序中已培養(yǎng)20-24小時的發(fā)酵罐中再培養(yǎng)80-100小時；
7、4000L半料培養(yǎng)基制備半料培養(yǎng)基組成玉米淀粉3.0%、黃豆餅粉0. 8%、玉米漿 0. 03%、碳酸鈣0. 03%、蛋氨酸0. 003%、氯化鈷0. 0003%、淀粉酶0. 00005%、泡敵0. 01%。經(jīng)過滅菌、冷卻到34°C后，補入上述5工序中已培養(yǎng)48小時的發(fā)酵罐中；
8、3000L無菌水制備3000L自來水經(jīng)過滅菌、冷卻到34°C后，分兩次補入上述5工序中已培養(yǎng)80小時和88小時的發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐通過冷卻水進行冷卻，維持培養(yǎng)基的溫度為34°C，發(fā)酵培養(yǎng)100-120小時發(fā)酵結束。綜上所述35立方米發(fā)酵罐放罐效價為1500ug / ml，下罐體積為28. 585m3，所得西索霉素理論總億(十億)=1500X28. 585/1000=42. 877。實施例2
以35立方米發(fā)酵罐為例，其操作步驟與實施例1相同，其不同之處在于步驟5中發(fā)酵培養(yǎng)基的制備體積為15000L，最終效價為1550ug / ml，下罐體積為28m3，所得西索霉素理論總億(十億)=1550X28/1000=43. 4。
權利要求
1. 一種西索霉素發(fā)酵過程中補入種子的方法，它是以雙種子發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)較高和穩(wěn)定的西索霉素發(fā)酵液，其特征在于包括如下步驟.1、單種子發(fā)酵制備將上一級的種子經(jīng)過培養(yǎng)合格后移入下一級種子罐中培養(yǎng)，最終移入發(fā)酵罐中，工序如下.1.1搖瓶種子的制備搖瓶種子培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌冷卻后，在無菌條件下，用接種針刮下斜面菌絲體于種子瓶中，置34士 1°C搖床上培養(yǎng)40-48小時后，下?lián)u床備用；.1. 2 一級種子的制備一級種子培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌冷卻后，在無菌條件下將搖瓶種子接入一級種子罐中34士 1°C培養(yǎng)24-36小時；.1. 3 二級種子的制備二級種子培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌冷卻后，通過已滅菌過的移種管道將一級種子移入二級種子罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度34士 1°C，培養(yǎng)時間18-24小時；.1.4三級種子的制備三級種子培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌冷卻后，通過已滅菌過的移種管道將二級種子移入三級種子罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度34士 1°C，通氣量1 :1 v/v / min,培養(yǎng)時間 18-24小時；.1、5發(fā)酵罐培養(yǎng)基的制備發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌冷卻后，通過已滅菌過的移種管道將三級種子移入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度34士 1°C，通氣量1 :1 v/v / min,培養(yǎng)時間100-120 小時；.2、備用種子的制備間隔20-24小時重復制備步驟1中所述1.1到1. 4的各級種子的制備，將培養(yǎng)好的備用種子移入步驟1中所述工序1. 5已發(fā)酵培養(yǎng)20-24小時的發(fā)酵罐中再培養(yǎng)80-100小時；.3、半料培養(yǎng)基補入上述步驟1中所述1.5中發(fā)酵液培養(yǎng)48小時后，補入半料培養(yǎng)；.4、無菌水的補入上述1中所述1.5中發(fā)酵液培養(yǎng)80小時后，補入無菌水。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種西索霉素發(fā)酵過程中補入種子的方法，其特征在于半料培養(yǎng)基補入優(yōu)先選擇48—55小時，將已滅菌冷卻后的半料培養(yǎng)基一次或多次性補入。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種西索霉素發(fā)酵過程中補入種子的方法，其特征在于無菌水的補入優(yōu)先選擇81小時和88小時，將已滅菌冷卻后的無菌水一次或多次補入。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種西索霉素發(fā)酵過程中補入種子的方法，其特征在于各級培養(yǎng)基的組分如下.1、搖瓶種子培養(yǎng)基組成玉米淀粉0.8 1. 2%、黃豆餅粉0. 8 1. 2%、酵母粉0. 08 0. 12%、硫酸鎂 0. 03 0. 07%,玉米菜 0. 03 0. 07%、淀粉酶 0. 0008 0. 0012%;.2、一級種子培養(yǎng)基組成玉米淀粉2.8 3. 2%、黃豆餅粉0. 6 1. 0%、玉米漿0. 03 0. 07%、酵母粉0. 13 0. 17%、硫酸鎂0. 03 0. 07%、碳酸鈣0. 3 0. 7%、淀粉酶0. 00008 0. 00012%、泡敵 0. 008 0. 012%;.3、二級種子培養(yǎng)基組成玉米淀粉5.8 6. 2%、黃豆餅粉1. 2 1. 6%、酵母粉0. 13 0. 17%、硫酸鎂0. 03 0. 07%、玉米菜0. 03 0. 07%、碳酸鈣0. 3 0. 7%、氯化鈷0. 0003 0. 0007%、淀粉酶 0. 00008 0. 00012%、泡敵 0. 008 0. 012%;.4、三級種子培養(yǎng)基組成玉米淀粉5.8 6. 2%、黃豆餅粉1. 2 1. 6%、酵母粉0. 13 0. 17%、玉米菜0. 03 0. 07%、硫酸鎂0. 03 0. 07%、碳酸鈣0. 3 0. 7%、氯化鈷0. 0003 0. 0007%、淀粉酶 0. 00008 0. 00012%、泡敵 0. 008 0. 012%;.5、發(fā)酵培養(yǎng)基組成玉米淀粉5.8 6. 2%、黃豆餅粉1. 8 2. 2%、玉米漿0. 03 .0. 07%、碳酸鈣0. 03 0. 07%.、蛋氨酸0. 003 0. 007%.、氯化鈷0. 0003 0. 0007%、淀粉酶 0. 00008 0. 00012%、泡敵 0. 008 0. 012%;.6、半料培養(yǎng)基組成玉米淀粉2. 8 3. 2%、黃豆餅粉0.6 1.0%、玉米漿0.01 0. 05%、碳酸鈣0. 01 0. 05%、蛋氨酸0. 001 0. 005%、氯化鈷0. 0001 0. 0005%、淀粉酶 0. 00003 0. 00005%、泡敵 0. 008 0. 012%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種西索霉素發(fā)酵過程中補入種子的方法，它是以玉米淀粉、黃豆餅粉等為原材料，在微生物伊尼奧小單孢放線菌的作用下，種子經(jīng)過三級擴大培養(yǎng)，在已發(fā)酵培養(yǎng)20-24小時的發(fā)酵罐中補入種子進行再發(fā)酵，當發(fā)酵培養(yǎng)48小時后，進行一次半料補入，當發(fā)酵培養(yǎng)80小時后，進行一次到多次的補水，來制備較高和穩(wěn)定的西索霉素發(fā)酵液。本發(fā)明使發(fā)酵周期縮短了24小時左右，發(fā)酵過程中水、電用量也就相應地得到減少，節(jié)約了能源，降低了生產(chǎn)成本，有利于工業(yè)化大生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/29GK102505032SQ20111034163
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權日2011年11月3日
發(fā)明者胡建明, 薛建建, 陳振河, 陳雄 申請人:福建省建陽武夷味精有限公司