專利名稱：一種熒光假單胞菌重組蛋白疫苗及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種熒光假單胞菌重組蛋白疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)是一種革蘭氏陰性桿菌,能夠感染多種養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，包括鯉魚、羅非魚、牙鲆等。熒光假單胞菌感染魚類誘發(fā)一種被成為“紅皮病”的疾病，其癥狀為體表出血和潰爛，從而給產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，熒光假單胞菌病害防治尚無有效的疫苗，主要依賴抗生素類藥物的使用。因此，針對(duì)熒光假單胞菌的疫苗研發(fā)在我國(guó)亟需開展。重組亞單位疫苗是一種常見的疫苗形式，其主要原理是利用病原自身的一個(gè)抗原，經(jīng)異源表達(dá)后作為疫苗應(yīng)用，從而起到對(duì)病原的免疫保護(hù)作用。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌的一個(gè)外膜蛋白P478具有良好的免疫原性，在此基礎(chǔ)上將其構(gòu)建成了一個(gè)重組亞單位疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種熒光假單胞菌重組蛋白疫苗及其制備。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種熒光假單胞菌重組蛋白疫苗，疫苗抗原為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。所述重組蛋白疫苗為含有列表SEQ ID No. I的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pE478。所述重組蛋白疫苗為含有列表SEQ ID No. I的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pE478轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白。熒光假單胞菌重組蛋白疫苗的制備方法以熒光假單胞菌TSSl為模板，采用Fl/Rl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與載體pEASY-E2連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α，篩選質(zhì)粒ΡΕ478，質(zhì)粒ρΕ478轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)的含序列表SEQ ID No. I中的氨基酸的重組蛋白；所述引物為Fl :5’ -CATATGAACGACAACACTCTTTATG-3，；R1 5’ -CTCGAGGAAGTTGGCCTCCAGC-3’。熒光假單胞菌重組蛋白疫苗的應(yīng)用，所述重組蛋白疫苗在制備具有預(yù)防和治療熒光假單胞菌疫苗制劑中的應(yīng)用本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)I.高保護(hù)性。本發(fā)明的疫苗對(duì)熒光假單胞菌的免疫保護(hù)效率達(dá)81%。2.無需商業(yè)化佐劑。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的疫苗蛋白(泳道2)。泳道1，分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法I.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相
應(yīng)試劑盒。2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001)；3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購(gòu)自于“北京，紐英倫生物技術(shù)有限公司”。實(shí)施例I熒光假單胞菌疫苗抗原為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示(參見序列表I)。序列表IMSVRDLHVNDNTLYALLLASGLGGFAPLVLADDAQDVGSVNIAGKQTLGSGHMILEESAKARSTVTKQAMDEMSATANAIDKLKYTPGINVSSDDASGTSGTNFTMRGMSSDQVGVSVDGVPINDSGNYSVYSNQLGDPENLAKVFATQGSSEADGPHIGSSGGNIGMITIRPTKDAGVFAKQIVGANALRKTFVRANTCDLGGLKTWVSASHLE⑶KWRGKGTLRSDKIEWSSLi7E ⑶ NGNSTLATIKYNKQENYNYNSLSKAQFDTEGRRKDYAQSPVYKAGLLSASYKLNRNPFESVNATLTQRWQLQDNLSLTLTPYYYffANGGSFSGQTASNLGPKSDKAGNYDLSNLQSANYYRPSWTETWRPGFTAKMKWDINEEHSLDYGYWYERARQRQTQPFIGINNEGAPDDVWGDYNSGGQVVDKNGATVQGRHYYTVTPAQKLWVQDNWQATPDLSFVGGVAYQYVERDGNNLGSLYDTPEKRNTRYHQFLPNFSAKYQLDDSNQAFYNVTRNMRTPPNYVLYNKGDSVSLKSELSWNQELGWRYTEDDMALSATLFYISFKDRQVSTTDAS⑶YMVLNVGTVDNKGLELEWSGLLPHNFNYYASYTYTQSEQKDDLLSKNVLLPTSGKQLANVPENMFNLVFGYDDSRFYGNIAGKYVGSFYGDLTNKEKIEGRTVFDLNAGIYLPVDKKVIKSAALRFSMLNVFDKEYLSSARTVAFNSAPVNGLGASTAYYNVGEERTAMVSLEANF(a)序列特征 長(zhǎng)度753 類型氨基酸序列籲鏈型單鏈
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(C)假設(shè)否
(d)反義否(e)最初來源熒光假單胞菌TSSl(f)特異性名稱P478結(jié)構(gòu)特征該蛋白具有一個(gè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)(氨基酸1-24)和一個(gè)TonB依賴型蛋白的P Iug功能域(氨基酸48-156)。實(shí)施例2熒光假單胞菌疫苗表達(dá)載體的構(gòu)建方法質(zhì)粒pE478的構(gòu)建以熒光假單胞菌 TSSl為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94°C 60s預(yù)變性模板DNA，然后940C 40s, 50°C 60s, 72°C 60s, 5 個(gè)循環(huán)；然后 94°C 40s, 58°C 60s, 72°C 60s, 25 個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)lOmin。PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與載體pEASY_E2 (購(gòu)自于“北京全式金生物技術(shù)有限公司”)于室溫連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，挑取一個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PE478。所述LB組成成分按重量百分比計(jì)1. O %蛋白胨，O. 5 %酵母粉，I. O %氯化鈉，97. 5 %蒸餾水；所述菌株TSSl保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC No. 2329，分類命名為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens),保藏日期2008年I月9日。所述引物為Fl :5’ -CATATGAACGACAACACTCTTTATG-3’ 和 Rl 5’ -CTCGAGGAAGTTGGCCTCCAGC-3’。P478疫苗蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將上述的質(zhì)粒PE478用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE 3)(購(gòu)自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有Ap (100ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，挑取一個(gè)轉(zhuǎn)化子，將其命名為BL21/pE478。將BL21/pE478于含有Ap(100ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取Iml過夜后的培養(yǎng)液，加入IOOml新鮮的含有Ap (100ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C下轉(zhuǎn)速200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)至0D_為0. 6，加入終濃度為ImM的IPTG，37°C繼續(xù)以轉(zhuǎn)速160rpm搖動(dòng)培養(yǎng)4_5h，而后以5000g，4°C離心lOmin，收集菌液，加入5ml裂解液，在室溫于搖床上緩慢搖動(dòng)1-2小時(shí)，直至菌懸液變澄清為止。將菌液以IOOOOg,4°C離心30min,回收上清。將上清中的蛋白用His Trap HP Columns(購(gòu)于美國(guó)GE Healthcare公司)回收純化,純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)(8v/cm電壓下電泳25-30min，隨后15v/cm電壓下電泳2_2. 5h)，測(cè)定其分子量大小(參見圖I)。將純化的蛋白經(jīng)質(zhì)譜分析，證實(shí)其為具有序列表SEQ ID Nol中的氨基酸序列的抗原蛋白P478。所述裂解液為終濃度的IOmM NaH2PO4UOmM Tris和8M尿素，pH 8. O。實(shí)施例3疫苗的應(yīng)用步驟I)佐劑及疫苗混合液的制備。佐劑制備將5% (質(zhì)量比)NaOH和5% (質(zhì)量比)Al2 (SO4) 3以2 5體積比混合，將混合物以10，OOOg離心5分鐘。將沉淀懸浮于PBS中至0. 2mg/ml。疫苗混合液制備將上述實(shí)施例純化的疫苗蛋白P478在PBS中稀釋至200ug/ml ；將稀釋后的疫苗蛋白與佐劑等體積混合。佐劑對(duì)照液制備將PBS與佐劑等體積混合。所述 PBS 組成成分按重量百分比計(jì)0. 8% NaCl,0. 02% KCl,0. 358% Na2HPO4. 12Η20，0· 024%NaH2PO4，余量為水步驟2) P478疫苗的免疫應(yīng)用。將80條牙鲆(每條重約12. 2g)隨機(jī)分為2組，每組40條。將這2組分別命名為A和B組。將A組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟I)的疫苗混合液，將B組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟I)的佐劑對(duì)照液。步驟3)熒光假單胞菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)熒光假單胞菌TSS I至OD6tltlS 1，然后離心(5000g，4°C) lOmin。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為IxlO7Cfu/ml ο步驟4)P478疫苗免疫保護(hù)效應(yīng)檢測(cè)。在步驟2)免疫注射后的第30天，用上述步驟3)的熒光假單胞菌懸液腹腔注射步驟2)的2組魚，每條魚的注射量為lOOul。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計(jì)各組魚的總死亡數(shù)目A組，7條；B組，36條。利用下列公式計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)效率(RPS)RPS = 100x(l-免疫組魚的總死亡百分比/對(duì)照組魚的總死亡百分比)根據(jù)此公式算出P478疫苗的免疫保護(hù)效率為81 %。因此，所得疫苗能夠高效地保護(hù)牙鲆抵御熒光假單胞菌侵染。
權(quán)利要求
1.一種熒光假單胞菌重組蛋白疫苗，其特征在于疫苗抗原為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。
2.按權(quán)利要求I所述的熒光假單胞菌重組蛋白疫苗，其特征在于所述重組蛋白疫苗為含有列表SEQ ID No. I的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pE478。
3.按權(quán)利要求I或2所述的熒光假單胞菌重組蛋白疫苗，其特征在于所述重組蛋白疫苗為含有列表SEQ ID No. I的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pE478轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白。
4.一種權(quán)利要求I所述的熒光假單胞菌重組蛋白疫苗的制備方法，其特征在于以熒光假單胞菌TSSl為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與載體PEASY-E2連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5，篩選質(zhì)粒pE478，質(zhì)粒pE478轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE 3)表達(dá)的含序列表SEQ ID No. I中的氨基酸的重組蛋白；所述引物為Fl :5’ -CATATGAACGACAACACTCTTTATG-3’ ；R1 :5’ -CTCGAGGAAGTTGGCCTCCAGC-3’。
5.一種權(quán)利要求I所述的熒光假單胞菌重組蛋白疫苗的應(yīng)用，其特征在于所述重組蛋白疫苗在制備具有預(yù)防和治療熒光假單胞菌疫苗制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種熒光假單胞菌重組蛋白疫苗及其制備方法。疫苗抗原為序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。具體為以熒光假單胞菌TSS1為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與載體pEASY-E2連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，篩選質(zhì)粒pE478，質(zhì)粒pE478轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE 3)表達(dá)的含序列表SEQ ID No.1中的氨基酸的重組蛋白。本發(fā)明的疫苗對(duì)熒光假單胞菌的免疫保護(hù)效率達(dá)81％。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102614504SQ20121006516
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月13日
發(fā)明者孫黎, 胡永華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所