一種hcv多表位肽與截短型ns3、dc活化分子eda重組蛋白疫苗及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白及其應(yīng)用，該重組蛋白疫苗包括以下EDA，ΔNS3以及3個(gè)HCVmulti-epitopes：其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。HCVEDA-ΔNS3-VAL-44蛋白可以誘導(dǎo)出特異性的體液免疫應(yīng)答以及T細(xì)胞免疫應(yīng)答，T細(xì)胞經(jīng)過(guò)特異性抗原刺激以后可以迅速產(chǎn)生IFN-γ并產(chǎn)生高效的CTL，該種HCV多表位肽及其與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗可能是較理想的HCV預(yù)防/治療性候選疫苗。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于HCV疫苗【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]丙型肝炎病毒(h印atitis C virus，HCV)，為黃病毒屬的單股正鏈?zhǔn)雀蜶NA病毒，是引發(fā)慢性肝病的主要病原體，全球約有1.7億感染者，發(fā)病人數(shù)以每年三百萬(wàn)速度遞增。慢性HCV感染與肝硬化和肝癌直接相關(guān)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。由于HCV標(biāo)準(zhǔn)治療方案費(fèi)用高昂，療效不理想使得發(fā)展中國(guó)家大多數(shù)HCV感染患者難以承受。因此研發(fā)HCV疫苗成為降低HCV所引發(fā)的肝硬化，肝癌發(fā)生率最為有效的策略之一。
[0003]HCV基因組分別編碼核心蛋白C，包膜蛋白El、E2，p7和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3，NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。但由于HCV病毒RNA聚合酶缺乏校對(duì)功能，病毒變異率高，尤其是位于包膜糖蛋白E2的中和抗原位點(diǎn)存在高變區(qū)，傳統(tǒng)的以產(chǎn)生保護(hù)性抗體為主的疫苗研發(fā)面臨重重困難。
[0004]研究表明，急性病患體內(nèi)多特異性CTL可以使病情逐漸轉(zhuǎn)歸、自愈。慢性HCV病人T細(xì)胞應(yīng)答雖然具有多克隆以及多特異性，但強(qiáng)度遠(yuǎn)不如急性病人的免疫應(yīng)答強(qiáng)烈，相對(duì)較弱的抗HCV免疫應(yīng)答導(dǎo)致病毒難以被清除。與此同時(shí)，肝內(nèi)大量的HCV特異性CD8+T細(xì)胞分泌Y干擾素的水平受到抑制，因此，慢性HCV感染時(shí)CD8+T細(xì)胞功能障礙是造成免疫系統(tǒng)不能控制HCV復(fù)制，導(dǎo)致疾病慢性化的主要原因。
[0005]近10年來(lái)，對(duì)HCV感染發(fā)病機(jī)制、保護(hù)性免疫應(yīng)答和病毒持續(xù)感染機(jī)制的認(rèn)識(shí)取得了較大進(jìn)展。中和抗體以及CD4+和CD8+T細(xì)胞所引發(fā)強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫應(yīng)答已被證明與HCV的清除相關(guān)，這將是研制丙型肝炎疫苗的希望所在。
[0006]大量證據(jù)表明，HCV非結(jié)構(gòu)蛋白介導(dǎo)的持續(xù)性、強(qiáng)烈的、多特異性的Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答水平直接關(guān)系到病毒是否能被清除以及疾病的預(yù)后。由于大多數(shù)慢性患者HCV亞型的差異，成功的疫苗應(yīng)該誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的多特異性免疫應(yīng)答，包括CD4+及CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，HCV表位疫苗更傾向于選取保守區(qū)域。
[0007]本研究前期將篩選出的HCV 2個(gè)CTL表位:NS5A(1991-1999) VLSDFKVWL以及NS4B (1793-1801) SMMAFSAAL,加入一個(gè)通用 Th 表位 KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL 進(jìn)行了不同的組合，包括是否含有Th表位，共合成了 8條不同排列組合方式的多肽，經(jīng)過(guò)小鼠體內(nèi)試驗(yàn)，合成肽與HLA-A*0201相對(duì)親和力和穩(wěn)定性檢測(cè)以及與HCV病人PBMC相作用3部分實(shí)驗(yàn)初步確定了 VLSDFKVWLKKKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLKKSMMAF
SAAL (簡(jiǎn)稱(chēng)VAL-44)這種排列組合方式效果最優(yōu)，將這種HCV多肽疫苗皮下免疫HHD-2小鼠后，可以引起脾細(xì)胞增殖，⑶4+、⑶8+T淋巴細(xì)胞百分比增高以及以Thl型反應(yīng)為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答，但總體來(lái)說(shuō)，免疫效果尚不十分理想，為了克服肽疫苗免疫源性較弱的缺陷，我們最終選擇了纖連蛋白外部結(jié)構(gòu)域A (Fibronectin Extra Domain A,EDA),聯(lián)合截短的NS3插入到3個(gè)多表位的上游，構(gòu)建起EDA-ANS3-VAL-44原核表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，純化得到EDA- A NS3-VAL-44目的蛋白，輔以能夠活化To 11樣受體 3 的免疫佐劑 poly (1: C) (Yu-sheng Cheng and Feng Xu.Anticancer function ofpolyinosinic-polycytidylic acid.Cancer Biology & Therapy.2010;10:1219-1223)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。 [0008]纖連蛋白外部結(jié)構(gòu)域A (Fibronectin Extra Domain A, EDA)是一種DC活化因子，主要起著募集DC并激發(fā)其成熟的作用；EDA通過(guò)與Toll樣受體4相互作用產(chǎn)生共刺激因子，使DC遷移至淋巴結(jié)，輔助DC發(fā)揮較強(qiáng)的攝取加工抗原的作用，并誘導(dǎo)DC成熟，從而激活抗病毒以及抗腫瘤的T細(xì)胞應(yīng)答(Mansilla C，Gorraiz M, Martinez M, CasaresN， Arribillaga L, Rudilla F， et al.1mmunization against hepatitis C viruswith a fusion protein containing the extra domain A from fibronectin and thehepatitis C virus NS3 protein.Journal of Hepatology.2009; 51:520-7.)? 由于DC細(xì)胞的成熟是效應(yīng)T細(xì)胞啟動(dòng)的必要環(huán)節(jié)，目前多種活化DC的分子成為疫苗研發(fā)的熱點(diǎn)。近幾年，相繼有將抗原與不同促DC成熟刺激物混合的免疫策略，并發(fā)現(xiàn)在這些刺激物的作用下可以激發(fā)更為顯著的免疫應(yīng)答(Liu QH, Bohlen H，Titzer S，Christensen0, Diehl V, Hescheler J, et al.Expression and a role of functionally coupledP2Y receptors in human dendritic cells.FEBS Lett.1999;445:402-8.和 SchwarzK, Storni T, Manolova V, Didierlaurent A, Sirard JC, Rothlisberger P, et al.Role of Toll-like receptors in costimulating cytotoxic T cell responses.Eur JImmunol.2003;33:1465-70.和Resta R, Yamashita Y, Thompson LF.Ecto-enzyme andsignaling functions of lymphocyte CD73.1mmunol Rev.1998;161:95-109.X
[0009]HCV NS3蛋白編碼基因全長(zhǎng)共1893個(gè)核苷酸。截短的NS3是編碼絲氨酸蛋白酶區(qū)域，該區(qū)域在多聚蛋白前體的加工和成熟方面起著非常重要的作用。針對(duì)NS3的CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答能夠有效刺激IFN- y的生成，增強(qiáng)對(duì)IFN- a治療的敏感性，與HCV感染的自限性和良好轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，14例HCV感染患者中的8例自限性患者均具有NS3特異性免疫應(yīng)答，而65例發(fā)展為慢性丙型肝炎的患者中僅有5例具有NS3特異性免疫應(yīng)答，提示抗NS3免疫應(yīng)答與病毒的清除相關(guān)(Di印older HM, Zachoval R, HoffmannRM, Wierenga EA, Santantonio T, Jung MC, et al.Possible mechanism involvingT-1ymphocyte response to non—structural protein 3 in viral clearance in acutehepatitis C virus infection.Lancet.1995; 346:1006-7.)? 目前已證實(shí)，ANS3 上集中了多個(gè) T 細(xì)胞表位(如 NS3 1073-1081，HCV NS3 1038-1047，NS3 1100-1107 等)，因此它也是HCV疫苗研發(fā)中備受重視的主要靶點(diǎn)抗原之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗及其應(yīng)用，該重組HCV蛋白疫苗可以誘導(dǎo)出特異性的體液免疫應(yīng)答，以及特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，包括特異性CTL發(fā)生，T細(xì)胞經(jīng)過(guò)特異性抗原刺激以后可迅速產(chǎn)生IFN- y o
[0011]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗，其特征在于:包括以下纖連蛋白外部結(jié)構(gòu)域A，ANS3以及VAL-44:其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
[0012]所述的一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗在制備針對(duì)丙型肝炎病毒的預(yù)防性/治療性疫苗的應(yīng)用。
[0013]所述的一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗的構(gòu)建在制備抗丙型肝炎病毒的藥物中的應(yīng)用。
[0014]所述的藥物為誘發(fā)針對(duì)丙型肝炎病毒的體液免疫應(yīng)答的藥物。
[0015]所述的藥物為誘發(fā)針對(duì)丙型肝炎病毒的細(xì)胞免疫應(yīng)答的藥物。
[0016]所述的藥物為刺激分泌IFN-Y的細(xì)胞增殖的藥物。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
本發(fā)明提供的一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗，采用前期經(jīng)體內(nèi)、外試驗(yàn)篩選出的3個(gè)HCV多表位最優(yōu)的排列組合方式，為了使所設(shè)計(jì)的疫苗可以使靶抗原被樹(shù)突狀細(xì)胞所遞呈，引發(fā)強(qiáng)烈的體液、細(xì)胞免疫應(yīng)答，特在3個(gè)多表位上游引入EDA以及經(jīng)截短的NS3。經(jīng)體內(nèi)試驗(yàn)表明該蛋白疫苗具有強(qiáng)的免疫原性，表現(xiàn)出了良好的免疫效果包括:
可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答；
可以誘導(dǎo)出特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答；
經(jīng)過(guò) 特異性抗原刺激以后可以迅速產(chǎn)生IFN-Y ；
該HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗疫苗可能是較理想的HCV預(yù)防/治療性候選疫苗。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為pET32a載體的示意圖；
圖2為重組質(zhì)粒pET32a-EDA-ANS3-VAL-44酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳后的成像圖； 圖3為HCV EDA-ANS3-VAL-44蛋白原核表達(dá)的可溶性分析圖；
圖4為HCV EDA-A NS3-VAL-44蛋白的純化結(jié)果圖；
圖 5 為 Western blot 法鑒定 HCV EDA-A NS3-VAL-44 蛋白結(jié)果圖；
圖6 HCV疫苗免疫程序示意圖；
圖7為ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清特異性抗體效價(jià)結(jié)果；
圖8為各組免疫小鼠CTL活性檢測(cè)比較；
圖9為ELISP0T法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-Y情況；
圖10為ELISP0T法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-Y情況統(tǒng)計(jì)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0020]在HCV的表位中篩選的3個(gè)表位串聯(lián)，并在其上游插入EDA以及截短的NS3，通過(guò)構(gòu)建的原核表達(dá)載體對(duì)大腸桿菌BL21進(jìn)行轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)，純化出HCV EDA- A NS3-VAL-44目的蛋白作為疫苗進(jìn)行免疫，以達(dá)到針對(duì)HCV的免疫效果，從而達(dá)到預(yù)防/治療性丙型肝炎的目的，這些免疫效果包括:引發(fā)包括體液免疫應(yīng)答，引發(fā)分泌IFN-Y細(xì)胞因子為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答及特異性的CTL反應(yīng)。
[0021]1、鑒于上述目的，首先進(jìn)行一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗的構(gòu)建。
[0022]具體的基因?yàn)?
該目的基因由三部分組成，包括EDA，A NS3以及3個(gè)HCV多表位。3個(gè)多表位按照:NS5A( 1991-1999)-KK-Th表位-KK- NS4B(1793-1801)順序排列。為了使所構(gòu)建的蛋白疫苗靶向遞呈至樹(shù)突狀細(xì)胞，特在上游插入EDA，所選擇截短的NS3是編碼絲氨酸蛋白酶的序列。
[0023]N0.1:HCV EDA-A NS3-VAL-44 核苷酸序列 AACATTGATCGCCCTAAAGGACTGGCATTCACTGATGTGGATGTCGATTCCATCAAAATTGCTTGGGAAAGC
CCACAGGGGCAAGTTTCCAGGTACAGGGTGACCTACTCGAGCCCTGAGGATGGAATCCGGGAGCTTTTCCCTGCACCTGATGGTGAAGACGACACTGCAGAGCTGCAGGGCCTCAGGCCGGGGTCTGAGTACACAGTCAGTGTGGTTGCCTTGCACGATGATATGGAGAGCCAGCCCCTGATTGGAATCCAGTCCACAGCGCCCATCACGGCTTACTCCCAACAGACGCGGGGCTTGCTTGGTTGTATCATCACCAGCCTCACAGGCCGGGACAAGAACCAAGTCGAGGGGGAGGTTCAAGTGGTTTCCACCGCAACACAATCTTTCCTGGCGACCTGCGTCAACGGCGTGTGTTGGACCGTCTATCATGGCGCTGGCTCAAAGACCTTAGCCGGCCCAAAAGGCCCAATTACCCAAATGTACACTAATGTAGATCAGGACCTCGTCGGCTGGCCGGCGCCCTCTGGGGCGCGTTCCTTGACACCATGCACTTGCGGCAGCTCGGACCTTTACTTGGTCACGAGATATGCCGATGTCATTCCGGTGCGCCGGCGGGGTGACAGTAGGGGGAGTCTACTCTCCCCCAGGCCTGTCTCCTACTTGAAGGGCTCTTCGGGTGGCCCACTGCTCTGCCCTTCGGGGCACGCTGCGGGTATCTTCCGGGCTGCTGTGTGCACCCGAGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTCGTACCCGTTGAGTCTATGGAAACTACCATGCGGTCTCCGGTCTTCACAGACAACTCATCCCCCCCGGCCGTGCTGTCTGACTTCAAAGTCTGGCTCAAGAAAAAGTTTCCAGGCGGAGGGCAGATCGTGGGTGGCGTCTACCTGCTCCCCAGGAGAGGACCTCGGCTGAAAAAGAGCATGATGGCCTTCTCCGCCGCTCTCN0.2 =EDA的核苷酸序列
AACATTGATCGCCCTAAAGGACTGGCATTCACTGATGTGGATGTCGATTCCATCAAAATTGCTTGGGAAAGCCCACAGGGGCAAGTTTCCAGGTACAGGGTGACCTACTCGAGCCCTGAGGATGGAATCCGGGAGCTTTTCCCTGCACCTGATGGTGAAGACGACACTGCAGAGCTGCAGGGCCTCAGGCCGGGGTCTGAGTACACAGTCAGTGTGGTTGCCTTGCACGATGATATGGAGAGCCAGCCCCTGATTGGAATCCAGTCCACAN0.3: ANS3的核苷酸序列
GCGCCCATCACGGCTTACTCCCAACAGACGCGGGGCTTGCTTGGTTGTATCATCACCAGCCTCACAGGCCGGGACAAGAACCAAGTCGAGGGGGAGGTTCAAGTGGTTTCCACCGCAACACAATCTTTCCTGGCGACCTGCGTCAACGGCGTGTGTTGGACCGTCTATCATGGCGCTGGCTCAAAGACCTTAGCCGGCCCAAAAGGCCCAATTACCCAAATGTACACTAATGTAGATCAGGACCTCGTCGGCTGGCCGGCGCCCTCTGGGGCGCGTTCCTTGACACCATGCACTTGCGGCAGCTCGGACCTTTACTTGGTCACGAGATATGCCGATGTCATTCCGGTGCGCCGGCGGGGTGACAGTAGGGGGAGTCTACTCTCCCCCAGGCCTGTCTCCTACTTGAAGGGCTCTTCGGGTGGCCCACTGCTCTGCCCTTCGGGGCACGCTGCGGGTATCTTCCGGGCTGCTGTGTGCACCCGAGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTCGTACCCGTTGAGTCTATGGAAACTACCATGCGGTCTCCGGTCTTCACAGACAACTCATCCCCCCCGGCCN0.4:3個(gè)多表位核苷酸序列
GTGCTGTCTGACTTCAAAGTCTGGCTCAAGAAAAAGTTTCCAGGCGGAGGGCAGATCGTGGGTGGCGTCTACCTGCTCCCCAGGAGAGGACCTCGGCTGAAAAAGAGCATGATGGCCTTCTCCGCCGCTCTC
將編碼纖連蛋白外部結(jié)構(gòu)域A，截短的NS3以及所前期篩選的3個(gè)HCV表位的基因上下游分別插入EcoRI和Sal I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，目的基因序列經(jīng)化學(xué)合成后與原核載體pET-32a(+ )載體(見(jiàn)圖1)連接。重組pET-32a ( + )/HCV EDA-ANS3-VAL-44由南京金斯瑞生物科技有限公司構(gòu)建并提供。
[0024]將含有目的基因的菌劃線(xiàn)接種于含Amp抗性的LB平板上，37°C培養(yǎng)。次日挑取單菌落于含Amp抗性L(fǎng)B液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA。提取的質(zhì)粒用EcoRI和Sal I于37 °C水浴進(jìn)行3h雙酶切。
[0025]酶切產(chǎn)物取10 Ul在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察并保存結(jié)果。陽(yáng)性克隆應(yīng)該切出大約978 bp的條帶(見(jiàn)圖2)，而載體的大小為5900 bp。圖中廣2為pET32a-EDA- A NS3-VAL-44經(jīng)EcoRI和Sal I雙酶切后的結(jié)果圖，3是pET32a空載體對(duì)照，M是DNA marker.篩選出的含978 bp的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司，用T7引物進(jìn)行DNA測(cè)序加以確認(rèn)。
[0026]2、誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。以熱休克法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞:取IOiU陽(yáng)性重組質(zhì)粒加入100 U I感受態(tài)DH5a中輕柔混勻在冰上放置30min，快速移至42°C水浴，熱休克90s，勿搖動(dòng)離心管，迅速冰浴2min。加入800 預(yù)溫至37°C的LB培養(yǎng)基37°C，160 rpm/min緩搖40min左右使細(xì)菌復(fù)蘇，并表達(dá)抗生素抗性基因。離心2，500gX5min，吸去700 U I上清，保留100 U I用于重懸沉淀。將細(xì)菌懸液分別涂于LB(Amp+)平板上，待液體完全吸收后，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)12~16h，觀(guān)察菌落。
[0027]挑選4個(gè)陽(yáng)性克隆分別接種于5mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)18h,分別取50uL加到5mL`含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)2~3h，0.5M IPTG誘導(dǎo)4h，取ImL誘導(dǎo)表達(dá)菌液以及未誘導(dǎo)的菌液離心，回收菌體沉淀。將誘導(dǎo)前后的樣本重懸到去離子水中，加入2 X SDS上樣緩沖液，100°C沸水浴5min，12，OOOrpm離心lOmin，取10 u I上清進(jìn)行SDS-PAGE，電泳條件為150V恒壓。凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色2h，脫色液脫色f3h，觀(guān)察目的蛋白表達(dá)條帶以及表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)形式。
[0028]含pET-32a-EDA- A NS3-VAL-44質(zhì)粒的重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析在相對(duì)分子量約為55kD處有明顯的特異性蛋白表達(dá)條帶，其大小與預(yù)測(cè)的目的蛋白的大小相符。表達(dá)的目的蛋白大多以可溶形式存在于上清中(圖3)，圖3為HCV EDA-ANS3-VAL-44蛋白原核表達(dá)的可溶性分析圖。圖中I是未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白表達(dá);M是低分子量蛋白marker ；2是經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全細(xì)菌裂解物，3是經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的裂解上清，4是經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的裂解沉淀。
[0029]3、采用活性條件進(jìn)行親和層析法純化蛋白。經(jīng)N1-NTA親和色譜柱上樣洗脫，對(duì)洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析的結(jié)果表明獲得了純化的HCV EDA-ANS3-VAL-44融合蛋白(圖4)。圖4為HCV EDA-ANS3-VAL-44蛋白的純化結(jié)果圖。其中M是低分子量蛋白marker，f 4均是純化出的蛋白。用BCA法測(cè)得蛋白濃度為1.55mg/ml。
[0030]SDS-PAGE分離HCV EDA- A NS3-VAL-44重組蛋白，電轉(zhuǎn)移至NC膜上。將膜浸在封閉液中(PBST溶解的5%脫脂奶粉)4°C過(guò)夜。用PBST洗膜三次，每次15min。1:1000稀釋的抗His標(biāo)簽兔單克隆抗體作為一抗，共同孵育lh，PBST洗膜三次。將膜與1:10000稀釋的紅外標(biāo)記的抗兔IgG共孵育lh，PBST洗膜三次，Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃描，結(jié)果在相對(duì)分子質(zhì)量約為55 kD處呈現(xiàn)特異性染色條帶，表明其為HCV EDA- A NS3-VAL-44蛋白(圖5)，其中M是低分子量蛋白marker，I是以BSA作為的對(duì)照，2是純化出的蛋白。
[0031] 4、以HHD-2小鼠作為免疫對(duì)象，將原核表達(dá)的HCV蛋白疫苗進(jìn)行免疫以觀(guān)察其所能引發(fā)的免疫效果，具體的免疫方案為:
選用6-8周齡HHD-2小鼠18只，雌雄不拘，分為EDA-ANS3，EDA- ANS3-VAL-44以及PBS皮下給藥組，每組各6只。第一次用弗氏完全佐劑，之后用弗氏不完全佐劑。給藥時(shí)，純化的蛋白100 Ug /只，poly(1:C) 50 Ug /只以及PBS與弗氏佐劑1:1等體積充分乳化。融合蛋白或PBS與弗氏佐劑充分混勻后皮下注射小鼠，間隔2周加強(qiáng)免疫一次，共免疫3次。第2周、第4周、第6周通過(guò)尾靜脈取血，分離血清檢測(cè)抗體產(chǎn)生情況，第6周處死小鼠，檢測(cè)細(xì)胞免疫應(yīng)答水平(圖6)。
[0032]5、免疫后的免疫效果的檢測(cè)
5.1體液免疫水平檢測(cè)通過(guò)ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清特異性抗體效價(jià)。將純化的HCV ￡04-八吧3-￥41-44蛋白稀釋至101^/1111，41:包被過(guò)夜；洗滌3次，加入3%BSA 100 U I/孔，37 °C 孵育 I ho PBS 洗滌 3 次后，加 A 1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800稀釋的免疫小鼠血清，37°C孵育I hrs ;洗滌后實(shí)驗(yàn)孔加入1:20000稀釋的HRP-抗鼠二抗，37°C孵育I h ;洗滌后OPD顯色，室溫靜置15 min后加入2M H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定各孔的A492值。以正常小鼠血清為陰性對(duì)照，試驗(yàn)組/對(duì)照組≥2.1時(shí)判定為陽(yáng)性。ELISA滴度表示為最后稀釋度的對(duì)數(shù)。
[0033]各組融合蛋白免疫小鼠的抗體效價(jià)均隨著免疫時(shí)間及次數(shù)的增加而逐漸升高。其中融合蛋白EDA-ANS3-VAL-44免疫組抗體效價(jià)在首次免疫后第四周達(dá)到最高，為1:12800，并在隨后的二周內(nèi)持續(xù)保持這一水平，與PBS免疫組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。此外，EDA-ANS3蛋白組最高抗體效價(jià)達(dá)到了 1:6400 (圖7)，與PBS對(duì)照組相比具有顯著差異。
[0034]5.2細(xì)胞免疫水平檢測(cè)
5.2.1 CTL殺傷性
用LDH (乳酸脫氫酶)細(xì)胞殺傷檢測(cè)試劑盒(具體操作流程按照說(shuō)明書(shū))檢測(cè)CTL活性。最后一次免疫后13天處死小鼠，取脾細(xì)胞，用HCV EDA-ANS3-
VAL-44蛋白(10 ii g/ml)刺激5天的T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，用轉(zhuǎn)染了 HCVEDA- A NS3-VAL-44重組質(zhì)粒的ClR.AAD細(xì)胞(是將HMYClR細(xì)胞轉(zhuǎn)染了人HLA-A2.1的a I和0 2結(jié)構(gòu)域基因和鼠11-20(1的a 3結(jié)構(gòu)域基因的重組細(xì)胞，在CTL殺傷實(shí)驗(yàn)中，適合用作評(píng)價(jià)HLA-A2分子限制性表位的靶細(xì)胞)在CTL殺傷實(shí)驗(yàn)中做靶細(xì)胞。設(shè)培養(yǎng)液背景孔、體積校正孔、靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔、靶細(xì)胞最大釋放孔、效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔、LDH陽(yáng)性對(duì)照孔以及實(shí)驗(yàn)孔(按效靶比分別為50.0:1，25.0:1, 12.5:1以及6.25:1比例將靶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞加載至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔總體積為100 μl)。
[0035]試驗(yàn)過(guò)程如下:按上述將細(xì)胞或培養(yǎng)液加入96孔板中，37V,5% CO2孵箱中培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結(jié)束后，吹打每孔I min，吸取每孔上清50 yl，轉(zhuǎn)移到新的96孔板(每孔加入50yl檢測(cè)試劑)，室溫反應(yīng)lh。測(cè)定每孔0D490 nm的吸光度(A)值，計(jì)算每個(gè)效/靶比時(shí)殺傷百分比。
【權(quán)利要求】
1.一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗，其特征在于:包括以下纖連蛋白外部結(jié)構(gòu)域A，ANS3以及VAL-44:其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗在制備針對(duì)丙型肝炎病毒的預(yù)防性/治療性疫苗的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗，在制備抗丙型肝炎病毒的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物為誘發(fā)針對(duì)丙型肝炎病毒的體液免疫應(yīng)答的藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物為誘發(fā)針對(duì)丙型肝炎病毒的細(xì)胞免疫應(yīng)答的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物為刺激分泌IFN-Y的細(xì)胞增殖的藥物 。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK103601809SQ201310324897
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月30日
【發(fā)明者】黃小軍, 呂欣, 尹文, 雷迎峰, 張瑞國(guó), 楊敬, 姚敏, 賈戰(zhàn)生, 蘭海云, 張建敏, 曲萍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)