專利名稱：一種纖維化纖維微細(xì)菌及滲透發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖方法技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及以葡萄糖為基質(zhì)利用纖維化纖維微細(xì)菌滲透發(fā)酵生產(chǎn)胞外海藻糖的方法。
背景技術(shù)：
據(jù)《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)》(Croweet al, Biochim. Biophys. Acta, 1984,769 :151-159)和《食品化學(xué)》(Ohtani et al, Food Chem.，1994，2 :91-95)介紹，海藻糖(a -D-吡喃葡糖基-a -D-吡喃葡糖苷)是一種廣泛分布在植物、昆蟲、真菌和細(xì)菌中的非 還原葡萄糖苷，此雙糖可用作為能源的一種存儲(chǔ)形式和干燥或冷凍等環(huán)境壓力的防護(hù)劑。由于在其分子結(jié)構(gòu)中沒有還原端，海藻糖不僅顯示出對(duì)極端的溫度、PH和美拉德反應(yīng)的抵抗性，而且還具有很高的持水活性，因此海藻糖具有幫助穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物膜完整性的功能。由于這些有用的特性，據(jù)《海藻糖21世紀(jì)的新型糖類》(黃日波等，北京，化學(xué)工業(yè)出版社，2010年第I版74-198頁(yè))介紹，海藻糖在醫(yī)藥、化妝品和食品等領(lǐng)域有許多應(yīng)用，比如可用作抗體藥物、疫苗、診斷試劑、活體細(xì)胞或組織在冷凍和干燥時(shí)的生物活性保護(hù)劑，可作為藥物傳遞系統(tǒng)的良好輔料，可用于化妝品的保濕、細(xì)胞保護(hù)、防止油脂分解及減少體臭、抗輻射等功效成分，作為淀粉老化、蛋白質(zhì)變性和脂類氧化的抑制劑，以及用作蔬菜或肉類的穩(wěn)定劑和保鮮劑。據(jù)《糖原生物學(xué)》(Elbeinet al,Glycobiology, 2003,13 17-27)和《海藻糖》(黃日波等，海藻糖21世紀(jì)的新型糖類，北京化學(xué)工業(yè)出版社，2010年第I版31-55頁(yè))中介紹，目前商品化的海藻糖生產(chǎn)方法主要有三種(I)酵母細(xì)胞提取法，是采取收集酵母細(xì)胞用熱乙醇來(lái)進(jìn)行提取。但該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，效率低，提取溶劑用量大，而且胞內(nèi)海藻糖含量不高，由此導(dǎo)致成本較高，使其在海藻糖需求量最大的食品行業(yè)難于推廣使用。(2)微生物發(fā)酵法，該方法是在一定的基質(zhì)上培養(yǎng)微生物，通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生海藻糖，再?gòu)陌l(fā)酵液中提取純化而獲得產(chǎn)品化的海藻糖。雖然之前有效生產(chǎn)海藻糖的微生物已被廣泛篩選，且已有幾種微生物被分離成功并應(yīng)用于海藻糖發(fā)酵商業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)，但到目前為止，由于現(xiàn)有的許多生產(chǎn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化率較低，且發(fā)酵液中糖類副產(chǎn)物較多，從而使海藻糖的提取、精制比較困難。(3)細(xì)菌酶轉(zhuǎn)化法，是將一些細(xì)菌體內(nèi)相關(guān)的海藻糖合成酶提取出來(lái)后，利用其轉(zhuǎn)糖基作用于催化底物來(lái)合成海藻糖。目前可應(yīng)用的酶轉(zhuǎn)化法有麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶雙酶法、糖基轉(zhuǎn)移酶和淀粉酶雙酶法以及海藻糖合成酶法。酶轉(zhuǎn)化法有特異性好、轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點(diǎn)，但所用的酶需要精制，由于制酶的費(fèi)用較高，且產(chǎn)品分離過(guò)程較復(fù)雜，因此生產(chǎn)成本較高。目前應(yīng)用的酶轉(zhuǎn)化系統(tǒng)大多是從麥芽寡糖生產(chǎn)海藻糖，從葡萄糖(工業(yè)生產(chǎn)有機(jī)物質(zhì)的有用起始材料之一)有效生產(chǎn)海藻糖的信息較缺乏。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種纖維化纖維微細(xì)菌(Cellulosimicrobium cellulans) S32,并利用該纖維化纖維微細(xì)菌進(jìn)行滲透發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，達(dá)到生產(chǎn)工藝集約、轉(zhuǎn)化率高且產(chǎn)品易于分離的技術(shù)目的。本發(fā)明提供的一種新的纖維化纖維微細(xì)菌菌株，是從合肥地區(qū)榆樹枯木枝上分離得到的，命名為纖維化纖維微細(xì)菌(Cellulosimicrobium cellulans) S32,菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 5841，保藏日期為2012年3月2日，保藏機(jī)構(gòu)為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明的利用纖維化纖維微細(xì)菌滲透發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖的方法，其特征在于先將菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 5841的纖維化纖維微細(xì)菌(Cellulosimicrobium cellulans) S32菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)，按培養(yǎng)基體積的5%接種量轉(zhuǎn)入置有組分按每升培養(yǎng)基中所含的質(zhì)量克數(shù)為葡萄糖20、酵母粉5、蛋白胨5、玉米漿10、MgSO4 I、KH2PO4 I和CaC037 (g/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，裝液量為發(fā)酵罐容積的70%，培養(yǎng)溫度為30°C，空氣流量4L/min，轉(zhuǎn)速300r/min ;培養(yǎng)30h后，向培養(yǎng)液中添加至終濃度為5_10g/L的(NH4)2SO4和60g/L的葡萄糖，再培養(yǎng)7h ;然后將發(fā)酵液離心或過(guò)濾除去菌株細(xì)胞，得到含海藻糖的溶液；采用截留相對(duì)分子量為10000的超濾膜脫除大分子物質(zhì)，用陰陽(yáng)離子交換樹脂脫鹽、分離海藻糖和葡萄糖；將收集的海藻糖組分加熱蒸發(fā)濃縮，再噴霧干燥，即得到海藻糖成品。在上述生產(chǎn)菌株培養(yǎng)30h后，優(yōu)選向培養(yǎng)液中添加終濃度為8g/L的(NH4)2S04。本發(fā)明方法由于以葡萄糖為底物，利用纖維化纖維微細(xì)菌菌株培養(yǎng)后，纖維化纖維微細(xì)菌以葡萄糖為基質(zhì)滲透發(fā)酵，從而可以大量合成胞外海藻糖。采用本發(fā)明方法生產(chǎn)海藻糖，生產(chǎn)工藝集約、設(shè)備投資少、且無(wú)糖類副產(chǎn)物、產(chǎn)品易于分離，其突出特點(diǎn)是海藻糖轉(zhuǎn)化率高達(dá)60%，使生產(chǎn)成本降低，從而為海藻糖的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。采用本發(fā)明方法所制備的海藻糖由于其對(duì)生物大分子良好的非特異性保護(hù)作用而在醫(yī)藥、化妝品和食品等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。由于本發(fā)明方法中米取了向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的(NH4)2SO4來(lái)提高培養(yǎng)環(huán)境的滲透壓，脅迫培養(yǎng)纖維化纖維微細(xì)菌使得菌株細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激產(chǎn)生較多的海藻糖合成酶系，同時(shí)細(xì)胞膜失去了原有的選擇透過(guò)性，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的海藻糖可以自由擴(kuò)散到細(xì)胞外發(fā)酵液中。經(jīng)測(cè)定，同樣發(fā)酵條件下，沒有添加(NH4)2SO4的纖維化纖維微細(xì)菌發(fā)酵液中沒有海藻糖生成，而添加適量(NH4)2SO4的纖維化纖維微細(xì)菌發(fā)酵液中海藻糖發(fā)酵單位可達(dá)34g/L。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。本發(fā)明實(shí)施例中所用于配制培養(yǎng)基的成分的原料葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、玉米漿、MgS04、KH2PO4和CaCO3以及(NH4) 2S04均為市售產(chǎn)品。本發(fā)明使用的纖維化纖維微細(xì)菌菌株是從合肥地區(qū)榆樹枯木枝上自主分離得到的，命名為纖維化纖維微細(xì)菌(Cellulosimicrobium cellulans) S32,菌種保藏號(hào)為CGMCCNo. 5841，保藏日期為2012年3月2日，保藏機(jī)構(gòu)為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。實(shí)施例I :本實(shí)施例利用纖維化纖維微細(xì)菌進(jìn)行滲透發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖的方法，包括纖維化纖維微細(xì)菌培養(yǎng)、滲透發(fā)酵與海藻糖的合成和海藻糖的提取分離。具體操作步驟如下(I)纖維化纖維微細(xì)菌培養(yǎng)取菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 5841的纖維化纖維微細(xì)、菌(Cellulosimicrobium cellulans) S32菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)，按培養(yǎng)基體積的5%接種量轉(zhuǎn)入置有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，裝液量3. 5L，培養(yǎng)溫度30°C，空氣流量4L/min，轉(zhuǎn)速300r/min，培養(yǎng)時(shí)間 30h。上述發(fā)酵培養(yǎng)基組分按每升培養(yǎng)基中所含的質(zhì)量克數(shù)為葡萄糖20、酵母粉5、蛋白胨 5、玉米漿 10、MgS04 UKH2PO4 I 和 CaCO3 7 (g/L)。(2)滲透發(fā)酵向培養(yǎng)30h后的培養(yǎng)液中添加28§(見14)2504和21(^葡萄糖，再培養(yǎng)7h。添加銨鹽(NH4)2SO4可以提高生產(chǎn)菌株培養(yǎng)環(huán)境的滲透壓，誘導(dǎo)其細(xì)胞應(yīng)激產(chǎn)生較多的海藻糖合成酶系，并成為透性化細(xì)胞；同時(shí)葡萄糖進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)化為海藻糖，海藻糖可以自由擴(kuò)散到細(xì)胞外發(fā)酵液中。(3)海藻糖的分離與純化將發(fā)酵液離心或過(guò)濾除去菌株細(xì)胞，得到海藻糖含量 為34g/L的溶液。采用截留相對(duì)分子量為10000的超濾膜脫除大分子物質(zhì)，用陰陽(yáng)離子交換樹脂脫鹽、分離海藻糖和葡萄糖。將收集的海藻糖組分加熱蒸發(fā)濃縮，再噴霧干燥，得到海藻糖粉末102g。實(shí)施例2:(I)纖維化纖維微細(xì)菌培養(yǎng)取纖維化纖維微細(xì)菌保藏菌種活化培養(yǎng)，按培養(yǎng)基體積的5%接種量轉(zhuǎn)入置有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，裝液量3. 5L，培養(yǎng)溫度30°C，空氣流量4L/min，轉(zhuǎn)速300r/min，培養(yǎng)時(shí)間30h。所述發(fā)酵培養(yǎng)基與實(shí)施例I中相同，組分按每升培養(yǎng)基中所含的質(zhì)量克數(shù)為葡萄糖20、酵母粉5、蛋白胨5、玉米漿10、MgS04 UKH2PO4 I和CaCO3 7 (g/L)。(2)滲透發(fā)酵向培養(yǎng)30h后的培養(yǎng)液中添加17. 5§(見14)2504和21(^葡萄糖，再培養(yǎng)7h。(3)海藻糖的分離與純化將發(fā)酵液離心或過(guò)濾除去菌株細(xì)胞，得到海藻糖含量為32g/L的溶液。采用截留相對(duì)分子量為10000的超濾膜脫除大分子物質(zhì)，用陰陽(yáng)離子交換樹脂脫鹽、分離海藻糖和葡萄糖。將收集的海藻糖組分加熱蒸發(fā)濃縮將收集的海藻糖組分加熱蒸發(fā)濃縮，再噴霧干燥，得到海藻糖粉末96g。實(shí)施例3 (I)纖維化纖維微細(xì)菌培養(yǎng)取纖維化纖維微細(xì)菌保藏菌種活化培養(yǎng)，按培養(yǎng)基體積的5%接種量轉(zhuǎn)入置有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，裝液量3. 5L，培養(yǎng)溫度30°C，空氣流量4L/min，轉(zhuǎn)速300r/min，培養(yǎng)時(shí)間30h。所述發(fā)酵培養(yǎng)基與實(shí)施例I中相同，組分按每升培養(yǎng)基中所含的質(zhì)量克數(shù)為葡萄糖20、酵母粉5、蛋白胨5、玉米漿10、MgS04 UKH2PO4 I和 CaCO3 7 (g/L)。(2)滲透發(fā)酵向培養(yǎng)30h后的培養(yǎng)液中添加35§(見14)2504和21(^葡萄糖，再培養(yǎng)7h0(3)海藻糖的分離與純化將發(fā)酵液離心或過(guò)濾除菌株細(xì)胞，得到海藻糖含量為31g/L的溶液。采用截留相對(duì)分子量為10000的超濾膜脫除大分子物質(zhì)，用陰陽(yáng)離子交換樹脂脫鹽、分離海藻糖和葡萄糖。將收集的海藻糖組分加熱蒸發(fā)濃縮，再噴霧干燥，得到海藻糖粉末93g。本發(fā)明方法由于以葡萄糖為底物，利用纖維化纖維微細(xì)菌菌株培養(yǎng)后，纖維化纖維微細(xì)菌以葡萄糖為基質(zhì)滲透發(fā)酵，從而可以大量合成胞外海藻糖。采用本發(fā)明方法生產(chǎn)海藻糖，生產(chǎn)工藝集約、設(shè)備投資少、且無(wú)糖類副產(chǎn)物、產(chǎn)品易于分離，其突出特點(diǎn)是海藻糖轉(zhuǎn)化率高達(dá)60%，使生產(chǎn)成本降低，從而為海藻糖的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。采用本發(fā)明方法所制備的海藻糖由于其對(duì)生物大分子良好的非特異性保護(hù)作用而在醫(yī)藥、化妝品和食品等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。
由于本發(fā)明方法中采取了向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的(NH4)2SO4來(lái)提高培養(yǎng)環(huán)境的滲透壓，脅迫培養(yǎng)纖維化纖維微細(xì)菌使得菌株細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激產(chǎn)生較多的海藻糖合成酶系，同時(shí)細(xì)胞膜失去了原有的選擇透過(guò)性，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的海藻糖可以自由擴(kuò)散到細(xì)胞外發(fā)酵液中。經(jīng)測(cè)定，同樣發(fā)酵條件下，沒有添加(NH4)2SO4的纖維化纖維微細(xì)菌發(fā)酵液中沒有海藻糖生成，而添加適量(NH4)2SO4的纖維化纖維微細(xì)菌發(fā)酵液中海藻糖發(fā)酵單位可達(dá)34g/L。
權(quán)利要求
1.一種纖維化纖維微細(xì)菌菌株，是從合肥地區(qū)榆樹枯木枝上分離得到的，命名為纖維化纖維微細(xì)菌(Cellulosimicrobium cellulans) S32,菌種保藏號(hào)為 CGMCC No. 5841。
2.一種利用纖維化纖維微細(xì)菌滲透發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖的方法，其特征在于先將菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 5841的纖維化纖維微細(xì)菌(Cellulosimicrobium cellulans) S32菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)，按培養(yǎng)基體積的5%接種量轉(zhuǎn)入置有組分按每升培養(yǎng)基中所含的質(zhì)量克數(shù)為葡萄糖20、酵母粉5、蛋白胨5、玉米漿10、MgSO4 UKH2PO4 I和CaCO3 7的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，裝液量為發(fā)酵罐容積的70%，培養(yǎng)溫度為30°C，空氣流量4L/min，轉(zhuǎn)速300r/min ；培養(yǎng)30h后，向培養(yǎng)液中添加至終濃度為5-10g/L的(NH4)2SO4和60g/L的葡萄糖，再培養(yǎng)7h ;然后將發(fā)酵液離心或過(guò)濾除去菌株細(xì)胞，得到含海藻糖的溶液；采用截留相對(duì)分子量為10000的超濾膜脫除大分子物質(zhì)，用陰陽(yáng)離子交換樹脂脫鹽、分離海藻糖和葡萄糖；將收集的海藻糖組分加熱蒸發(fā)濃縮，再噴霧干燥，即得到海藻糖成品。
3.如權(quán)利要求2所述利用纖維化纖維微細(xì)菌滲透發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖的方法，特征在于在所述生產(chǎn)菌株培養(yǎng)30h后，向培養(yǎng)液中添加(NH4)2SO4至終濃度為8g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種纖維化纖維微細(xì)菌及利用纖維化纖維微細(xì)菌滲透發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖的方法，該新菌株命名為纖維化纖維微細(xì)菌(Cellulosimicrobium cellulans)S32，菌種保藏號(hào)為CGMCC No.5841；本發(fā)明方法以葡萄糖為底物，將纖維化纖維微細(xì)菌菌株培養(yǎng)后進(jìn)行滲透發(fā)酵，纖維化纖維微細(xì)菌細(xì)胞應(yīng)激產(chǎn)生較多的海藻糖合成酶系并成為透性化細(xì)胞，胞內(nèi)海藻糖合成酶系大量合成胞外海藻糖。從葡萄糖到海藻糖轉(zhuǎn)化率高達(dá)60％，且無(wú)糖類副產(chǎn)物、產(chǎn)品易于分離，生產(chǎn)工藝集約、設(shè)備投資較少、生產(chǎn)成本較低。所制備的海藻糖由于其對(duì)生物大分子良好的非特異性保護(hù)作用而在醫(yī)藥、化妝品和食品等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P19/12GK102634470SQ20121010336
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月10日
發(fā)明者宋建民 申請(qǐng)人:宋建民