專利名稱：基于ant1基因的靶向型免疫脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種靶向型免疫脂質(zhì)體，還涉及該免疫脂質(zhì)體的制備方法和在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架植入術(shù)(PCI)及經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈形成術(shù)(PTCA)后，最主要的并發(fā)癥是術(shù)后6個(gè)月內(nèi)30%_50%發(fā)生再狹窄,表現(xiàn)為血管平滑肌細(xì)胞(vascular smoothmuscle cells, VSMC)密度增加和新生內(nèi)膜增厚，VSMC凋亡不足是再狹窄發(fā)生的機(jī)制之一。研究表明，增加VSMC的凋亡可以防治再狹窄。因此，針對(duì)VSMC凋亡方面的研究成為治療再狹窄的熱點(diǎn)領(lǐng)域。腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶(adenine nucleotide translocase, ANT)是位于線粒體內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與由線粒體經(jīng)內(nèi)膜到胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)氧化磷酸化過程中的ATP和ADP，與細(xì)胞內(nèi)的能量代謝密切相關(guān)。此外，ANT還參與線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換(mitochondrialpermeability transition, MPT),從而與細(xì)胞凋亡關(guān)系緊密,但其作用與能量轉(zhuǎn)運(yùn)無關(guān)。ANT有4種異構(gòu)體，其中ANTl誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用最強(qiáng)，但其是否能誘導(dǎo)VSMC凋亡國內(nèi)外尚未見報(bào)道。細(xì)胞骨架是VSMC保持特定細(xì)胞形態(tài)和行使收縮功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。平滑肌SM22 a (smooth muscle 22 alpha)蛋白又稱轉(zhuǎn)凝蛋白(transgelin),是一種重要的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，在分化型VSMC中大量表達(dá)，可通過與肌動(dòng)蛋白(actin)相互作用參與細(xì)胞骨架重構(gòu)和表型調(diào)節(jié)。此外，SM22a還可作為信號(hào)分子參與VSMC的生長和細(xì)胞外基質(zhì)的降解。因此，SM22a在VSMC表型轉(zhuǎn)化和血管重塑性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。脂質(zhì)體是由一層或多層同心的脂質(zhì)雙分子膜包封而成的球狀體，可以包裹多種物質(zhì)(如藥物、核酸等)并將其轉(zhuǎn)入多種類型的細(xì)胞中，具有延長包裹物的作用時(shí)間、增加細(xì)胞對(duì)包裹物的攝取量、提高療效、減少毒副作用等特點(diǎn)，但其缺乏主動(dòng)靶向性。免疫脂質(zhì)體是一種表面結(jié)合有抗體或抗體片段等物質(zhì)的脂質(zhì)體，其借助抗體或抗體片段與靶細(xì)胞表面抗原的特異性結(jié)合，可以特異性識(shí)別并結(jié)合靶細(xì)胞，使脂質(zhì)體在靶區(qū)釋放包裹物，從而實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向功能。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體，可以主動(dòng)靶向VSMC，在細(xì)胞中表達(dá)ANT1，誘導(dǎo)VSMC凋亡并抑制其增殖，從而發(fā)揮抗血管狹窄的作用；目的之二在于提供所述基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體的制備方法，操作簡便易行；目的之三在于提供所述基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
I、基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體，在內(nèi)部包封有ANTl重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體表面結(jié)合有抗SM22 a單克隆抗體，所述ANTl重組真核表達(dá)載體中含有核苷酸序列如SEQID No. I所示的ANTl基因。進(jìn)一步，所述ANTl重組真核表達(dá)載體是將ANTl基因插入真核表達(dá)載體p3xFLAG_CMV-14的多克隆位點(diǎn)中而得到。進(jìn)一步，所述脂質(zhì)體是以質(zhì)量比為5:1的卵磷脂和膽固醇為原料制得。2、所述基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟
a、ANTl重組真核表達(dá)載體的制備將核苷酸序列如SEQID No. I所示的ANTl基因插入真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14的多克隆位點(diǎn)中，制得ANTl重組真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14/ANT1 ；
b、ANTl重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體包封將卵磷脂和膽固醇溶解于乙醚中，減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，水浴超聲，再加入p3xFLAG-CMV-14/ANTl溶液，在干冰和42°C水浴中反復(fù)凍融并通過孔徑為IOOnm的薄膜擠出器,用核酸酶Dnase I和exonuclease III降解未包封入脂質(zhì)體的p3xFLAG-CMV-14/ANTl，再用瓊脂糖凝膠柱分離除去被核酸酶降解的p3xFLAG-CMV-14/ANT1,即制得包封有 p3xFLAG-CMV-14/ANTl 的脂質(zhì)體；
C、包封有ANTl重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體與抗SM22a單克隆抗體的連接將抗SM22 a單克隆抗體經(jīng)巰基化修飾后，與包封有p3xFLAG-CMV-14/ANTl的脂質(zhì)體在室溫下振搖連接過夜，再用瓊脂糖凝膠柱分離除去未連接的抗SM22 a單克隆抗體，即得基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體。 進(jìn)一步，所述步驟a是將大鼠VSMC總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以該cDNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示的上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用NotI和XbaI雙酶切，再與同樣經(jīng)NotI和XbaI雙酶切的真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14在T4 DNA連接酶的作用下連接，即制得ANTl重組真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14/ANTl。進(jìn)一步，所述步驟a中PCR擴(kuò)增的條件為95°C預(yù)變性10分鐘，然后94°C變性I分鐘、58 °C退火I分鐘、72 °C延伸4分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。進(jìn)一步，所述步驟b是將質(zhì)量比為5:1的卵磷脂和膽固醇溶解于乙醚中，減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，水浴超聲5分鐘，再加入濃度為0. 5mg/mL的p3xFLAG-CMV-14/ANTl溶液，p3xFLAG-CMV-14/ANTl與膽固醇的質(zhì)量比為1:40，在干冰和42°C水浴中反復(fù)凍融并通過孔徑為IOOnm的薄膜擠出器。3、所述基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體在制備抗血管狹窄藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述抗血管狹窄藥物為能夠誘導(dǎo)VSMC凋亡并抑制其增殖的藥物。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明將ANTl重組真核表達(dá)載體有效地包封在脂質(zhì)體中形成納米級(jí)顆粒，再與抗SM22 a單克隆抗體連接，借助抗SM22 a單克隆抗體與VSMC表面的SM22 a抗原的特異性結(jié)合，使脂質(zhì)體主動(dòng)靶向VSMC，進(jìn)而在VSMC中釋放ANTl重組真核表達(dá)載體并表達(dá)ANTl，誘導(dǎo)VSMC凋亡并抑制其增殖，來發(fā)揮抗血管 狹窄的作用，具有高效、低毒、制備方法簡單等優(yōu)點(diǎn)，可用于制備抗血管狹窄的藥物，在冠狀動(dòng)脈粥樣性硬化等疾病的防治方面具有良好的應(yīng)用前景。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖I為瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)ANTl基因的PCR產(chǎn)物，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I泳道為PCR產(chǎn)物。圖2為Western blot檢測(cè)ANTl重組真核表達(dá)載體，其中I泳道為從p3xFLAG_CMV-14/ANT1轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞中提取并純化的蛋白溶液，2泳道為從p3xFLAG-CMV_14轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞中提取并純化的蛋白溶液。圖3為透射電子顯微鏡觀察包封有ANTl重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體。圖4為脂質(zhì)體核酸酶降解電泳圖，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I泳道為未包封質(zhì)粒，2泳道為脂質(zhì)體包封質(zhì)粒。
圖5為Anti_SM22 a -Lip-ANTl的電泳檢測(cè)圖，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I泳道為Anti-SM22 a -Lip-ANTl溶液，2泳道為抗SM22 a單克隆抗體。圖6 為 Anti_SM22 a -Lip-ANTl 的 ELISA 檢測(cè)圖。圖7為各組細(xì)胞的凋亡率。圖8為各組細(xì)胞的增殖抑制率。
具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J-薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體(Anti_SM22 a -Lip-ANTl)的制備 UANTl重組真核表達(dá)載體的制備與檢測(cè)
(I)ANTl重組真核表達(dá)載體的制備
取SD大鼠VSMC，加入液氮充分研磨后，稱取IOOmg置無RNA酶的離心管中，用RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)提取VSMC總RNA，按照試劑盒說明書操作。根據(jù)GenBank登錄號(hào)為NM_007450. 4的ANTl基因序列設(shè)計(jì)I對(duì)特異性引物，在每條引物的5’端加上保護(hù)堿基并在其后引入限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。引物序列如下上游引物5’ -RCRRCCRcaaaatatRtRtaa-3’ (SEQ ID No. 2,下劃線部分為 NotI 酶切位點(diǎn));下游引物5’ -tctagagtaccccctagtccg-3J (SEQ ID No. 3,下劃線部分為 XbaI 酶切位點(diǎn));設(shè)計(jì)的引物委托上海生工公司進(jìn)行合成。采用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa公司)將上述VSMC總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以該cDNA為模板，采用上述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照試劑盒說明書操作；PCR擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性10分鐘，然后94°C變性I分鐘、58°C退火I分鐘、72°C延伸4分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物用濃度為10g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖I所示，可見PCR產(chǎn)物在約950bp處有一特異性條帶，與目的片段的分子量大小相符；用膠回收試劑盒(TIANGEN公司)切膠回收純化目的片段，按照試劑盒說明書操作，獲得兩端帶有NotI和XbaI酶切位點(diǎn)的ANTl基因。將兩端帶有NotI和XbaI酶切位點(diǎn)的ANTl基因用NotI和XbaI (TaKaRa公司)雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，與同樣經(jīng)NotI和XbaI雙酶切的真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14(Sigma-Aldrich公司)在T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)的作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (TIANGEN公司)感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素(AMP)的LB平板篩選陽性克隆，挑取陽性克隆單菌落，接種于含有AMP的LB液體培養(yǎng)基中，溫度37°C振搖培養(yǎng)12小時(shí)，用質(zhì)粒小量提取試劑盒(TIANGEN公司)提取質(zhì)粒，按照試劑盒說明書操作，所得質(zhì)粒采用雙酶切法和PCR法鑒定并委托上海生工公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，在p3xFLAG-CMV-14的NotI和XbaI位點(diǎn)之間插入有與SEQ ID No. I所示核苷酸序列完全一致的DNA片段的陽性克隆質(zhì)粒即為ANTl重組真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14/ANTl。取含有p3xFLAG-CMV_14/ANTl的大腸桿菌DH5 a (陽性克隆)，接種于含有AMP的LB液體培養(yǎng)基中，溫度37°C振搖培養(yǎng)過夜，待培養(yǎng)液的光吸收值OD49tlnm達(dá)到f I. 5時(shí)，采用超純質(zhì)粒抽提試劑盒(TIANGEN公司)大量抽提質(zhì)粒，按照試劑盒說明書操作，所得質(zhì)粒用超純水溶解，即得p3xFLAG-CMV-14/ANTl溶液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其A260值和A280值，根據(jù)A260/A280值估算其純度為I. 90，根據(jù)A260值計(jì)算其質(zhì)量濃度為I. Omg/mL。(2) Western blot檢測(cè)ANTl重組真核表達(dá)載體
將C0S-7細(xì)胞接種于6孔板中，用PRM 1640培養(yǎng)基在溫度為37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞融合率達(dá)到約80%時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000將p3xFLAG-CMV_14/ANTl轉(zhuǎn)染入C0S-7細(xì)胞，按照試劑說明書操作，同時(shí)設(shè)空載體對(duì)照，轉(zhuǎn)染4小時(shí)后，將培養(yǎng)液更換為PRIM 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞，用PBS洗滌并重懸，超聲裂解細(xì)胞，離心收集上清液，采用His Bind融合蛋白純化試劑盒純化帶有His標(biāo)簽的ANTl，按照試劑盒說明書操作。取純化的蛋白溶液，采用質(zhì)量百分濃度為5%的濃縮膠、質(zhì)量百分濃度為12. 5%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完畢后電轉(zhuǎn)印PVDF膜，用脫脂奶封閉I小時(shí)后，加入兔抗大鼠ANTl多克隆抗體，37°C孵育I小時(shí)，PBST洗膜，再加入羊抗兔IgG，37°C孵育I小時(shí)，PBST洗膜，再加入發(fā)光底物，37°C孵育I分鐘，暗室中用X光片曝光，顯影，定影，觀察p3xFLAG-CMV-14/ANTl在真核細(xì)胞中的表達(dá)，以P-actin為內(nèi)參照。結(jié)果如圖2所示，從p3xFLAG-CMV-14/ANTl轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞中提取并純化的蛋白溶液有一特異的蛋白質(zhì)條帶，與ANTl的預(yù)期分子量大小一致，而從p3xFLAG-CMV-14轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞中提取并純化的蛋白溶液無相應(yīng)條帶，表明p3xFLAG-CMV-14/ANTl可以在真核細(xì)胞中正確表達(dá)ANTl。2、包封有ANTl重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體(Lip-ANTl)的制備與檢測(cè)
(I)逆向蒸發(fā)法制備Lip-ANTl
將卵磷脂2g和膽固醇0. 4g溶解于乙醚60mL中，減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，水浴超聲5分鐘，再加入濃度為0. 5mg/mL的p3xFLAG_CMV_14/ANTl溶液20mL，在干冰和42°C水浴中反復(fù)凍融，并連續(xù)數(shù)次通過孔徑為IOOnm的薄膜擠出器(上海光健公司)，然后加入核酸酶Dnase I和exonuclease III (上海亞培公司),37°C作用I小時(shí)降解未包封入脂質(zhì)體的p3xFLAG-CMV-14/ANTl，用乙二胺四乙酸終止反應(yīng)，再用瓊脂糖凝膠CL-4B柱(北方偉業(yè)公司)分離Lip-ANTl和被核酸酶降解的p3xFLAG-CMV-14/ANTl，由于脂質(zhì)體的體積比質(zhì)粒DNA大，通過凝膠過濾色譜可以將二者很好的分離。(2) Lip-ANTl 的檢測(cè)
透射電鏡觀察將制得的Lip-ANTl溶液用濃度為3g/L的磷鎢酸溶液負(fù)染后，滴至專用 銅網(wǎng)上，自然風(fēng)干，置透射電子顯微鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和粒徑分布。結(jié)果如圖3所示，可見所得Lip-ANTl為球形或近球形小囊泡,粒徑分布范圍為5(Tl20nm,平均粒徑低于IOOnm0瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)取與制備方法中等量的p3xFLAG-CMV_14/ANTl溶液、通過IOOnm薄膜擠出器的脂質(zhì)體溶液、用瓊脂糖凝膠柱CL-4B分離所得的Lip-ANTl溶液和被核酸酶降解的p3xFLAG-CMV-14/ANTl溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，再置紫外燈下觀察。結(jié)果如圖4所示，經(jīng)核酸酶Dnase I和exonuclease III處理后，未包封入脂質(zhì)體的p3xFLAG-CMV-14/ANTl已經(jīng)被降解，而脂質(zhì)體能夠抵抗核酸酶的降解。同時(shí)通過Gelpro analyzer 4. 0軟件比較凝膠圖中DNA的條帶亮度,計(jì)算總DNA量和未包封入脂質(zhì)體的DNA量，再根據(jù)以下公式包封率(%) =[(總DNA量一未包封入脂質(zhì)體的DNA量)/總DNA量]X 100%,計(jì)算得到 p3xFLAG- CMV-14/ANT1 的包封率為 82. 3%。3、Anti_SM22 a -Lip-ANTl 的制備與檢測(cè) (I) Anti-SM22 a -Lip-ANTl 的制備
將羊抗大鼠SM22 a單克隆抗體(SantaCruz公司)經(jīng)巰基化修飾后，與Lip-ANTl在室溫下輕搖連接過夜，再用瓊脂糖凝膠柱CL-4B分離連接成功的Anti-SM22 a -Lip-ANTl和未連接的抗SM22a單克隆抗體，由于免疫脂質(zhì)體的體積比抗體大，通過凝膠過濾色譜可以將二者很好的分離。(2) Anti-SM22 a -Lip-ANTl 的檢測(cè)
瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)向瓊脂糖凝膠柱CL-4B分離所得的Anti-SM22 a -Lip-ANTl溶液和未連接的抗SM22 a單克隆抗體溶液中，分別加入濃度為5g/L的SDS溶液(SDS能破壞脂質(zhì)體的膜表面結(jié)構(gòu)，從而使脂質(zhì)體釋放內(nèi)部的包裹物)，同時(shí)設(shè)置不加入SDS的空白對(duì)照，混勻靜置，取上清液進(jìn)行濃度為5g/L的瓊脂糖凝膠電泳，置紫外燈下觀察，結(jié)果如圖5所示，加入SDS的Anti-SM22 a -Lip-ANTl溶液有一明亮的DNA條帶，而加入SDS的抗SM22 a單克隆抗體無相應(yīng)條帶出現(xiàn)。說明所得Anti-SM22 a -Lip-ANTl中包封有ANTl重組真核表達(dá)載體。ELISA檢測(cè)用瓊脂糖凝膠柱CL-4B分離所得的Anti_SM22 a -Lip-ANTl溶液和未連接的抗SM22 a單克隆抗體溶液分別包被96孔板，以HRP標(biāo)記的羊抗大鼠IgG為一抗，進(jìn)行直接ELISA實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖6所示，所得Anti-SM22 a -Lip-ANTl和未連接的抗SM22 a單克隆抗體都呈陽性反應(yīng)，說明Anti_SM22 a -Lip-ANTl中含有抗SM22 a單克隆抗體，即脂質(zhì)體的表面已成功連接上抗SM22 a單克隆抗體。二、基于ANTl基因的免疫脂質(zhì)體對(duì)VSMC的作用檢測(cè) I、流式細(xì)胞儀檢測(cè)Anti-SM22 a -Lip-ANTl誘導(dǎo)VSMC凋亡
將處于指數(shù)生長期的C0S-7細(xì)胞和VSMC分別用含有濃度為100g/L的新生牛血清的完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞密度為I X IOVmL的懸液，接種至96孔板，每孔100 u L，分成兩組對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組每孔加入完全培養(yǎng)液100 U L，實(shí)驗(yàn)組每孔加入終濃度為I y g/mL的Anti-SM22 a -Lip-ANTl 100 u L，然后在溫度為37°C、C02氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)72小時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞，加入500 ii L Binding Buffer懸浮細(xì)胞，再加入5 ii L Annexin V-FITC混勻，再加入5 y L Propidium Iodide混勻，室溫下避光反應(yīng)5 15分鐘，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果如圖7所示，經(jīng)Anti-SM22 a -Lip-ANTl處理的C0S-7細(xì)胞的凋亡率為3. 7±0. 5%,而經(jīng)Anti-SM22 a -Lip-ANTl處理的VSMC的凋亡率為24. 3±4. 1%，說明本發(fā)明的免疫脂質(zhì)體能夠特異性誘導(dǎo)VSMC的凋亡。2、MTT 比色法檢測(cè) Anti_SM22 a -Lip-ANTl 抗 VSMC 增殖作用
將處于指數(shù)生長期的C0S-7細(xì)胞和VSMC分別用含有濃度為100g/L的新生牛血清的完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞密度為I X IOVmL的懸液，接種至96孔板，每孔100 u L，分成兩組對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組每孔加入完全培養(yǎng)液100 U L，實(shí)驗(yàn)組每孔加入終濃度為I U g/mL的Anti-SM22 a -Lip-ANTl 100 u L，然后在溫度為37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)72小時(shí)，每孔再加入濃度為5g/L的MTT 20 u L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，吸棄上清，每孔再加入二甲基亞砜150 u L，輕搖10分鐘，用酶標(biāo)儀在波長490nm處測(cè)定各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果如圖8所示，經(jīng)Anti-SM22 a -Lip-ANTl處理的C0S-7細(xì)胞的增殖抑制率為2. 5±0. 8%，而經(jīng)Anti-SM22 a -Lip-ANTl處理的VSMC的增殖抑制率為27. 3±4. 2%，說明本發(fā)明的免疫脂質(zhì)體能夠特異性抑制VSMC的增殖。
最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體，其特征在于，在內(nèi)部包封有ANTl重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體表面結(jié)合有抗SM22a單克隆抗體，所述ANTl重組真核表達(dá)載體中含有核苷酸序列如SEQ ID No. I所示的ANTl基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體，其特征在于，所述ANTl重組真核表達(dá)載體是將ANTl基因插入真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14的多克隆位點(diǎn)中而得至IJ。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體是以質(zhì)量比為5:1的卵磷脂和膽固醇為原料制得。
4.權(quán)利要求I所述的基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包 括以下步驟 a.ANTl重組真核表達(dá)載體的制備將核苷酸序列如SEQ ID No. I所示的ANTl基因插入真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14的多克隆位點(diǎn)中，制得ANTl重組真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14/ANTl ； b.ANTl重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體包封將卵磷脂和膽固醇溶解于こ醚中，減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，水浴超聲，再加入p3xFLAG-CMV-14/ANTl溶液，在干冰和42°C水浴中反復(fù)凍融并通過孔徑為IOOnm的薄膜擠出器,用核酸酶Dnase I和exonuclease III降解未包封入脂質(zhì)體的p3xFLAG-CMV-14/ANTl，再用瓊脂糖凝膠柱分離除去被核酸酶降解的p3xFLAG-CMV-14/ANT1,即制得包封有 p3xFLAG-CMV-14/ANTl 的脂質(zhì)體； c.包封有ANTl重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體與抗SM22α單克隆抗體的連接將抗SM22 α單克隆抗體經(jīng)巰基化修飾后，與包封有p3xFLAG-CMV-14/ANTl的脂質(zhì)體在室溫下振搖連接過夜，再用瓊脂糖凝膠柱分離除去未連接的抗SM22 α單克隆抗體，即得基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，所述步驟a是將大鼠VSMC總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以該cDNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示的上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用NotI和XbaI雙酶切，再與同樣經(jīng)NotI和XbaI雙酶切的真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14在T4 DNA連接酶的作用下連接，即制得ANTl重組真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14/ANTl。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，所述步驟a中PCR擴(kuò)增的條件為95°C預(yù)變性10分鐘，然后94°C變性I分鐘、58°C退火I分鐘、72°C延伸4分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，所述步驟b是將質(zhì)量比為5:1的卵磷脂和膽固醇溶解于こ醚中，減壓蒸餾除去有機(jī)溶剤，水浴超聲5分鐘，再加入濃度為O. 5mg/mL的p3xFLAG-CMV-14/ANTl溶液，p3xFLAG-CMV-14/ANTl與膽固醇的質(zhì)量比為1:40，在干冰和42°C水浴中反復(fù)凍融并通過孔徑為IOOnm的薄膜擠出器。
8.權(quán)利要求I至3任一項(xiàng)所述的基于ANTl基因的靶向型免疫脂質(zhì)體在制備抗血管狹窄藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗血管狹窄藥物為能夠誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡并抑制其増殖的藥物
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于ANT1基因的靶向型免疫脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用，該免疫脂質(zhì)體是在內(nèi)部包封有ANT1重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體表面結(jié)合有抗SM22α單克隆抗體，ANT1重組真核表達(dá)載體中含有核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的ANT1基因；本發(fā)明將ANT1重組真核表達(dá)載體有效地包封在脂質(zhì)體中形成納米級(jí)顆粒，再與抗SM22α單克隆抗體連接，借助抗SM22α單克隆抗體與VSMC表面的SM22α抗原的特異性結(jié)合，使脂質(zhì)體主動(dòng)靶向VSMC，進(jìn)而在VSMC中釋放ANT1重組真核表達(dá)載體并表達(dá)ANT1，誘導(dǎo)VSMC凋亡并抑制其增殖，來發(fā)揮抗血管狹窄的作用，具有高效、低毒、制備方法簡單等優(yōu)點(diǎn)，可用于制備抗血管狹窄的藥物，在冠狀動(dòng)脈粥樣性硬化等疾病的防治方面具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/79GK102657875SQ20121010441
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月11日
發(fā)明者宋耀明, 耿召華, 黃嵐 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院