專利名稱：微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種低溫溶菌酶微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。該發(fā)明生產(chǎn)的低溫溶菌酶因具有抗菌，抗病毒，增強(qiáng)免疫力的生物價(jià)值而廣泛應(yīng)用于飼料防腐、低溫肉制品保鮮、醫(yī)藥領(lǐng)域(特別是治療五官科的炎癥，防止人體因外傷引起的感染)、以及其它溶菌酶應(yīng)用行業(yè)。該發(fā)明生產(chǎn)的低溫溶菌酶，在低溫下仍有較高酶活，其應(yīng)用前景廣闊。
背景技術(shù)：
溶菌酶(lysozyme，EC 3. 2. I. 17)又稱細(xì)胞壁溶解酶，是一種專門(mén)作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶。具有對(duì)人體無(wú)毒、無(wú)副作用等特點(diǎn)。溶菌酶作為生物酶制劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于飼料防腐、低溫肉制品保鮮和醫(yī)藥領(lǐng)域等行業(yè)中，商品溶菌酶多由卵清中提取，但從卵清中提取的溶菌酶只對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制效果，對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制效果一般，限制了其使用(丁亦男，長(zhǎng)春師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2009)。故通過(guò)微生物生產(chǎn)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性都有抑制作用的溶菌酶，會(huì)產(chǎn)生良好的應(yīng)用前景。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)的溶菌酶的研究很多，但主要是研究中溫溶菌酶，有關(guān)微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫溶菌酶的研究處于初級(jí)階段，主要是菌種選育和產(chǎn)酶條件優(yōu)化、生長(zhǎng)特性、酶學(xué)性質(zhì)、抑菌實(shí)驗(yàn)、以及低溫溶菌酶毒性實(shí)驗(yàn)(郭沈波，青島大醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003 ;王美芝，中國(guó)海洋藥物，2004 ;王躍軍，海洋水產(chǎn)研究，2000 ;張銹，化學(xué)工程，2007);微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫溶菌酶產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化生產(chǎn)及應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫溶菌酶與高溫、中溫溶菌酶相比具有很大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榈蜏孛冈诘蜏叵戮哂懈呙富盍案叽呋?，可大大縮短處理過(guò)程的時(shí)間并省卻昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用；在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)；經(jīng)過(guò)溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理不會(huì)影響產(chǎn)品的品質(zhì)(孫謐等，海洋水產(chǎn)研究，2002)，這將有助于微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫溶菌酶的推廣和使用。微生物代謝產(chǎn)物中分離的低溫溶菌酶具有抗氧化、溶菌譜廣的特點(diǎn)，對(duì)致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、多殺性沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿等都有較好的抑制作用(王美芝，中國(guó)海洋藥物，2004 ;李義等，西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012)，能特異性地分解革蘭陰性、陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁(張世英，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004)。因此通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶，在低溫條件下可以保持較高的酶活，與中溫溶菌酶相比具有更強(qiáng)殺菌、防腐、抗病毒等功效，增強(qiáng)了溶菌酶在醫(yī)藥，食品保鮮等領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值(馮學(xué)珍，食品工業(yè)科技，2008)。可以從根本上擺脫中溫、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和工藝，降低投入成本。微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶具有廣闊的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶的方法，該方法主要是微生 物經(jīng)過(guò)低溫馴化后，在10 16°C液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶的方法，這種生產(chǎn)方法獲得的低溫溶菌酶粗酶液活性可以達(dá)到154U/mg，如再經(jīng)過(guò)分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。當(dāng)該酶活性為2200U/mg，其最小抑菌濃度可達(dá)0. 011% -0. 088% (g/ml)，即
0.011%-0. 088% (g/ml)的溶菌酶可在10 16°C下能夠完全抑制106CFU/ml的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌等多種菌株的生長(zhǎng)。該酶制劑應(yīng)用操作簡(jiǎn)單、方便、快捷、成本低?？梢詮母旧媳苊庵袦?、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和工藝。本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶的方法具體包括以下步驟(I)將產(chǎn)生溶菌酶的微生物逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；(2)按常規(guī)方法將低溫馴化后的溶菌酶產(chǎn)生菌在10 16°C逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(3)將液體一級(jí)種子或二級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的3 9%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10 16°C培養(yǎng)72 144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶結(jié)束； (4)將(3)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(5)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(4)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。本發(fā)明中使用的菌種來(lái)源于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長(zhǎng)條件按菌種保藏單位提供的說(shuō)明進(jìn)行。溶菌酶產(chǎn)生菌(CGMCC編號(hào)4. 1145或4. 1076)，菌株先活化、定向馴化后，按本發(fā)明產(chǎn)酶條件發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶，產(chǎn)酶低溫馴化后的菌株在4°C環(huán)境中可保存2個(gè)月，用10 25%甘油制成的菌懸液、在零下80°C條件下可以長(zhǎng)期保藏。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一(I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨15.0g，牛肉膏10. 0g,NaCl 5. 0g，，瓊脂15. 0g，蒸餾水
1.0L, pH 值 7. 2 7. 4，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基蛋白胨5.0 15. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 3. 0
7.Og,瓊脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖7. 0 13. Og,蛋白胨3. 0 8. 0g, MgS043. 0 8. Og,CaCl2 1.0 3.0g，自來(lái)水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌30111111。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基蛋白胨12. 0 17. 0g，牛肉膏7. 0 13. 0g，NaCl 3.0 7. 0g，自來(lái)水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產(chǎn)生溶菌酶的菌種，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說(shuō)明進(jìn)行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的溶菌酶產(chǎn)生菌在10 16°C培養(yǎng)48 72h而后按5%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(5)將(4)制備的二級(jí)種子按發(fā)酵液體積3 5%的接種量接入10L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在10 12°C培養(yǎng)120 144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶結(jié)束；(6)將 (5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(6)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫溶菌酶制劑。實(shí)施例二 (I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. 0g,NaCl 5. 0g，，瓊脂15. 0g，蒸餾水I. 0L, pH 值 7. 2 7. 4，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基蛋白胨5.0 15. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 3. 0
7.Og,瓊脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖7. 0 13. Og,蛋白胨3. 0 8. 0g,MgSO4 3. 0 8. Og,CaCl2 1.0 3.0g，自來(lái)水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌30111111。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基蛋白胨12. 0 17. 0g，牛肉膏7. 0 13. 0g，NaCl 3.0 7. 0g，自來(lái)水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產(chǎn)生溶菌酶的菌種，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說(shuō)明進(jìn)行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的溶菌酶產(chǎn)生菌在10 16°C培養(yǎng)48 72h而后按5%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(5)將(4)制備的二級(jí)種子按發(fā)酵液體積5 7%的接種量接入50L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在12 14°C培養(yǎng)96 120h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(6)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫溶菌酶制劑。實(shí)施例三(I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. 0g,NaCl 5. 0g，，瓊脂15. 0g，蒸餾水
I.0L, pH 值 7. 2 7. 4，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基蛋白胨5.0 15. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 3. 0
7.Og,瓊脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖7. 0 13. Og,蛋白胨3. 0 8. 0g,MgSO4 3. 0 8. Og,CaCl2 1.0 3.0g，自來(lái)水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌30111111。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基蛋白胨12.0 17. 0g，牛肉膏7.0 13. 0g，NaCl 3.0 7. 0g，自來(lái)水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產(chǎn)生溶菌酶的菌種，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說(shuō)明進(jìn)行初始活化；
(3)將⑵活化好的菌種逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的溶菌酶產(chǎn)生菌在10 16°C培養(yǎng)48 72h而后按5%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(5)將(4)制備的二級(jí)種子按發(fā)酵液體積7 9%的接種量接入100L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在14 16°C培養(yǎng)72 96h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；
(7)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(6)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫溶菌酶制劑。
權(quán)利要求
1.一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶的方法，其包括以下步驟 (1)將產(chǎn)生溶菌酶的微生物逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好； (2)按常規(guī)方法將低溫馴化后的溶菌酶產(chǎn)生菌在10 16°C逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子； (3)將液體一級(jí)種子或二級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的3 9%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10 16°C培養(yǎng)72 144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶結(jié)束； (4)將(3)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液； (5)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，還可以將(4)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，在步驟(5)之后進(jìn)一步包括將步驟(5)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中菌種低溫馴化培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基分別為 (1)菌種低溫馴化培養(yǎng)基:蛋白胨5.0 15. 0g，牛肉膏2. 0 4. 0g，NaC13. 0 7. Og,瓊脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(2)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖7.0 13. 0g，蛋白胨3. 0 8. 0g, MgSO4 3. 0 8. Og,CaCl2 1.0 3.0g，自來(lái)水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌30111111。
(3)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基蛋白胨12.0 17. 0g，牛肉膏7. 0 13. 0g, NaCl 3. 0 7. Og,自來(lái)水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
全文摘要
本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶的方法是將產(chǎn)生溶菌酶的微生物逐級(jí)低溫馴化，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；將低溫馴化后的溶菌酶產(chǎn)生菌在10～16℃逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，按發(fā)酵液體積的3～9％接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10～16℃培養(yǎng)72～144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫溶菌酶結(jié)束；發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，可以將粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號(hào)C12N9/36GK102653745SQ201210109598
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者于爽, 張慶芳, 王曉輝, 王貴鵬, 竇少華, 遲乃玉 申請(qǐng)人:大連大學(xué)