專利名稱：一種利用蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草酸的方法，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛹蟲草Cordyceps militaris是蟲菌結(jié)合的藥用真菌，是子囊菌亞門 Ascomycota、肉座菌目 Hypocreales、麥角菌科 Clavicipitaceae、蟲草屬 Cordyceps 的模式種，又名北冬蟲夏草、北蛹蟲草等，為現(xiàn)代珍稀中草藥，其所含的藥用成分和多種藥效可與傳統(tǒng)名藥——冬蟲夏草相媲美，其中的蟲草酸是主要的生理活性物質(zhì)，有抗自由基、抗氧化的性質(zhì)。而且，蟲草酸含量的高低被作為衡量蟲草質(zhì)量的主要標(biāo)準(zhǔn)之一，一般認(rèn)為蟲草酸含量高的蟲草的藥用價(jià)值高。試驗(yàn)測(cè)定，冬蟲夏草含蟲草酸成分約為7%，而蛹蟲草中的蟲草酸活性成分含量要明顯高于冬蟲夏草，使其應(yīng)用價(jià)值得到人們的廣泛關(guān)注。藥理學(xué)研究表明，蟲草酸具有促進(jìn)人體新陳代謝，改善人體微循環(huán)系統(tǒng)，明顯降低血脂，抑制細(xì)菌，增強(qiáng)對(duì)疾病的抵抗力等作用，以及鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘的功效。蟲草的增強(qiáng)免疫功可使肝臟的解毒作用增強(qiáng)，抗肝組織纖維化，抗脂質(zhì)過氧化，能夠有效保護(hù)肝細(xì)胞，同時(shí)可預(yù)防和治療腦血栓、 腦出血、心肌梗塞、長期衰竭等。由于對(duì)蛹蟲草蟲草酸等活性成分的需求增長迅速，野生蛹蟲草資源被瘋狂采摘而日益稀少昂貴，通過化學(xué)合成其活性成分的途徑工藝復(fù)雜且產(chǎn)量極低，因此其廣泛應(yīng)用受到藥源資源的嚴(yán)重制約。研究發(fā)現(xiàn)，通過液體發(fā)酵生產(chǎn)與從蛹蟲草子實(shí)體、菌絲體中直接提取得到的蟲草酸等活性成分在生化結(jié)構(gòu)、生理作用上基本是相同的，而且具有培養(yǎng)周期短、 生產(chǎn)流程易控制、活性物質(zhì)易于提取等優(yōu)點(diǎn)，蟲草酸等活性物質(zhì)的提取含量及效率都要遠(yuǎn)高于利用人工栽培蟲草進(jìn)行生產(chǎn)和提取。但是目前的蛹蟲草及蟲草酸等活性成分的生產(chǎn)仍是以傳統(tǒng)的固體栽培為主，液體培養(yǎng)研究和應(yīng)用由于發(fā)展時(shí)間短，許多發(fā)酵技術(shù)和工藝仍不成熟，整體產(chǎn)量和發(fā)酵水平較低，限制了其工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展。擴(kuò)張蛋白是在植物細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的一類新蛋白種類。研究表明，擴(kuò)張蛋白幾乎參與了植物的整個(gè)發(fā)育過程除具有增大細(xì)胞的功能外，擴(kuò)張蛋白在細(xì)胞生長、種子萌發(fā)、根毛形成、根系生長、葉原基形成、葉子生長發(fā)育、果實(shí)成熟、器官脫離，以及花粉管生長方面起著重要的作用。在擬南芥、番茄、草莓、棉花、水稻和玉米等多種植物中均已發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張蛋白，被認(rèn)為其普遍存在于各種雙子葉和單子葉植物的細(xì)胞壁中。試驗(yàn)表明擴(kuò)張蛋白是一類細(xì)胞壁酶蛋白，能夠通過打斷細(xì)胞壁多聚物之間的氫鍵誘導(dǎo)酸依賴的細(xì)胞壁延展和壓力松弛，進(jìn)而可能還是在植物生長過程中起生理調(diào)控和細(xì)胞壁延伸過程中的一個(gè)重要調(diào)控因子。然而，關(guān)于擴(kuò)張蛋白的作用機(jī)制目前仍未有明確定論，將擴(kuò)張蛋白應(yīng)用于食藥用菌蛹蟲草的液體發(fā)酵進(jìn)行蟲草酸等次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，國內(nèi)外目前均未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用擴(kuò)張蛋白進(jìn)行蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草酸的方法。本發(fā)明技術(shù)方案如下一種利用蛹蟲草的液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草酸的方法，包括如下步驟(I)將蛹蟲草菌種接種到H)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后按體積百分?jǐn)?shù)10 15%的接種量轉(zhuǎn)接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)條件為溫度 20 25°C，搖床培養(yǎng)24 72h，得種子液；(2)將步驟(I)制得種子液按5 15%的體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度20 25°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)20 30h，然后加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為O. 5 2. 5mg/mL，然后繼續(xù)培養(yǎng)96 144h，分離，得到蛹蟲草菌絲體；(3)從步驟(2)制得的蛹蟲草菌絲體中提取蛹蟲草胞內(nèi)蟲草酸，即得蟲草酸。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的ro液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下馬鈴薯200g、葡萄糖20g,蒸懼水定容至1000mL。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的活化培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100 160r/ min，溫度20 25 °C，暗培養(yǎng)活化24 72h。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的種子發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下3g葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0. 03g CaCl2,0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5顆直徑3 6_的玻璃珠。經(jīng)種子發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后，菌球數(shù)量可提高60%以上、菌球直徑縮小40%以上，菌絲松散均勻。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、2g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0. 03g CaCl2,0. 3g KH2PO4' 0. 3g K2HPO4。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，擴(kuò)張蛋白的濃度為I. O 2. 5mg/mL ;進(jìn)一步優(yōu)選I. 8 2. Omg/mL。最優(yōu)選的,所述步驟(2)中，擴(kuò)張蛋白的濃度為I. 5mg/mL。所述步驟(2)中的擴(kuò)張蛋白溶液可參照現(xiàn)有技術(shù)制備,如采用McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 中的記載的方法制備；也可以按照如下方法制備擴(kuò)張蛋白溶液將蠶豆或黃瓜種子經(jīng)0. 05 0. 15wt% HgCl2消毒4 6min，流水沖洗5 7h，栽入濕蛭石，25 28°C暗培養(yǎng)4 6天；剪取幼苗上胚軸或根系4 5cm，置_20°C預(yù)冷I 2h，加預(yù)冷至O 4°C的勻漿緩沖液勻漿后，用孔徑60 80 μ m的尼龍網(wǎng)過濾，濾渣經(jīng)勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置I 3h，得靜置液；向靜置液中加入提取液，O 4°C下提取24 30h，過濾，按0. 3 0. 5g/mL的添加量向?yàn)V液中緩慢添加 (NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4過程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，然后靜置24 30h， 4°C條件下25000g離心5 IOmin,沉淀用酸性緩沖液復(fù)溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析，透析液經(jīng)20000g離心5 lOmin，取上清液即為制備的擴(kuò)張蛋白溶液。上述擴(kuò)張蛋白溶液制備方法中，所述勻漿緩沖液組分為25mmol/LHEPES(4-羥乙基哌嗪乙橫酸)，3mmol/L Na2S2O5, Immol /T, EDTA, 0. Iwt % Triton X-100, pH 7. 0 ;所述提取液組分為25mmol/L 4-輕乙基哌嗪乙磺酸，I. 0mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸)，3mmol/L Na2S2O5,0. 5mol/L NaCl，pH 6. 8 ;所述酸性緩沖液配制是將2. 05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至4. 0，水定容至1L。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，步驟(2)中所述的分離是在4°C 12000r/min條件下離心分離
5 IOmin0根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中提取蛹蟲草蟲草酸活性成分的方法，步驟如下將步驟⑵制得的蛹蟲草菌絲體65°C烘干I 3h，研成粉末，取O. Ig蛹蟲草菌絲體粉末加20mL體積濃度為50%的乙醇溶液，以500W的功率微波處理lmin，然后12000r/ min離心5min，取上清液，沉淀中加入20mL體積濃度為50%的乙醇溶液，按前述步驟微波處理并離心，合并上清液，制得蟲草酸。本發(fā)明與已有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明將擴(kuò)張蛋白應(yīng)用于蛹蟲草的蟲草酸液體發(fā)酵生產(chǎn),產(chǎn)量可達(dá)2. 621g/L, 是對(duì)照(對(duì)比例I)蟲草酸發(fā)酵產(chǎn)量的7. 3倍以上；本發(fā)明大大提高了整體蛹蟲草的蟲草酸有效成分的產(chǎn)量，具有很好的工業(yè)化應(yīng)用前景；2、本發(fā)明采用液體好氧發(fā)酵方法，一般為5 7天，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，產(chǎn)量高，周期短，無需靜置培養(yǎng)及誘導(dǎo)合成產(chǎn)物等過程，生產(chǎn)效率較高，所生產(chǎn)的蛹蟲草的蟲草酸活性成分可直接用于免疫力調(diào)節(jié)、降脂保肝、降血糖等藥物的制備；3、本發(fā)明所述擴(kuò)張蛋白可從大多數(shù)雙子葉和單子葉植物中提取，來源廣泛，成本較低，本發(fā)明的制備方法經(jīng)優(yōu)化后步驟也相對(duì)簡單，產(chǎn)量高，可規(guī)模提取生產(chǎn)，對(duì)蛹蟲草蟲草酸類活性物質(zhì)的發(fā)酵生產(chǎn)具有很好的促進(jìn)和提升效果；4、本發(fā)明所采用的蛹蟲草液體發(fā)酵工藝簡單，環(huán)保無毒，原材料成本低廉，而且全發(fā)酵過程可控，不受外部環(huán)境條件限制，適合工業(yè)化生產(chǎn)及推廣應(yīng)用。5、本發(fā)明對(duì)液體發(fā)酵培養(yǎng)基和種子發(fā)酵培養(yǎng)基的配方進(jìn)行了優(yōu)化，能夠大幅度提高蛹蟲草的蟲草酸活性成分的產(chǎn)量。


圖I是不同濃度的擴(kuò)張蛋白溶液對(duì)蛹蟲草的蟲草酸產(chǎn)量的影響曲線；
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。原料及培養(yǎng)基實(shí)施例中所述的蛹蟲草(Cordyceps militaris)發(fā)酵菌種，菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 5. 701和CGMCC No. 3. 4655，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。實(shí)施例中的甘露醇、鼠李糖、乙酸胺、乙酰丙酮均購自濟(jì)南盛偉生物科技有限公司；實(shí)施例中所述的擴(kuò)張蛋白溶液的制備步驟如下將蠶豆(Vicia faba L.;購自濟(jì)南茂豐種苗有限公司)或黃瓜(Cucumis sativus L. CV. Jinnian No. 6 ;購自濟(jì)南偉麗種業(yè)有限公司)種子經(jīng)O. 15wt% HgCl2消毒6min,流水沖洗6h，栽入濕蛭石中，27°C暗培養(yǎng)4d。剪取幼苗上胚軸4 5cm，即生長區(qū)約100g， 置-20°C冰箱預(yù)冷lh，加預(yù)冷至4°C的勻漿緩沖液，高速勻漿后，用70 μ m尼龍網(wǎng)過濾，濾渣經(jīng)勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置2h，得靜置液；向靜置液中加入提取液，4°C下提取24h，過濾，濾液按O. 4g/mL的添加量向?yàn)V液中緩慢添加(NH4)2SO4, 添加(NH4)2SO4S程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，然后靜置24h，4°C條件下 25000g離心5min，沉淀用酸性緩沖液復(fù)溶，4°C條件下用截留分子量為3000Da的聚偏氟乙烯(PVDF)透析袋(購自北京博潤萊特科技有限公司)透析，透析液經(jīng)20000g離心5min， 取上清液即為制備的擴(kuò)張蛋白溶液，置4°C下保存。其他未描述步驟可參照McQueen-Mason 等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall extension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 以及https:// homes, bio. psu. edu/expansins/ProtocoIs/Extraction. htm 中的描述進(jìn)行。上述勻漿緩沖液組分為25mmol/LHERES (4-羥乙基哌嗪乙磺酸)，3mmol/ LNa2S2O5, Immol /T, EDTA, O. Iwt% Triton X-100, pH 7. 0 ；上述提取液組分為25mmol/LHERES, I. OmmoI/L EDTA(乙二胺四乙酸)，3mmol/L Na2S2O5,0. 5mol/L NaCl, pH 6. 8 ；所述酸性緩沖液每升按如下方法配制將2. 05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4. 0，水定容至1L。擴(kuò)張蛋白溶液濃度的測(cè)定方法采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)，具體可參照(《精編蛋白質(zhì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，ISBN:703018086，出版日期1900-1-1)中記載的考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行操作， 以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)檢測(cè)上述擴(kuò)張蛋白溶液中擴(kuò)張蛋白濃度為O. 33g/mL。實(shí)施例中所述的ro液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下馬鈴薯200g、葡萄糖20g,蒸懼水定容至lOOOmL。實(shí)施例中所述的種子發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下3g葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0. 03g CaCl2,0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5顆直徑3 6mm的玻璃珠。實(shí)施例中所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、2g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0. 03g CaCl2,0. 3g KH2PO4'
0.3g/L K2HPO4。實(shí)施例I :一種利用擴(kuò)張蛋白提高蛹蟲草的蟲草酸產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，包括如下步驟(I)將蛹蟲草(Cordyceps militaris)菌種，菌種編號(hào)為 CGMCC No. 5. 701,接種到ro液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng)，在溫度25°C、搖床轉(zhuǎn)速150r/min的條件下暗培養(yǎng) 48h，然后按體積百分?jǐn)?shù)15 %的接種量轉(zhuǎn)接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)條件為 溫度25°C，搖床培養(yǎng)48h，得種子液；(2)將步驟⑴制得種子液按15%體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度25°C 的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)24h，然后加入擴(kuò)張蛋白溶液,使擴(kuò)張蛋白的濃度為I. 0mg/mL，然后繼續(xù)培養(yǎng)120h, 12000r/min條件下離心分離IOmin,去發(fā)酵上清液得到蛹蟲草菌絲體；(3)從步驟⑵制得的蛹蟲草菌絲體中提取蟲草酸，步驟如下將步驟(2)由IL發(fā)酵液制得的蛹蟲草菌絲體65°C烘干I 3h，得4. 072g蛹蟲草菌絲，研成粉末，取0. Ig蛹蟲草菌絲體粉末加20mL體積濃度為50%的乙醇溶液，以500W的功率微波處理lmin，然后12000r/min離心5min，取上清液，沉淀中繼續(xù)加入20mL體積濃度為50%的乙醇溶液，按前述步驟微波處理并離心，合并上清液，制得蟲草酸。
7
蟲草酸待測(cè)樣品的制備取上述步驟制得的蟲草酸，用體積濃度為50%的乙醇溶液定容至50mL。蟲草酸活性成分的測(cè)定采用本領(lǐng)域常規(guī)的高碘酸鈉比色法測(cè)定(參照溫魯，尹起范，唐玉玲等.蛹蟲草與有關(guān)蟲草活性成份檢測(cè)比較[J].食品科學(xué)，2004，25 (8) =155-157)(I)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以甘露醇為基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作稱取105°C干燥2h并冷卻至室溫的甘露醇粉末，配成5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL、0. lmL、0. 2mL、0. 3 mL、0. 4mL、
0.5mL、0. 6mL、0. 7mL、0. 8mL、0. 9mL置試管中，分別加蒸懼水水至I. OmL,然后加ImL 15mM的高碘酸鈉試液(3. 2g高碘酸鈉溶于蒸餾水中，加10. 2mL濃鹽酸，蒸餾水定容至1L)混勻，室溫放置IOmin,加2mL O. Iwt %鼠李糖，4mL新配制的Nash試液(稱取乙酸胺150g,蒸懼水溶解，加入2mL冰醋酸，2mL乙酰丙酮，定容至1L)，搖勻，置于53°C水浴中保溫15min。用分光光度計(jì)在420nm下測(cè)定反應(yīng)溶液的吸光度值，以甘露醇含量(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值 A4m為縱坐標(biāo),繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)蟲草酸活性成分產(chǎn)量的檢測(cè)取蟲草酸待測(cè)樣品500yL于試管中，用蒸餾水定容至l.OmL，搖勻?？瞻讓?duì)照為
1.OmL水。然后加ImL 15mM的高碘酸鈉試液(3. 2g高碘酸鈉溶于蒸餾水中，加10. 2mL濃鹽酸，蒸懼水定容至1L)混勻，室溫放置IOmin,加2mL O. I %鼠李糖,4mL新配制的Nash試液(稱取乙酸胺150g，蒸餾水溶解，加入2mL冰醋酸，2mL乙酰丙酮，定容至1L)，搖勻，置于 53°C水浴中保溫15min。用分光光度計(jì)在420nm下測(cè)定反應(yīng)溶液的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蟲草酸待測(cè)樣品中蟲草酸含量為237. 23 μ g。每升發(fā)酵液對(duì)應(yīng)菌絲體的蟲草酸產(chǎn)量為237. 23 μ gX IOOX 10X4. 072 =
O.966g;結(jié)果如圖I所示。實(shí)施例2 如實(shí)施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，步驟(2)中在溫度25°C的條件下，加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為I. 5mg/mL,然后繼續(xù)培養(yǎng)120h。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，每克菌絲體(干重)中含有蟲草酸271. 55mg,即對(duì)應(yīng)每升發(fā)酵液產(chǎn)生的菌絲體中含有2. 621g蛹蟲草蟲草酸。結(jié)果如圖I所示。實(shí)施例3 如實(shí)施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，步驟(2)中在溫度25°C的條件下，加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為2. Omg/mL，然后繼續(xù)培養(yǎng)120h。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，每克菌絲體(干重)中含有蟲草酸257. 07mg,即對(duì)應(yīng)每升發(fā)酵液產(chǎn)生的菌絲體中含有2. 097g蛹蟲草蟲草酸。結(jié)果如圖I所示。實(shí)施例4如實(shí)施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，步驟(2)中在溫度25°C的條件下，加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為2. 5mg/mL,然后繼續(xù)培養(yǎng)120h。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，每克菌絲體(干重)中含有蟲草酸252. 39mg,即對(duì)應(yīng)每升發(fā)酵液產(chǎn)生的菌絲體中含有1.949g蛹蟲草蟲草酸。結(jié)果如圖I所示。對(duì)比例I
如實(shí)施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，所述步驟(2)中用不含擴(kuò)張蛋白的酸性緩沖液替代實(shí)施例加入的擴(kuò)張蛋白溶液，溫度25°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)144h。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，每克菌絲體(干重)中含有蟲草酸175. 25mg,即對(duì)應(yīng)每升發(fā)酵液產(chǎn)生的菌絲體中含有O. 356g蛹蟲草蟲草酸。結(jié)果如圖I所示。
權(quán)利要求
1.一種利用蛹蟲草的液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草酸的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將蛹蟲草菌種接種到ro液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后按體積百分?jǐn)?shù) 10 15%的接種量轉(zhuǎn)接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)條件為溫度20 250C，搖床培養(yǎng)24 72h，得種子液；(2)將步驟(I)制得種子液按5 15%的體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度 20 25°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)20 30h，然后加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為 O. 5 2. 5mg/mL，然后繼續(xù)培養(yǎng)96 144h，分離，得到蛹蟲草菌絲體；(3)從步驟(2)制得的蛹蟲草菌絲體中提取蛹蟲草胞內(nèi)蟲草酸，即得蟲草酸。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的活化培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100 160r/min，溫度20 25°C，暗培養(yǎng)活化24 72h。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的種子發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下3g 葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0.03g CaCl2、0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5顆直徑3 6mm的玻璃珠。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、2g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0.03g CaCl2,0. 3g KH2PO4'O. 3g K2HPO4。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，擴(kuò)張蛋白的濃度為I.O 2. 5mg/mL。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，擴(kuò)張蛋白的濃度為I.8 2.Omg/mL ;最優(yōu)選的,所述步驟⑵中，擴(kuò)張蛋白的濃度為I. 5mg/mL。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的擴(kuò)張蛋白溶液按照如下方法制備將蠶豆或黃瓜種子經(jīng)O. 05 O. 15wt% HgCl2消毒4 6min，流水沖洗5 7h，栽入濕蛭石，25 28°C暗培養(yǎng)4 6天；剪取幼苗上胚軸或根系4 5cm，置_20°C預(yù)冷I 2h，加預(yù)冷至O 4°C的勻漿緩沖液勻漿后，用孔徑60 80 μ m的尼龍網(wǎng)過濾，濾渣經(jīng)勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置I 3h，得靜置液；向靜置液中加入提取液， O 4°C下提取24 30h,過濾，按O. 3 O. 5g/mL的添加量向?yàn)V液中緩慢添加(NH4)2SO4, 添加(NH4)2SO4S程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，然后靜置24 30h，4°C條件下 25000g離心5 IOmin,沉淀用酸性緩沖液復(fù)溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析,透析液經(jīng)20000g離心5 lOmin，取上清液即為制備的擴(kuò)張蛋白溶液。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液組分為25mmol/L4-羥乙基哌嗪乙橫酸，3mmol/L Na2S2O5, lmmol/L 乙二胺四乙酸，O. Iwt % Triton Χ-100, ρΗ7· O ; 所述提取液組分為25mmol/L 4-輕乙基哌嗪乙磺酸，I. Ommol/L乙二胺四乙酸,3mmol/L Na2S2O5,0. 5mol/L NaGl，pH 6. 8 ;所述酸性緩沖液配制是將2. 05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至4. 0，水定容至1L。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的分離是在4°C12000r/ min條件下離心分離5 lOmin。
10.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中提取蛹蟲草蟲草酸活性成分的方法，步驟如下將步驟(2)制得的蛹蟲草菌絲體65°C烘干I 3h，研成粉末，取O. Ig蛹蟲草菌絲體粉末加20mL體積濃度為50%的乙醇溶液，以500W的功率微波處理lmin，然后12000r/min離心5min，取上清液，沉淀中加入20mL體積濃度為50%的乙醇溶液，按前述步驟微波處理并離心，合并上清液，制得蟲草酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草酸的方法，(1)將蛹蟲草菌種接種到PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行種子培養(yǎng)，得種子液；(2)將種子液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，液體發(fā)酵培養(yǎng)20～30h，然后加入擴(kuò)張蛋白溶液，繼續(xù)培養(yǎng)96～144h，分離，得到蛹蟲草菌絲體；(3)從蛹蟲草菌絲體中提取蛹蟲草胞內(nèi)蟲草酸，即得蟲草酸。本發(fā)明將擴(kuò)張蛋白應(yīng)用于蛹蟲草的蟲草酸液體發(fā)酵生產(chǎn)，產(chǎn)量可達(dá)2.621g/L，是對(duì)照蟲草酸發(fā)酵產(chǎn)量的7.3倍以上；具有很好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P7/18GK102605005SQ20121011151
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月16日
發(fā)明者萬魯長, 任鵬飛, 單洪濤, 姚強(qiáng), 孫濤, 宮志遠(yuǎn), 李瑾, 王 琦, 趙軍勝, 韓建東, 高能 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所