專利名稱：一種適用于文蛤家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳育種的分子輔助技術(shù)，具體的說是一種適用于文蛤家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
家系選擇育種室新品種培育的有效方法，通過建立家系進(jìn)行系統(tǒng)選擇是遺傳育種的重要手段，已在動植物中取得廣泛成功。完成、準(zhǔn)確的系譜信息對育種進(jìn)程會產(chǎn)生很大的影響，不能準(zhǔn)確確認(rèn)個(gè)體間的親緣關(guān)系，會導(dǎo)致育種過程中遺傳進(jìn)展的降低。通過親子鑒定正確判別親子關(guān)系，修正錯(cuò)誤系譜信息，對促進(jìn)品種改良具有重要意義。同時(shí)，在人工放養(yǎng)、放流過程中，為減少近交造成個(gè)體生活力降低，保持物種的遺傳多樣性，也需要弄清楚育種親本的親緣關(guān)系。
微衛(wèi)星DNA(microsatellite)又稱簡單重復(fù)序列，由于其具有分布廣、多態(tài)性高、在單個(gè)位點(diǎn)基因呈共顯性遺傳、檢測方法快速穩(wěn)定、所需DNA量少、易于分析等優(yōu)點(diǎn)，在親子鑒定中有著明顯的優(yōu)勢。文蛤是廣鹽性貝類，分布于朝鮮、日本、越南、巴基斯坦、印度和中國，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，已成為我國大量出口的重要鮮活水產(chǎn)品之一。由于文蛤養(yǎng)殖具有投資小，見效快，效益高等優(yōu)點(diǎn)，得到了很大發(fā)展。利用分子標(biāo)記技術(shù)，建立一套適用于文蛤的微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系，對選育中保持家系信息、確定親緣關(guān)系、追蹤家系提供有力工具，為文蛤的育種規(guī)劃奠定良好基礎(chǔ)，是本技術(shù)領(lǐng)域的科研人員力求探究的方法，但目前這種方法在文蛤育種的成功應(yīng)用鮮有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適用于文蛤家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種適用于文蛤家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，包括微衛(wèi)星位點(diǎn)來源、引物設(shè)計(jì)、弓丨物優(yōu)化和微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系I)微衛(wèi)星位點(diǎn)的來源提取文蛤的基因組DNA利用提取的DNA，采用限制性內(nèi)切酶法獲得文蛤基因組DNA片段，并構(gòu)建微衛(wèi)星磁珠富集文庫，檢測陽性克隆，經(jīng)測序得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的DNA序列；2)引物設(shè)計(jì)在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列利用軟件Primer Premier 5. O設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)條件為引物長度為19-25mer ;GC含量為40% -60% ;退火溫度為45_65°C ;預(yù)期PCR產(chǎn)物長度為100-400bp ；3)引物優(yōu)化根據(jù)不同引物的Tm值進(jìn)行溫度梯度優(yōu)化，在Tm值上下各10°C，溫度梯度優(yōu)化擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-EB染色系統(tǒng)進(jìn)行檢測，選取雜帶較少、特異性產(chǎn)物亮度較高的PCR反應(yīng)對應(yīng)的溫度為該引物的最佳退火溫度Ta ；4)微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系的確立微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性水平可用信息含量值(Pic)衡量，根據(jù)上述優(yōu)化獲得的Ta值，選取多個(gè)體作為群體進(jìn)行計(jì)算微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性水平可用信息含量值(PIC)進(jìn)而衡量多態(tài)性信息，根據(jù)PIC值，PIC小于O. 25的標(biāo)記，篩選得到重復(fù)性好、穩(wěn)定性好，PIC值大于O. 25的位點(diǎn)，作為文蛤微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系，用于文蛤的家系區(qū)分與個(gè)體識別。所述引物優(yōu)化時(shí)根據(jù)不同引物的Tm值進(jìn)行溫度梯度優(yōu)化，在Tm值上下各10°C，溫度梯度優(yōu)化擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存；反應(yīng)體系為 20yL，含有 40ng 文蛤基因組 DNA，1XPCR Buffer ;Mg2+，L 5mmol/L ;rTaq IU ；dNTP (lOmmol/L)，0· 5 μ L ;正反向引物(10 μ mol/L)，各 0· 5 μ L ;加雙蒸水補(bǔ)體系到 20 μ L，其中模板是從多個(gè)混合個(gè)體中任取5個(gè)個(gè)體的DNA等量混合得到。所述正反向引物為

MMB39，正向GCATGCTCGTACACACAA，反向GAATTTCCTTCCATGTCATTT ；MMB41，正向CGCCTTACTTTATTCCTGATT，反向CCATTCTCATGTTTCTGTTCT ；MME64,正向CACCCTCATGTCTTTGAACTA，反向TATAGTCCGAGGCACTACAAA ；MME84,正向TCCATCTTCTTCTGAAACTCA，反向TCCACAAGAGTTTTGTTGTCT ；MME88,正向GTCTCATTCTTTGTTGCTGAA，反向ACGTGTTGAGTGGTAACCTAA ；MME105,正向ACGCACGCACTCACGCACT，反向CTGGAGACTTGTTTAAAATGG ；MMF68,正向TGAGATGAGACCCTGTGTTAC，反向AAGCAATGATTCTTCACCTAA ； MMF71,正向CGATTCCTATTGGTTGAAAAT，反向ATGAAATCGTTTGCCACA。所述擴(kuò)增條件為94°C變性45s，退火45s，72°C延伸50s。所述微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系的確立，根據(jù)步驟4)所得Ta值選取多個(gè)體作為群體進(jìn)行多態(tài)性信息含量值的計(jì)算，PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，4°C保存；反應(yīng)體系為 20 μ L，含有 40ng 文蛤基因組 DNA，IXPCR Buffer ;Mg2+，I. 5mmol/L ；rTaq IU ；dNTP (lOmmol/L), 0. 5 μ L ;正反向引物(10 μ mol/L),各 O. 5 μ L ;并用雙蒸水補(bǔ)體系加到20 μ L ；PCR產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-EB染色系統(tǒng)進(jìn)行檢測，紫外觀察成像并對電泳帶譜利用公式PIC =I-E Pi2進(jìn)行計(jì)算，其中Pi是第i個(gè)等位基因的頻率，所有位點(diǎn)的等位基因頻率由軟件P0PGEN32進(jìn)行計(jì)算得出，根據(jù)PIC值的計(jì)算結(jié)果，去除重復(fù)性、穩(wěn)定性差，PIC小于0. 25的標(biāo)記，篩選得到重復(fù)性好、穩(wěn)定性好，PIC值大于0. 25的位點(diǎn)，作為文蛤微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系，用于文蛤的家系區(qū)分與個(gè)體識別。所述步驟4)確立微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系的引物為MMB39，MMB41，MME64，MME84，MME88, MME107, MMF68 和 MMF71。所述PCR程序?yàn)?4 V變性45s，各引物優(yōu)化的最佳退火Ta退火45s，72°C延伸50s。本發(fā)明內(nèi)容包括微衛(wèi)星位點(diǎn)來源、引物設(shè)計(jì)、引物優(yōu)化和微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系的確立。通過上述步驟，最終確認(rèn)其中的8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記作為文蛤家系微衛(wèi)星鑒定體系，用于文蛤不同家系間區(qū)分或進(jìn)行個(gè)體間的識別和鑒定，為文蛤遺傳育種中的分子標(biāo)記輔助選育提供技術(shù)手段。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其設(shè)計(jì)原理可行，標(biāo)記方式簡單，實(shí)用性好，特別適用于文蛤家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例提供的文蛤家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)MMF68對文蛤&&7家系中的雌性(早)和雄性( )親本及其5個(gè)子代(編號1，3，17，29，56)的擴(kuò)增結(jié)果示意圖，通過多態(tài)微衛(wèi)星綜合分析，可有效識別鑒定個(gè)體間的親緣關(guān)系。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例中將本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不限于此。本實(shí)施例具體步驟為(I)微衛(wèi)星位點(diǎn)的來源提取文蛤的基因組DNA，利用限制性內(nèi)切酶法獲得文蛤基因組DNA片段，并構(gòu)建微衛(wèi)星磁珠富集文庫，檢測陽性克隆，經(jīng)測序得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的DNA序列；(2)引物設(shè)計(jì)在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列利用軟件Primer Premier 5· O設(shè)計(jì)引 物，引物設(shè)計(jì)條件為引物長度為19-25mer ;GC含量為40% -60%;退火溫度為45_65°C;預(yù)期PCR產(chǎn)物長度為100-400bp ；(3)引物優(yōu)化不同引物根據(jù)不同Tm值，在溫度梯度PCR儀上進(jìn)行溫度梯度優(yōu)化，在Tm值上下各10°C，PCR擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-EB染色系統(tǒng)進(jìn)行檢測，選取雜帶較少、特異性產(chǎn)物亮度較高的PCR反應(yīng)對應(yīng)的溫度為該引物的最佳退火溫度Ta值；(4)微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系的確立微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性水平可用信息含量值(Pic)衡量。根據(jù)上述優(yōu)化獲得的Ta值，選取多個(gè)個(gè)體作為群體進(jìn)行多態(tài)性信息含量值的計(jì)算，根據(jù)PIC值的計(jì)算結(jié)果，去除重復(fù)性、穩(wěn)定性差，PIC小于O. 25的標(biāo)記，最終篩選得到重復(fù)性好、穩(wěn)定性好，PIC值大于O. 25的位點(diǎn)8個(gè)(表I)，用于文蛤的家系區(qū)分與個(gè)體識別。表18個(gè)用于文蛤家系鑒定體系的文蛤微衛(wèi)星標(biāo)記
ImmIritr 雪___ g* -r ) %m
MMB39 F: GCATGCTCGTACACACAA
R: GAATTTCCTTCCATGTCATTT 58 V (TAC)22 O.812 MMB41 F: CGCCTTACTTTATTCCTGATT
R: CCATTCTCATGTTTCTGTTCT 57 V (TG)15O.793
MME64 F: CACCCTCATGTCTTTGAACTA
_R: TATAGTCCGAGGCACTACAAA 50 V (TTG)15 O.827_
權(quán)利要求
1.一種適用于文蛤家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，包括微衛(wèi)星位點(diǎn)來源、引物設(shè)計(jì)、引物優(yōu)化和微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系，其特征在于 1)微衛(wèi)星位點(diǎn)的來源提取文蛤的基因組DNA利用提取的DNA，采用限制性內(nèi)切酶法獲得文蛤基因組DNA片段，并構(gòu)建微衛(wèi)星磁珠富集文庫，檢測陽性克隆，經(jīng)測序得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的DNA序列； 2)引物設(shè)計(jì)在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列利用軟件PrimerPremier 5. O設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)條件為引物長度為19-25mer ;GC含量為40% -60% ;退火溫度為45_65°C ;預(yù)期PCR產(chǎn)物長度為100-400bp ； 3)引物優(yōu)化根據(jù)不同引物的Tm值進(jìn)行溫度梯度優(yōu)化，在Tm值上下各10°C，溫度梯度優(yōu)化擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-EB染色系統(tǒng)進(jìn)行檢測，選取雜帶較少、特異性產(chǎn)物亮度較高的PCR反應(yīng)對應(yīng)的溫度為該引物的最佳退火溫度Ta ； 4)微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系的確立微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性水平可用信息含量值(PIC)衡量，根據(jù)上述優(yōu)化獲得的Ta值，選取多個(gè)體作為群體進(jìn)行計(jì)算微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性水平可用信息含量值(PIC)進(jìn)而衡量多態(tài)性信息， 根據(jù)PIC值，PIC小于O. 25的標(biāo)記，篩選得到重復(fù)性好、穩(wěn)定性好，PIC值大于O. 25的位點(diǎn)，作為文蛤微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系，用于文蛤的家系區(qū)分與個(gè)體識別。
2.按權(quán)利要求I所述的適用于文蛤家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，其特征在于所述引物優(yōu)化時(shí)根據(jù)不同引物的Tm值進(jìn)行溫度梯度優(yōu)化，在Tm值上下各10°C，溫度梯度優(yōu)化擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存；反應(yīng)體系為20 μ L，含有 40ng 文蛤基因組 DNA, IXPCR Buffer ;Mg2+，I. 5mmol/L ；rTaq IU ；dNTP(lOmmol/L)，0. 5 μ L ;正反向引物(10 μ mol/L)，各O. 5 μ L ;加雙蒸水補(bǔ)體系到20 μ L，其中模板是從多個(gè)混合個(gè)體中任取5個(gè)個(gè)體的DNA等量混合得到。
3.按權(quán)利要求2所述的適用于文蛤家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，其特征在于，所述正反向引物為 ΜΜΒ39，正向GCATGCTCGTACACACAA，反向GAATTTCCTTCCATGTCATTT ； MMB41，正向CGCCTTACTTTATTCCTGATT，反向CCATTCTCATGTTTCTGTTCT ； MME64，正向CACCCTCATGTCTTTGAACTA，反向TATAGTCCGAGGCACTACAAA ; MME84，正向TCCATCTTCTTCTGAAACTCA，反向TCCACAAGAGTTTTGTTGTCT ； MME88，正向GTCTCATTCTTTGTTGCTGAA，反向ACGTGTTGAGTGGTAACCTAA ; MME105，正向ACGCACGCACTCACGCACT，反向CTGGAGACTTGTTTAAAATGG ； MMF68，正向TGAGATGAGACCCTGTGTTAC，反向AAGCAATGATTCTTCACCTAA ； MMF71，正向CGATTCCTATTGGTTGAAAAT，反向ATGAAATCGTTTGCCACA。
4.按權(quán)利要求2所述的適用于文蛤家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，其特征在于所述擴(kuò)增條件為94°C變性45s，退火45s，72°C延伸50s。
5.按權(quán)利要求I所述的適用于文蛤家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，其特征在于所述微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系的確立，根據(jù)步驟4)所得Ta值選取多個(gè)體作為群體進(jìn)行多態(tài)性信息含量值的計(jì)算，PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmi n，4°C保存；反應(yīng)體系為 20yL，含有 40ng 文蛤基因組 DNA，1XPCR Buffer ;Mg2+，L 5mmol/L ;rTaq IU ；dNTP(10mmo 1/L), 0. 5 μ L ;正反向引物(10 μ mol/L),各0. 5 μ L ;并用雙蒸水補(bǔ)體系加到·20 μ L ;PCR產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-EB染色系統(tǒng)進(jìn)行檢測，紫外觀察成像并對電泳帶譜利用公式PIC =I-E Pi2進(jìn)行計(jì)算，其中Pi是第i個(gè)等位基因的頻率，所有位點(diǎn)的等位基因頻率由軟件POPGEN32進(jìn)行計(jì)算得出，根據(jù)PI C值的計(jì)算結(jié)果，去除重復(fù)性、穩(wěn)定性差，PIC小于O. 25的標(biāo)記，篩選得到重復(fù)性好、穩(wěn)定性好，PIC值大于O. 25的位點(diǎn)，作為文蛤微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系，用于文蛤的家系區(qū)分與個(gè)體識別。
6.按權(quán)利要求5所述的適用于文蛤家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，其特征在于所述PCR程序?yàn)?4°C變性45s，各引物優(yōu)化的最佳退火Ta退火45s，72°C延伸50s。
全文摘要
本發(fā)明涉及遺傳育種的分子輔助技術(shù)，具體的說是一種適用于文蛤家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記方法。具體為包括微衛(wèi)星位點(diǎn)來源、引物設(shè)計(jì)、引物優(yōu)化和微衛(wèi)星標(biāo)記家系鑒定體系確立四個(gè)步驟，先用磁珠富集文庫方法篩選微衛(wèi)星序列，用微衛(wèi)星檢索軟件進(jìn)行微衛(wèi)星片段的快速分離；在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化引物成為微衛(wèi)星標(biāo)記；然后對微衛(wèi)星標(biāo)記在擴(kuò)增過程中的重復(fù)性、穩(wěn)定性和多態(tài)性信息含量值進(jìn)行綜合評價(jià)，確認(rèn)其中的微衛(wèi)星標(biāo)記作為文蛤家系微衛(wèi)星鑒別體系，用于文蛤不同家系的區(qū)分或個(gè)體間識別和鑒定，為文蛤遺傳選育提供分子標(biāo)記手段。
文檔編號C12Q1/68GK102719527SQ20121011232
公開日2012年10月10日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者劉保忠, 盧霞, 王鴻霞 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所