專利名稱：一種玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米的方法，尤其涉及一種玉米種子整體侵染的方法。
背景技術(shù)：
玉米是世界主要糧食作物和重要工業(yè)原料之一，在世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著舉足輕重的地位。我國為世界第二大玉米生產(chǎn)國，對玉米的需求與日俱增。常規(guī)育種技術(shù)已無法滿足社會對玉米新品種的迫切需求，而基因工程的應(yīng)用必將大大推進(jìn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗新品種的選育進(jìn)程，因此玉米的遺傳轉(zhuǎn)化研究具有明顯的應(yīng)用和理論意義。已經(jīng)應(yīng)用的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)有基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法、PEG介導(dǎo)法、子房注射法、超聲波法、陽離子轉(zhuǎn)化法、電擊法等。其中玉米遺傳轉(zhuǎn)化主流方法是基因槍轟擊法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法?；驑屴Z擊法有整合模式相對復(fù)雜、外源基因表達(dá)傳代相對不穩(wěn)定、容易受技術(shù)限制的缺點(diǎn)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法盡管有載體骨架甚至染色體片段可被轉(zhuǎn)移的缺點(diǎn)，但有整合模式相對簡單外源基因表達(dá)傳代相對穩(wěn)定，操作簡便、成本低，也可轉(zhuǎn)移大片段等優(yōu)點(diǎn)。因此，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因法是目前玉米遺傳轉(zhuǎn)化的主流方法之一。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化中，建立良好的受體系統(tǒng)是玉米遺傳轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié)，涉及提供適宜轉(zhuǎn)化的受體材料和轉(zhuǎn)基因后的細(xì)胞能否再生植株等問題。常用的受體材料包括:外植體(幼胚、幼胚盾片、莖尖分生組織、莖節(jié)、幼雄穗、發(fā)芽玉米種子、芽尖、胚芽鞘、花粉、小孢子胚等)、胚性愈傷組織、由胚性愈傷組織建立的懸浮細(xì)胞系和由胚性愈傷組織或懸浮細(xì)胞系分離出的原生質(zhì)體。大量研究表明，基因型是外植體形成的愈傷組織重要限制因素，受基因型限制很大，且存在著再生頻率低、再生細(xì)胞部位與感受態(tài)細(xì)胞不一致，對農(nóng)桿菌侵染不敏感且實(shí)驗(yàn)周期長、工作量大、培養(yǎng)困難等。而玉米種子不經(jīng)過愈傷組織培養(yǎng)及再生階段，侵染后直接發(fā)育成植株，不受這些限制。學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為 單子葉植物能否利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素是農(nóng)桿菌能否吸附在植物細(xì)胞表面，以及外源基因是否能夠整合到植物基因組中。早期研究認(rèn)為，單子葉植物尤其是禾本科作物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，細(xì)胞缺乏農(nóng)桿菌的附著位點(diǎn)，不能被吸附。許東輝等還從水稻中分離出一種高效抑制農(nóng)桿菌生長及抑制其在水稻細(xì)胞表面附著的信號分子。Roberta等(1995)發(fā)現(xiàn)玉米等單子葉植物完全能夠被農(nóng)桿菌吸附，而且在轉(zhuǎn)化過程中加入外源酚類物質(zhì)通常會提高轉(zhuǎn)化頻率。因此，農(nóng)桿菌能否吸附在植物細(xì)胞表面是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵限制因素之一。Schlappi等(1992)用帶有玉米條斑病毒基因感染玉米幼胚和胚芽鞘，通過農(nóng)桿菌對玉米幼胚親和性的研究，證明只有那些再生和整合能力強(qiáng)的感受態(tài)細(xì)胞或處于分裂時(shí)期的細(xì)胞才能整合外源DNA，得到轉(zhuǎn)化植株，但大多數(shù)基因型玉米缺乏感受態(tài)的細(xì)胞。而玉米種子是具有潛在分生能力的組織或細(xì)胞，在其吸脹階段用含有目標(biāo)基因的菌液浸泡，使其在吸脹階段將含有目標(biāo)基因的菌液吸進(jìn)去，在吸脹后，種子萌發(fā)，這個(gè)時(shí)期，種子中的細(xì)胞處于分裂時(shí)期，且此時(shí)細(xì)胞表面吸附有農(nóng)桿菌，從而將外源基因整合到玉米基因組中。目前，這方面的研究還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有玉米遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)取材受限、工作量與難度大、再生困難、轉(zhuǎn)化周期長、效率低及如何在細(xì)胞分裂時(shí)期保證細(xì)胞表面吸附有含有目標(biāo)基因的農(nóng)桿菌的難點(diǎn)，提供一種玉米種子整體侵染的方法，以提高玉米的轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明的目的是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法，該方法是采用玉米種子整體侵染的方法實(shí)現(xiàn)的，步驟包括:①、測成熟玉米種子的生理吸脹曲線，②、目標(biāo)發(fā)根農(nóng)桿菌的培養(yǎng)，③、玉米種子滅菌，④、結(jié)合玉米種子的生理吸脹曲線，將經(jīng)消毒滅菌的玉米種子轉(zhuǎn)入到OD6c 值為0.2-0.5左右的發(fā)根農(nóng)桿菌的菌液中振蕩侵染18-21小時(shí)，⑤、在25°C黑暗條件下共培養(yǎng)3天，⑥、移栽侵染植株，⑦、轉(zhuǎn)基因植株分子檢測；其中:
步驟①所述測成熟玉米種子的生理吸脹曲線的方法是:取12份等量的成熟玉米種子，每隔3小時(shí)取I份浸泡·到水中，分別浸泡0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33小時(shí)，記錄玉米種子不發(fā)生損傷的吸脹停滯點(diǎn)為18-24小時(shí)；
步驟②所述目標(biāo)發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)的方法是:將發(fā)根農(nóng)桿菌A4于LB固體培養(yǎng)基平板上接種活化2次，之后挑取該菌株的單菌落接種到5 ml含有20 Ug.ml-1利福平和50Ug.πιΓ1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度26°C、振蕩轉(zhuǎn)速160-200 rpm的條件下,培養(yǎng)5-8小時(shí),然后取I ml轉(zhuǎn)接于40 ml含有20 Ug πιΓ1利福平、50 ug ^r1卡那霉素和200 umol -Γ1乙酰丁香酮的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度26°C、振蕩轉(zhuǎn)速160-200 rpm的條件下，培養(yǎng)12-16小時(shí)后；用含20 Ug.πιΓ1利福平、50 Ug.πιΓ1卡那霉素和200 umol.L—1乙酰丁香酮的LB液體培養(yǎng)基稀釋上述菌液至0D_=0.2-0.5備用；
步驟③所述玉米種子滅菌的方法是:挑選飽滿的玉米種子，Cl2滅菌4.5小時(shí)，然后用無菌水洗滌5-6次，準(zhǔn)備侵染用；
步驟④所述結(jié)合玉米種子的生理吸脹曲線，侵染玉米種子18-21小時(shí)的方法是:結(jié)合玉米種子的生理吸脹曲線，將經(jīng)消毒滅菌的成熟玉米種子轉(zhuǎn)入到裝有步驟②制備好的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的無菌器皿中，農(nóng)桿菌菌液量以剛浸沒玉米種子為準(zhǔn)，用封口膜封住瓶口，置于搖床中，于溫度26°C、振蕩轉(zhuǎn)速166 rpm條件下，培養(yǎng)18-21小時(shí)；
步驟⑤所述的共培養(yǎng)的方法是:待步驟④侵染18-21小時(shí)后，從搖床中取出小瓶置于超凈工作臺內(nèi)，倒掉菌液，加入無菌水沖洗三次后，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25°C黑暗條件下，共培養(yǎng)3天；
步驟⑥所述移栽侵染植株的方法是:當(dāng)步驟⑤獲得的種子萌發(fā)的苗長達(dá)到1-2 cm時(shí)，用鑷子將種子夾出，用含150mg -Γ1頭孢霉素的溶液浸泡1-2分鐘后，移栽到花土中，移栽之后第1-2周內(nèi)用含150mg *L_1頭孢霉素的溶液燒水,保持土壤濕度80%左右,且置于有一定光照的陰涼處，不可被陽光直射，2周后,栽入大花盆中，于溫室培養(yǎng)。上述方法各步中采用的培養(yǎng)基及其配方是:
LB液體培養(yǎng)基是由IOg.Γ1 NaCl，IOg.Γ1蛋白胨，5g.Γ1酵母浸膏組成，pH值
7.0 ；
LB固體培養(yǎng)基是指在LB液體培養(yǎng)基中，再添加15g.L—1瓊脂；
共培養(yǎng)培養(yǎng)基是指=MS加7 g.Γ1瓊脂，pH值5.80-5.82 ；其中 MS 培養(yǎng)基組成為:ΚΝ03 1900 mg. Λ NH4NO3 1650 mg. Λ CaCl2.2Η20 440mg.ΙΛ MgSO4.7Η20 370 mg. Λ KH2PO4 170 mg. Λ H3BO3 6.2 mg. Λ MnSO4.H2O16.9 mg.ΙΛ ZnSO4.7Η20 8.6 mg. Λ KCl 0.83 mg. Λ Na2MoO4.2Η20 0.25 mg. ΛCuSO4.5Η20 0.025 mg. Λ CoCl2.6Η20 0.025 mg. Λ Na2EDTA 37.3 mg. Λ FeSO4.7Η2027.8 mg.171,肌醇20 g.L-1,煙酸100 mg.L—1,鹽酸批P多酉享100 mg.171,鹽酸硫胺素100mg.I71，甘氨酸 400 mg.L-1,鹿糖 30 g.L-1, pH 值 5.80-5.83。上述玉米種子整體侵染的方法中:步驟②所述目標(biāo)農(nóng)桿菌菌株是發(fā)根農(nóng)桿菌(Ageobacterium rhizogenes) A4 菌株；該菌株已在 ZL200710055462.3 公開并使用。上述玉米種子整體侵染的方法中:
步驟②制備好的用于侵染的農(nóng)桿菌菌液濃度OD6tltl優(yōu)選0.3左右。步驟④所述的玉米種子吸脹的時(shí)間段為0-18/24小時(shí)，農(nóng)桿菌浸泡侵染玉米種子時(shí)間優(yōu)選18-21小時(shí)。步驟⑥所述頭孢霉素的濃度為150 mg.L'本發(fā)明具有以下積極的效果:1、為實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明使用成熟玉米種子作為實(shí)驗(yàn)材料、結(jié)合玉米種子生理吸脹曲線、在玉米種子吸脹階段用發(fā)根農(nóng)桿菌菌液振蕩侵染成熟玉米種子18-21小時(shí)，來達(dá)到提高轉(zhuǎn)化率、縮短實(shí)驗(yàn)周期的效果。2、本發(fā)明以成熟玉米種子作為轉(zhuǎn)化受體，縮短了實(shí)驗(yàn)周期、提高了轉(zhuǎn)化率及轉(zhuǎn)化后的移栽成活率。3、本發(fā)明的方法操作簡單可行，具有明顯優(yōu)勢和突破性特點(diǎn)。與顯微注射法、電擊法和其他農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法相比，轉(zhuǎn)化率顯著提高、實(shí)驗(yàn)周期明顯縮短、操作簡單可行。對于玉米基因工程方面的理論研究以及遺傳育種實(shí)踐均具有重要意義。


圖1:轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測。其中CK-以未轉(zhuǎn)化植株為陰性對照，1-7-以轉(zhuǎn)化植株為樣品。圖2:轉(zhuǎn)基因植株Southern blot檢測。CK-未轉(zhuǎn)基因的玉米的Southern blot檢測情況，1-7-玉米Tl代轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot檢測情況。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施案例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
一、培養(yǎng)基的配制和滅菌
1.LB液體培養(yǎng)基的配制:分別稱量10 g NaClUO g蛋白胨和5 g酵母浸膏放入到I L三角瓶中，加入蒸餾水定容到I L，溶解，調(diào)pH值到7.0，用封口膜封口，之后采用121°C高壓濕熱滅菌20分鐘，冷卻后放在4°C冰箱中，備用；
2.LB固體培養(yǎng)基的配制:分別稱量10 g NaClUO g蛋白胨、5 g酵母浸膏和15 g瓊脂放入到I L三角瓶中，加入蒸餾水定容到I L，溶解，調(diào)pH值到7.0，用封口膜封口，之后采用121°C高壓濕熱滅菌20分鐘，倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷卻后放在4 °C冰箱中，備用；
3.MS培養(yǎng)基的配制:(I) MS培養(yǎng)基母液的配制I)大量元素母液的配制:
①KNO3母液的配制:稱取190g KNO3放入到1000 ml的燒杯中，用800 ml蒸餾水使之完全溶解，加蒸餾水定容至1000 ml，轉(zhuǎn)移至廣口瓶中，室溫保存；較使用濃度該母液濃縮倍數(shù)為100倍。②NH4NO3母液的配制:稱取330g NH4NO3放入到1000 ml的燒杯中，用800 ml蒸
餾水使之完全溶解，加蒸餾水定容至1000 ml，轉(zhuǎn)移至廣口瓶中，室溫保存；較使用濃度該母液濃縮倍數(shù)為200倍。③MgS04.7H20母液的配制:稱取74g MgS04.7H20放入到1000 ml的燒杯中，
用800 ml蒸餾水使之完全溶解，加蒸餾水定容至1000 ml，轉(zhuǎn)移至廣口瓶中，室溫保存；較使用濃度該母液濃縮倍數(shù)為200倍。④KH2PO4母液的配制:稱取34g KH2PO4放入到1000 ml的燒杯中，用800 ml蒸
餾水使之完全溶解，加蒸餾水定容至1000 ml ,轉(zhuǎn)移至廣口瓶中，室溫保存；較使用濃度該母液濃縮倍數(shù)為200倍。⑤CaCl2.2H20母液的配制:稱取88g CaCl2.2H20放入到1000 ml的燒杯中，
用800 ml蒸餾水使之完全溶解，加蒸餾水定容至1000 ml，轉(zhuǎn)移至廣口瓶中，室溫保存；較使用濃度該母液濃縮倍數(shù)為200倍。

2)微量元素母液的配制:分別稱取6.2 g H3BO3,16.9 g MnSO4.H20,8.6 gZnSO4.7Η20，0.83 g KCl,0.25 g Na2MoO4.2H20，0.025 g CuSO4.5H20，0.025 g CoCl2.6Η20放入到1000 ml的燒杯中，用800 ml蒸餾水使之完全溶解，加蒸餾水定容至1000 ml，轉(zhuǎn)
移至廣口瓶中，室溫保存；較使用濃度該母液濃縮倍數(shù)為1000倍。3)鐵鹽母液的配制:分別稱取18.65 g Na2-EDTA和13.9 g FeSO4.7H20，分別放入2個(gè)500 ml燒杯中，分別加入200 ml蒸餾水，加熱并不斷攪拌，使之完全溶解；冷卻，將2種溶液混合，調(diào)pH至5.5，加蒸餾水定容至500 ml，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，在4°C冰箱中保存；較使用濃度該母液濃度濃縮倍數(shù)為500倍。4) B5有機(jī)母液的配制:分別稱取10 g肌醇，0.05 g煙酸，0.05 g鹽酸吡哆醇、0.05 g鹽酸硫胺素和0.2 g甘氨酸,放入到500 ml的燒杯中，用300 mL蒸懼水使之完全溶解，加蒸餾水定容至500 ml，高壓滅菌，轉(zhuǎn)移至無菌棕色瓶中，在4°C冰箱中保存；較使用濃度該母液濃度濃縮倍數(shù)為200倍。(2) MS培養(yǎng)基的配制:分別吸取上述MS培養(yǎng)基母液:10 ml KN03、5 ml NH4NO3>5ml MgS04.7H20、5 ml KH2PO4,5 ml CaCl2.2Η20、1 ml 微量元素、2 ml 鐵鹽、5 ml B5 有機(jī)，加入到盛有800 ml蒸餾水的1000 ml三角瓶中，加入30 g蔗糖，加入蒸餾水定容到I L，充分溶解，調(diào)pH值到5.80-5.83，用封口膜封口，然后采用121°C高壓濕熱滅菌20分鐘；
4.共培養(yǎng)培養(yǎng)基的配制:分別吸取上述MS培養(yǎng)基母液:10 ml KN03、5 ml NH4NO3>5 mlMgS04.7H20、5 ml KH2PO4,5 ml CaCl2.2H20、1 ml 微量元素、2 ml 鐵鹽、5 ml B5 有機(jī)，力口入到盛有800 ml蒸餾水的1000 ml三角瓶中，加入30 g蔗糖、7 g瓊脂，加入蒸餾水定容到I L，充分溶解，調(diào)pH值到5.80-5.82，用封口膜封口，然后采用121°C高壓濕熱滅菌20分鐘；
二、玉米種子整體侵染轉(zhuǎn)化法1、測成熟玉米種子的生理吸脹曲線:植物材料為玉米種子，取12份等量的成熟玉米種子，每份4.5-5 g，每隔3小時(shí)取I份浸泡到水中，分別浸泡0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30,33小時(shí)，記錄玉米種子不發(fā)生損傷的吸脹停滯點(diǎn)為18-24小時(shí)；
2、發(fā)根農(nóng)桿菌的培養(yǎng):挑選發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株于LB固體培養(yǎng)基平板上接種活化2次，之后挑取該菌株的單菌落接種到5 ml含有20 Ug.πιΓ1利福平和50 Ug.πιΓ1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度26°C、振蕩轉(zhuǎn)速160-200 rpm的條件下，培養(yǎng)5_8小時(shí)，然后取I ml轉(zhuǎn)接于40 ml含有20 Ug.ml 1利福平、50 Ug.ml 1卡那霉素和200 umol.L 1乙酰丁香酮的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度26°C、振蕩轉(zhuǎn)速160-200 rpm的條件下，培養(yǎng)12-16小時(shí)后，用含20 Ug.πιΓ1利福平、50 Ug.πιΓ1卡那霉素和200 umol.L—1乙酰丁香酮的LB液體培養(yǎng)基稀釋上述菌液至0D_=0.2-0.5備用；
3、玉米種子滅菌:挑選飽滿的玉米種子，用Cl2(NaClO:濃HCl=25ml:1ml)滅菌4.5小時(shí)，然后用無菌水洗滌5-6次，準(zhǔn)備侵染用；
4、侵染:結(jié)合玉米種子的生理吸脹曲線，將經(jīng)消毒滅菌的玉米種子轉(zhuǎn)入到OD6tltl值為
0.2- 0.5左右的發(fā)根農(nóng)桿菌的菌液中，農(nóng)桿菌菌液量以剛浸沒玉米種子為準(zhǔn)，用封口膜封住瓶口，置于搖床中，于溫度2 6°C、振蕩轉(zhuǎn)速166 rpm條件下，培養(yǎng)18-21小時(shí)；
5、共培養(yǎng):浸泡侵染18-21小時(shí)后,從搖床中取出小瓶置于超凈工作臺內(nèi)，倒掉菌液，加入無菌水沖洗3次后，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25°C黑暗條件下，共培養(yǎng)3天；
6、移栽侵染植株到花盆中:共培養(yǎng)3天后，取苗長達(dá)到1-2 cm的種子，用鑷子夾出，用含頭孢霉素濃度為150mg *L_1的溶液浸泡1-2分鐘后,移栽到花土中,移栽之后第1_2周內(nèi)用含頭孢霉素濃度為lSOmg.!/1的溶液澆水，保持土壤濕度80%左右，且置于有一定光照的陰涼處，不可被陽光直射，2周后，栽入花盆中，于溫室培養(yǎng)；
7、轉(zhuǎn)基因植株分子檢測:從轉(zhuǎn)化植株葉片中提取其基因組DNA，并以其為模板，以5’ -GATATATGCCAAAITTACACTAG-3’ 和 5’ -GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3’ 為引物，擴(kuò)增轉(zhuǎn)化植株中的rolC基因。PCR反應(yīng)條件為:94°C變性45 sec，45°C復(fù)性30 sec，72°C延伸45 sec,共計(jì)30個(gè)循環(huán)，最后再72°C延伸10 min。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR檢測情況如圖1所示。其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I為陰性對照玉米原種的PCR擴(kuò)增結(jié)果，1-7為樣品轉(zhuǎn)化玉米的PCR擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果表明獲得了 500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。對玉米的Tl代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Southern blot檢測，以rolC基因全長序列為探針。玉米Tl代轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot檢測情況如圖2所示。其中CK為未轉(zhuǎn)基因的玉米的Southern blot檢測情況，1-7為玉米Tl代轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot檢測情況。
權(quán)利要求
1.一種玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于:該方法采用玉米種子整體侵染的方法實(shí)現(xiàn)，步驟包括:①測成熟玉米種子的生理吸脹曲線，②目標(biāo)發(fā)根農(nóng)桿菌的培養(yǎng)，③玉米種子滅菌，④結(jié)合玉米種子的生理吸脹曲線，將經(jīng)消毒滅菌的玉米種子轉(zhuǎn)入到0D_值為0.2-0.5發(fā)根農(nóng)桿菌的菌液中振蕩侵染18-21小時(shí)，⑤在25°C黑暗條件下共培養(yǎng)3天，⑥移栽侵染植株，⑦轉(zhuǎn)基因植株分子檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于:步驟①所述測成熟玉米種子的生理吸脹曲線的方法是:取12份等量的成熟玉米種子，每隔3小時(shí)取I份浸泡到水中，分別浸泡0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33小時(shí)，記錄玉米種子不發(fā)生損傷的吸脹停滯點(diǎn)為18-24小時(shí)；步驟②所述目標(biāo)發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)的方法是:將發(fā)根農(nóng)桿菌在LB固體培養(yǎng)基平板上接種活化二次，之后挑取單菌落接種到5 ml含有20 Ug.πιΓ1利福平和50 Ug.πιΓ1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度26°C、振蕩轉(zhuǎn)速160-200 rpm的條件下，培養(yǎng)5_8小時(shí)，然后取I ml轉(zhuǎn)接于40 ml含有20 Ug.ml 1利福平、50 Ug.ml 1卡那霉素和200 umol.L 1乙酰丁香酮的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度26°C、振蕩轉(zhuǎn)速160-200 rpm的條件下，培養(yǎng)12-16小時(shí)后；用含20 Ug ι Γ1利福平、50 Ug ι Γ1卡那霉素和200 umol *L_1乙酰丁香酮的LB液體培養(yǎng)基稀釋上述菌液至0D_=0.2-0.5備用；步驟④所述結(jié)合玉米種子的生理吸脹曲線，侵染玉米種子18-21小時(shí)的方法是:結(jié)合玉米種子的生理吸脹曲線，將經(jīng)消毒滅菌的成熟玉米種子轉(zhuǎn)入到裝有步驟②制備好的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的無菌器皿中，農(nóng)桿菌菌液量以剛浸沒玉米種子為準(zhǔn)，用封口膜封住瓶口，置于搖床中，在溫度26°C、振蕩轉(zhuǎn)速166 rpm條件下，培養(yǎng)18-21小時(shí)；步驟⑤所述的共培養(yǎng)的方法是:待步驟④侵染18-21小時(shí)后，倒掉菌液，加入無菌水沖洗3遍后，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25°C黑暗條件下，共培養(yǎng)3天；步驟⑥所述移栽侵染植株的方法是:當(dāng)步驟⑤獲得的種子萌發(fā)的苗長達(dá)到1-2 cm時(shí)，用鑷子將種子夾出，用含150 mg.Γ1頭孢霉素的溶液浸泡1-2分鐘后，移栽到花土中，移栽之后第1-2周內(nèi)用含150 mg.L—1頭孢霉素的溶液燒水,保持土壤濕度80%左右,且置于有一定光照的陰涼處，不可被陽光直射,2周后,栽入大花盆中,在溫室中培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于:所述方法各步中采用的培養(yǎng)基及其配方是:LB培養(yǎng)基是由IOg.Γ1 NaCl，IOg.Γ1蛋白胨，5g.Γ1酵母浸膏和5g.Γ1瓊脂組成的，pH值7.0 ;共培養(yǎng)培養(yǎng)基是指=MS加7 g.Γ1瓊脂，pH值5.80-5.82 ；所述 MS 培養(yǎng)基的組成為:ΚΝ03 1 900 mg. Λ NH4NO3 1650 mg. Λ CaCl2.2H20 440mg.ΙΛ MgSO4.7H20 370 mg. Λ KH2PO4 170 mg.Γ1，H3BO3 6.2 mg. Λ MnSO4.H2O16.9mg.ΙΛ ZnSO4.7H20 8.6 mg. Λ KCl 0.83 mg. Λ Na2MoO4.2H20 0.25 mg. ΛCuSO4.5H20 0.025 mg. Λ CoCl2.6H20 0.025 mg. Λ Na2EDTA 37.3 mg. Λ FeSO4.7H2027.8 mg.171,肌醇20 g.L-1,煙酸100 mg.I71,鹽酸批卩多醇100 mg.171,鹽酸硫胺素100mg.I71，甘氨酸 400 mg.L-1,鹿糖 30 g.L-1, pH 值 5.80-5.83。
4.如權(quán)利要求2所述的一種玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于:步驟②所述發(fā)根農(nóng)桿菌菌株是發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株 。
5.如權(quán)利要求2所述的一種玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于:步驟②制備好的用于侵染的農(nóng)桿菌菌液濃度0D600為0.3。
6.如權(quán)利要求2所述的一種玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于:步驟④所述的玉米種子吸脹的時(shí)間段為0-18/24小時(shí)，農(nóng)桿菌浸泡侵染玉米種子時(shí)間為18-21小時(shí)。
7.如權(quán)利要求2所述的一種玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于:步驟⑥所述頭孢霉素的濃度為150 mg.L-1.
全文摘要
本發(fā)明涉及遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法。公開了一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米種子遺傳轉(zhuǎn)化方法，即玉米種子整體侵染法。該方法包括測玉米種子的生理吸脹曲線、目標(biāo)發(fā)根農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、結(jié)合玉米種子生理吸脹曲線將經(jīng)消毒滅菌的種子轉(zhuǎn)入到發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中侵染18-21小時(shí)、再經(jīng)過共培養(yǎng)、移栽侵染植株和轉(zhuǎn)基因植株分子檢測等步驟。本發(fā)明采用玉米種子整體侵染的方法，使玉米種子在吸脹過程中易將菌液吸進(jìn)，大大提高了轉(zhuǎn)化效率，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期縮短2-3個(gè)月，提高了移栽成活率。克服了現(xiàn)有玉米遺傳轉(zhuǎn)化效率低，實(shí)驗(yàn)周期長，操作過程繁瑣，實(shí)驗(yàn)工作量大的不足，對玉米基因工程的理論研究及遺傳育種實(shí)踐均具有實(shí)際意義。
文檔編號C12N15/82GK103074365SQ20121011218
公開日2013年5月1日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者周曉馥, 徐洪偉, 徐民澤 申請人:吉林師范大學(xué)