專利名稱：一種食甲醇芽孢桿菌及其煙用咖啡浸膏的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及煙用香料技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種食甲醇芽孢桿菌及其煙用咖啡浸膏的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在煙草制品中，煙草的香氣和吸味至關(guān)重要，加香加料是卷煙工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是完善產(chǎn)品風(fēng)格和提高卷煙香氣質(zhì)量的有效手段之一。目前煙用香料有化學(xué)合成香料和天然香料之分，均存在著各自的局限性。近年來，天然植物香料，因其天然無害，原料易得等原因，成為研發(fā)重點和熱點。植物提取香料的開發(fā)由于可用植物資源的有限而存在局限性，將微生物發(fā)酵工程應(yīng)用于香精香料的生物合成中，以天然植物資源為原料，利用微生物可以生產(chǎn)各種天然香料，是一種很好的解決途徑。 咖啡豆分水洗式和干燥式，平豆和圓豆?？Х榷诡伾猩钣袦\，通過堆積發(fā)酵和深度烘焙，咖啡豆爆開，體積膨脹一倍，而重量減少近1/4?？Х榷乖诤姹哼^程中逐漸生成揮發(fā)性風(fēng)味油，使各種風(fēng)味達(dá)到完美的平衡。咖啡豆即使是在同一生產(chǎn)國中也會因為各地區(qū)的氣候、海拔、土質(zhì)的不同，而微妙的影響及咖啡豆的風(fēng)味及品質(zhì)，以及產(chǎn)生各自的特征來。未經(jīng)發(fā)酵的咖啡其風(fēng)味及香氣低劣。微生物在增殖過程中可產(chǎn)生龐大的高活性酶系，如多糖水解酶類、蛋白酶類、酯化酶類、氧化還原酶類及裂合酶類等，在酶促作用、化學(xué)作用及微生物體內(nèi)復(fù)雜代謝的協(xié)同作用下，以咖啡為原料發(fā)生分解、降解、氧化、還原、聚合、偶聯(lián)、轉(zhuǎn)化等作用，形成復(fù)雜的低分子化合物，其中包括各種香味化合物，如醇類、醛類、酮類、酸類、脂類、酚類、吡喃類、吡啶類和萜烯類等，這些香氣物質(zhì)無疑也是煙草或用于煙草的添加劑的香氣組分。目前國內(nèi)已經(jīng)開始研究并利用生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化煙用浸膏，如CN101497844A報道一種采用微生物發(fā)酵咖啡制備煙用香料的方法，該方法有降低刺激，豐富和飽滿煙氣，掩蓋雜氣，使煙氣柔和以及改善口感的作用，但是該方法利用的優(yōu)勢菌，該優(yōu)勢菌種類繁多，工業(yè)生產(chǎn)過程中生產(chǎn)條件難以控制，不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前不足，本發(fā)明提供了一種食甲醇芽孢桿菌，該菌株名為Bacillusmethylotrophicus VJ4-1，于2012年I月11日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO M 2012004，其生物學(xué)特征是是革蘭氏陽性菌，能在10%NaCl中生長，有精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶活性，能產(chǎn)酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水楊素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麥芽糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、DL-乳酸鹽、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸組氨酸、檸檬酸鹽為碳源的培養(yǎng)基上生長，其16S rRNA序列與 Bacillus methylotrophicus 的 16S rRNA 序列比對相似性達(dá)到 100%。本發(fā)明提供一種利用食甲醇芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化煙用咖啡浸膏的制備方法，包括以下步驟
I)將咖啡豆粉碎至10 200目，與水按質(zhì)量比I : 20 40回流提取I 3小時后過濾，將濾液滅菌；2)斜面培養(yǎng)將食甲醇芽孢桿菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25 35°C、pH5 10條件下，靜置培養(yǎng)24 72小時后置于冰箱中；3)制備種子培養(yǎng)液用上述步驟2)中所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在25 35°C，轉(zhuǎn)速100 150rpm條件下振蕩培養(yǎng)12 36h，連續(xù)轉(zhuǎn)接I 4次后制得種子培養(yǎng)液；
4)發(fā)酵將種子培養(yǎng)液按體積比5 20%接種到上述步驟I)中的咖啡濾液中形成發(fā)酵液，上述發(fā)酵液的裝罐量為20 40%，在pH4 10，溫度25 40°C，轉(zhuǎn)速100 200rpm,不避光條件下發(fā)酵7 14天；5)將步驟4)中所得的發(fā)酵液和95%乙醇按體積比I : 3 4，沉淀過夜后抽濾，將濾液減壓濃縮除去溶劑，制得相對密度為I. 20 I. 36的煙用咖啡浸膏。優(yōu)選地，所述斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L。優(yōu)選地，所述種子液培養(yǎng)基組成為麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L。本發(fā)明提供了一種所得煙用咖啡浸膏的應(yīng)用，其特征在于所述煙用咖啡浸膏加入卷煙中，用于協(xié)調(diào)煙氣、增加淡甜香、果香、使煙氣細(xì)膩柔和感、降低刺激、減少雜氣、改善吸味，加入卷煙中煙用咖啡浸膏的質(zhì)量比為0. 05 0. 15%。采用GC/MS對利用食甲醇芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化煙用咖啡浸膏與未利用食甲醇芽孢桿菌經(jīng)歷相同發(fā)酵步驟的咖啡提取液相同條件下濃縮制成的浸膏(以下簡稱咖啡提取物浸膏)進(jìn)行揮發(fā)性致香成分進(jìn)行對比。(I)同時蒸餾萃取將5g煙用咖啡浸膏裝入圓底燒瓶中，加入400mL水，用電熱套加熱至沸騰，另一側(cè)的圓底燒瓶中加入200mL的二氯甲烷，60°C水浴沸騰，待中間分液管處液面出現(xiàn)分層后計時萃取2h。萃取結(jié)束后，向二氯甲烷萃取液中加入無水硫酸鈉，過夜，過濾并濃縮至lmL，濃縮液用于進(jìn)行GC/MS分析。(2)GC/MS 分析HP-5MS(50mX0. 25mmX0. 25 u m)毛細(xì)管柱；進(jìn)樣溫度250°C ;分流比 20 : I ;載氣He, lmL/min ;升溫程序:從 50°C (Imin)以 5°C /min 升到 250°C (5min)；傳輸線溫度250°C ;離子源EI源；電子能量70eV ;掃描范圍50 550amu ;使用WILEY和MINILAB譜庫進(jìn)行檢索。(3)揮發(fā)性成分對比分析通過GC/MS對本發(fā)明的煙用咖啡浸膏進(jìn)行香氣成分分析，從表I中可以看出，一共鑒定出36種香氣成分,其中酮類6種，烯類6種，酯類5種，以及呋喃、烷烴、酸類、醇類、酚類等19種香氣物質(zhì)。對比咖啡提取物浸膏，煙用咖啡浸膏的香氣成分發(fā)生了很大變化，新增加了 16種香氣物質(zhì)，消失了 9種，只是相對百分含量發(fā)生變化的有18種。煙用咖啡浸膏的香氣物質(zhì)包括3-甲基丁酸，能夠緩和辛辣煙氣，掩蓋雜氣；己酸、2-甲基己酸，低碳鏈的有機(jī)酸，對卷煙的煙氣有利，可降低煙氣中的堿性，減少刺激性使煙氣醇和；雙丙酮醇，有愉快香氣；2_甲基戊酸甲酯，具有甜的青香和果香，有漿果、菠蘿蜜、蘋果、香蕉、甜瓜、熱帶水果香氣；乙酸庚酯，有玫瑰香梨的香氣。有甜杏仁味，稍帶花香；棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、琥珀酸乙基甲基酯等高級脂肪酸酯類能提檔煙香使其淡甜柔和；2_糠醇、呋喃類等在卷煙中提調(diào)煙香，增加甜醇吸味；青葉醛，具強(qiáng)烈的青、果香，尖刺的蔬菜樣香氣，稀釋至0. I %有新鮮的青香；苯甲醇具有微弱芳香，苯乙醇具有新鮮面包香、清甜的玫瑰樣花香；對乙烯基愈創(chuàng)木酚具有強(qiáng)烈香辛料、丁香和發(fā)酵似香氣,有炒花生氣息；等36種香氣成分。經(jīng)過卷煙加香評吸試驗表明，所有這些香氣糅合在一起賦予煙氣協(xié)調(diào)、淡甜香、果香、使煙氣細(xì)膩柔和感、降低刺激、減少雜氣、改善吸味。微生物在增殖過程中可產(chǎn)生龐大的高活性酶系，如多糖水解酶類、蛋白酶類、酯化酶類、氧化還原酶類及裂合酶類等 ，在酶促作用、化學(xué)作用及微生物體內(nèi)復(fù)雜代謝的協(xié)同作用下，以咖啡為原料發(fā)生分解、降解、氧化、還原、聚合、偶聯(lián)、轉(zhuǎn)化等作用，形成復(fù)雜的低分子化合物，其中包括各種香味化合物，如醇類、醛類、酮類、酸類、脂類、酚類、吡喃類等，這些香氣物質(zhì)無疑也是煙草或用于煙草的添加劑的香氣組分。表I.煙用咖啡浸膏與對照-咖啡提取物浸膏的揮發(fā)性香氣成分
權(quán)利要求
1.一種食甲醇芽孢桿菌，該菌株名為Bacillus methylotrophicus VJ4-1,保藏編號CCTCC NO M 2012004，食甲醇芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus CCTCC NO M 2012004的生物學(xué)特征是是革蘭氏陽性菌，能在10% NaCl中生長，有精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶活性，能產(chǎn)酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水楊素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麥芽糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、DL-乳酸鹽、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸組氨酸、朽1檬酸鹽為碳源的培養(yǎng)基上生長，其16S成應(yīng)序列與1^0；[11118 methylotrophicus的16S rRNA序列比對相似性達(dá)到100%。
2.一種利用食甲醇芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化煙用咖啡浸膏的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將咖啡豆粉碎至10 200目，與水按質(zhì)量比I: 20 40回流提取I 3小時后過濾，將濾液滅菌； 2)斜面培養(yǎng)將食甲醇芽孢桿菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25 35 0C、pH5 10條件下，靜置培養(yǎng)24 72小時； 3)制備種子培養(yǎng)液用上述步驟2)中所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在25 350C，轉(zhuǎn)速100 150rpm條件下振蕩培養(yǎng)12 36h，連續(xù)轉(zhuǎn)接I 4次后制得種子培養(yǎng)液； 4)發(fā)酵將種子培養(yǎng)液按體積比5 20%接種到上述步驟I)中的咖啡濾液中形成發(fā)酵液，上述發(fā)酵液的裝罐量為20 40%，在pH4 10，溫度25 40°C，轉(zhuǎn)速100 200rpm，不避光條件下發(fā)酵7 14天； 5)將步驟4)中所得的發(fā)酵液和95%乙醇按體積比I: 3 4，沉淀過夜后抽濾，將濾液減壓濃縮除去溶劑，制得相對密度為I. 20 I. 36的煙用咖啡浸膏。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用食甲醇芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化煙用咖啡浸膏的制備方法，其特征在于，所述斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用食甲醇芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化煙用咖啡浸膏的制備方法，其特征在于，所述種子液培養(yǎng)基組成為麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求2所得煙用咖啡浸膏的應(yīng)用，其特征在于所述煙用咖啡浸膏加入 卷煙中，用于協(xié)調(diào)煙氣、增加淡甜香、果香、使煙氣細(xì)膩柔和、降低刺激、減少雜氣、改善吸味，加入卷煙中煙用咖啡浸膏的質(zhì)量比為0. 05 0. 15%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種食甲醇芽孢桿菌，該菌株名為Bacillus methylotrophicus VJ4-1，保藏編號CCTCC NOM 2012004。本發(fā)明提供利用微生物食甲醇芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化煙用升麻浸膏以及煙用咖啡浸膏在煙草中的應(yīng)用。本發(fā)明咖啡經(jīng)微生物菌株發(fā)酵能生產(chǎn)天然煙用香料-煙用咖啡浸膏，方法工藝簡單，原料來源廣泛，生產(chǎn)過程環(huán)保無害，有工業(yè)化使用前景；所得天然香料浸膏能直接用于卷煙的加香，具有能與煙氣協(xié)調(diào)、增加淡甜香、果香、增加了煙氣細(xì)膩柔和感、降低刺激、減少雜氣、改善吸味的優(yōu)點，能與其它煙用香精香料混合調(diào)配使用。
文檔編號C12R1/07GK102628026SQ201210114008
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者宋旭艷, 李冉, 潘曦, 羅誠浩, 魏敏 申請人:湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司