專利名稱:一種基因在培育抗百草枯轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種具有百草枯抗性的轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白及其編碼基因在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
百草枯(paraquat,1,I’- 二甲基-4,4,-聯(lián)批唳二氯化物,methyl viologen)在農(nóng)業(yè)中廣泛應(yīng)用已近50年,作為非選擇性除草劑 應(yīng)用在世界范圍內(nèi)超過100個國家,受到廣泛接受與歡迎。90年代以來,隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求,我國若干農(nóng)藥企業(yè)先后開始規(guī)模生產(chǎn)百草枯原藥,并不斷的改進(jìn)生產(chǎn)工藝,產(chǎn)品在各地推廣應(yīng)用,在生產(chǎn)中發(fā)揮了一定的作用。百草枯是繼草甘磷之后的第二大除草劑,是一種速效觸殺型除草劑,兼有一定內(nèi)吸作用,主要用于果園、桑園、茶園、林帶等作物的雜草,估計將來的應(yīng)用呈上升、遞增趨勢。百草枯是典型的光合系統(tǒng)I抑制劑,其活性的發(fā)揮決定于光,植物對其吸收非常迅速,因而噴藥后短期內(nèi)降雨不影響藥效的發(fā)揮;吸收的藥劑通過木質(zhì)部中的逆向流進(jìn)行傳導(dǎo),在適宜條件下,大量藥劑被葉片吸收并向其他部位傳導(dǎo),此種傳導(dǎo)僅僅是非原質(zhì)體(木質(zhì)部)傳導(dǎo),因而葉面處理的百草枯通常停滯于被處理的葉片內(nèi)。毒理學(xué)機(jī)理研究表明,百草枯的生物毒性與致突變性的原因是,雙氧化合物存在時,百草枯被還原并重新被氧化,在此循環(huán)反應(yīng)過程中產(chǎn)生負(fù)自由基02_并在活細(xì)胞體內(nèi)積累。Baldwin等人的研究結(jié)果表明,進(jìn)入大腸桿菌中的百草枯,被胞質(zhì)中的NADPH—依耐性硫辛酰胺脫氫酶還原成單價正自由基PQ+,隨后與氧作用產(chǎn)生負(fù)自由基O2- (k2=7. 7xl08M-ls-l),Farrington等人的研究結(jié)果也證實(shí)這條途徑。Ju-Fang Ma等人從一株銅綠假單胞菌中克隆到6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因zwf,該基因?qū)Π俨菘莓a(chǎn)生的負(fù)自由基02_具有有效的脫毒作用。Su Mei Kao等人通過對一株具百草枯抗性的大腸桿菌突變株的研究,初步探討了該除草劑在微生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化規(guī)律。百草枯4,4’ -位陽離子的存在使得它具有很強(qiáng)的還原性,是強(qiáng)氧化劑,強(qiáng)氧化劑的不穩(wěn)定性又使它的研究受到了一定的限制,在原核生物中研究較多,但在真核生物尤其是植物中很少。隨著該試劑的使用,具有抗性的植株出現(xiàn)。12-15年后發(fā)現(xiàn)了第一例抗性雜草(Powles and Cornic, 1987)。據(jù)多年數(shù)據(jù)顯示,生物對抗百草枯可能與其體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)體有關(guān)。轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白廣泛存在于原核生物和真核生物中,其中一些是有害物質(zhì)的外排泵,在生物體排出環(huán)境中或自身代謝產(chǎn)生的有毒物質(zhì)過程中起到重要作用。研究表明,原核生物的轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白PrqA、PotE、EmrE能轉(zhuǎn)運(yùn)、隔離并除去PQ等毒性分子,以降低作用于祀標(biāo)的藥物濃度從而達(dá)到解毒的作用。轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白在植物中的轉(zhuǎn)化研究與應(yīng)用情況的研究主要停留在實(shí)驗(yàn)室階段,Jinki Jo等人將無色桿菌中的pqrA基因轉(zhuǎn)進(jìn)煙草中,并得到了很好的表達(dá),對比于野生株轉(zhuǎn)基因煙草具有對百草枯較高的抗性,而且煙葉中的殘留量也相當(dāng)少。與抗草甘磷的轉(zhuǎn)基因植物相比,至今抗百草枯轉(zhuǎn)基因植物的商品化產(chǎn)品不多。前面提到的Jinki Jo等人研究的pqrA基因轉(zhuǎn)煙草植株在和野生型煙草相比,野生型生長在半固體培養(yǎng)基中當(dāng)百草枯為I μ M濃度時即出現(xiàn)枯萎,百草枯達(dá)20 μ M濃度時植株即死亡,而轉(zhuǎn)基因煙草仍然是正常生長。在百草枯濃度20 μ M和50 μ M的情況下,在野生型煙草的葉片中葉綠素含量損失約80%,而轉(zhuǎn)基因煙草的葉片中葉綠素含量損失不超過15%。目前關(guān)于百草枯抗性基因在植物中的轉(zhuǎn)化研究與應(yīng)用情況的研究主要停留在實(shí)驗(yàn)室階段,與抗草甘磷的轉(zhuǎn)基因植物相比,抗百草枯轉(zhuǎn)基因植物的商品還未出現(xiàn)。所以,進(jìn)行百草枯抗性基因研究及其轉(zhuǎn)化植物體系的建立是十分必要的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供新的使植物具有農(nóng)藥百草枯抗性的蛋白質(zhì)。另夕卜,本發(fā)明還提供了編碼這些蛋白質(zhì)的核酸以及基因工程中間體(如,表達(dá)盒、載體和細(xì)胞等),獲得具有含百草枯成分農(nóng)藥抗性的植物和微生物的方法和應(yīng)用,并且提供了判斷植物和微生物是否采用本發(fā)明方法獲得的鑒定方法。本發(fā)明所提供的對農(nóng)藥百草枯具有高抗性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,名稱為PQR6 (paraquat·resistant 6)和 PQR7 (paraquat resistant 7),分別來源于人蒼白桿菌應(yīng)anthropi )KT-q077 和人蒼白桿菌 iOchrobacterium anthropi )B6_1,其中 KT_q077 于 2008年12月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCCNo. 2787,保藏單位的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所;另外一株B6-1于2011年06月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC No. 4941,保藏單位的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。PQR6是具有下述氣基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)
1)序列表中的SEQID NO 1 ;
2)將序列表中SEQID NO :I的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與百草枯抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)。上述抗百草枯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的CDNA基因,可具有下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQID NO 3的DNA序列;
2)編碼序列表中SEQID NO 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸;
3)與序列表中SEQID NO :3的DNA序列具有90%以上同源性,且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列;
4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID NO 3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在O. IXSSPE (或O. 1XSSC),0. 1% SDS的溶液中,在65°C下雜交并洗膜。PQR7是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)
1)序列表中的SEQID NO 2 ;
2)將序列表中SEQID NO :2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與百草枯抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)。上述抗百草枯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cDNA基因,可具有下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQID NO 4的DNA序列;
2)編碼序列表中SEQID NO 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸;
3)與序列表中SEQID NO :4的DNA序列具有90%以上同源性,且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列;4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO 4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在O. IXSSPE (或O. 1XSSC),0. 1% SDS的溶液中,在65°C下雜交并洗膜。PQR6和PQR7的蛋白序列一致性達(dá)99. 6%,核苷酸序列一致性達(dá)98. 99%,可以判定
二者為同一基因。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的抗百草枯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中可增強(qiáng)宿主菌對百草枯有效成分甲基紫精(methyl viololgemMV)的耐受性。該基因轉(zhuǎn)入植 物擬南芥和水稻中,可增強(qiáng)擬南芥和水稻對MV的耐受性。
表I為從無色桿菌an thropi ) KT-q077擴(kuò)增獲得的百草枯抗性基因PRQ6基因的氨基酸序列。表2為從無色桿菌iOchrobactrum an thropi ) B6_l擴(kuò)增獲得的百草枯抗性基因PQR7基因的氨基酸序列。表3為從無色桿菌iOchrobactrum an thropi ) KT_q077擴(kuò)增獲得的百草枯抗性基因pqr6基因的核苷酸序列。表4為從無色桿菌iOchrobactrum an thropi ) B6_l擴(kuò)增獲得的百草枯抗性基因pqr7基因的核苷酸序列。圖I A為將/7識右基因插入到原核表達(dá)載體pET30a ( + )獲得的pET30a_ pqr6載體構(gòu)建示意圖;B為將基因插入到原核表達(dá)載體pET30a ( + )獲得的pET30a_載體構(gòu)建示意圖。圖2 A %、\%Pqr6基因插入到植物表達(dá)載體pXQ35S獲得的pXQ35S_ pqr6載體構(gòu)建示意圖為將基因分別插入到植物表達(dá)載體pXQ35S獲得的pXQ35S_ 載體構(gòu)
建示意圖。圖3為在含有不同濃度MV的培養(yǎng)液中,分別帶有pET30a空載體(A)、pET30a_pqr6 (B)和pET30a_ pqr7 (C)質(zhì)粒的Ecoli. BL21菌株,生長過夜的照片。圖4 為分別帶有pET30a空載體、pET30a_ /7識右、pET30a_ 質(zhì)粒的Ecoli. BL21菌株,在不同濃度MV的培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜后,0D600檢測結(jié)果統(tǒng)計圖表。圖5為轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代噴灑百草枯實(shí)驗(yàn):A為Pqr6基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥,B為/7^7基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥。圖6為轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代噴灑百草枯實(shí)驗(yàn):Α為負(fù)對照,B為Pqr6基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥,C為基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥。圖7為轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代噴灑百草枯實(shí)驗(yàn):Α為負(fù)對照,B為Pqr6基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥,C為基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥。圖8為PCR檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代電泳圖,1-8是以轉(zhuǎn)基因的擬南芥DNA為模板,9-16是以轉(zhuǎn)基因的擬南芥DNA為模板,CKl是以攜帶基因的質(zhì)粒為模板作為正對照,CK2是以攜帶基因的質(zhì)粒為模板作為正對照,CK3是以水為模板的作為負(fù)對照,CK4是以非轉(zhuǎn)基因擬南芥的DNA為模板作為負(fù)對照。
圖9為百草枯處理轉(zhuǎn)基因水稻Ttl代葉片照片,CK-為負(fù)對照。圖10為百草枯處理轉(zhuǎn)基因水稻T1代植株葉片照片,WT為非轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片照片。圖11為PCR檢測轉(zhuǎn)基因水稻Ttl代電泳圖,-為負(fù)對照。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明,均為常規(guī)方法。一、百草枯抗性相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的獲得實(shí)施例I、百草枯抗性相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的獲得 I、研究表明,轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白能夠?qū)俨菘蒉D(zhuǎn)運(yùn)至其作用位點(diǎn)以外是生物具有百草枯抗性的機(jī)制。經(jīng)鑒定,我們實(shí)驗(yàn)室分離到的幾株具有抗性的菌株(KT-q077、B6-1)為無色桿菌(Ochrobac trum anthropi、。通過檢索 NCBI 今 Ochrobactrum an thropi ATCC 49188 基因組,選擇10個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因作為目標(biāo)基因。2、其中根據(jù) locus_tag 0ant_1883, (GenBank: CP000758. I)設(shè)計引物DRT2_F 5' -CCAATGTTGCCGAAAAATC-3' 和 DRT2-R TTATGCGGCAATAGTCTTACG 分別以菌株 KT_q077 和B6-1為模板,用PCR方法(Transgen公司)分別擴(kuò)增出和的DNA基因片段;其中,擴(kuò)增體系為IOX pfu buffer(含有 Mg2+) 5 ul, IOmM dNTPs lul, IOuM 引物 DRT2-Flul, IOuM 引物 DRT2-R Iul,菌株 KT_q077 和 B6-1 基因組 DNA lul, pfu DNA 聚合酶lul,加水至50ul。擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性5分鐘;95°C 30秒,58。。30秒,72。。I分鐘30秒,35個循環(huán);72°C延伸7分鐘。擴(kuò)增均得到1488bp片段,將其連接到載體(Transgen公司)得到重組載體,經(jīng)測序表明該擴(kuò)增片段具有序列表中序列2和4的核苷酸序列,與 Ochrobactrum anthropi ATCC 49188 的 0ant_1883,氨基酸序列一致性達(dá) 99%。該擴(kuò)增片段即為PQR6和PQR7的DNA基因。將該重組載體分別命名為/ / /形-/7和pPQR7_Tl。實(shí)施例2、原核表達(dá)載體的構(gòu)建
具體實(shí)施步驟如下pET30a_ pqr6構(gòu)建策略
\^XpPQR6-Tl 為模板,利用引物 DRT2-pet-F 5'-GAGACCATGGCTATGTTGCCGAAAAATCGC-3' RDT2-pet-R :5'-GCGCCTCGAGTGCGGCAATAGTCTTACG-3'(引物設(shè)計時引入 NcoI、Xho I酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系為IOX pfu buffer (含有Mg2+) 5 ul, IOmMdNTPs lul, IOuM 引物 DRT2-F lul, IOuM 引物 DRT2-R lul,菌株 KT_q077 基因組 DNAlul, pfu DNA聚合酶lul,加水至50ul。擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性5分鐘;95°C 30秒,58°C 30秒,72°C I分鐘30秒,35個循環(huán);72°C延伸7分鐘。擴(kuò)增得到的片段和載體質(zhì)粒pET30a( + )經(jīng)NcoI、Xho I酶切后,連接,得到原核表達(dá)載體pET30a_ pqr6,如圖IA所示。pET30a- pqr7 構(gòu)建策略
\>XpPQR7-Tl 為模板,利用引物 DRT2-pet-F 5'-GAGACCATGGCTATGTTGCCGAAAAATCGC-3' RDT2-pet-R :5'-GCGCCTCGAGTGCGGCAATAGTCTTACG-3'(引物設(shè)計時引入 NcoI、Xho I酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系為IOX pfu buffer (含有Mg2+) 5 ul, IOmMdNTPs lul, IOuM 引物 DRT2-F lul, IOuM 引物 DRT2-R lul,菌株 KT_q077 基因組 DNAlul, pfu DNA聚合酶lul,加水至50ul。擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性5分鐘;95°C 30秒,58°C 30秒,72°C I分鐘30秒,35個循環(huán);72°C延伸7分鐘。擴(kuò)增得到的片段和載體質(zhì)粒pET30a( + )經(jīng)NcoI、Xho I酶切后,連接,得到原核表達(dá)載體pET30a_ pqr7,如圖IB所示。實(shí)施例3、植物表達(dá)載體的構(gòu)建
具體實(shí)施步驟如下pXQ35S- PRQ6構(gòu)建策略
BlpI、BamHI酶切原核表達(dá)載體pET30a_得到1271bp含his tag標(biāo)簽的融合表達(dá)基因片段,與經(jīng)Sma I、BamH I酶切的pXQ35S載體連接,得到植物過量表達(dá)載體pXQ35S-PRQ6,如圖2-A所示。pXQ35S- PRQ7 構(gòu)建策略
BlpI、BamHI酶切原核表達(dá)載體pET30a_得到1271bp含his tag標(biāo)簽的融合表達(dá)基因片段,與經(jīng)Sma I、BamHI酶切的pXQ35S載體連接,得到植物過量表達(dá)載體pXQ35S-PRQ6,如圖2-B所示。二、PQR6、PQR7基因功能驗(yàn)證 實(shí)施例4、原核表達(dá)及功能驗(yàn)證 表達(dá)目的基因菌株的獲得
大腸桿菌轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,將空載體質(zhì)粒pET30a ( + )轉(zhuǎn)化大腸桿菌&o7i. BL21作為負(fù)對照。目的基因在大腸桿菌中的功能驗(yàn)證
分別挑取帶有pET30a、pET30a-/7^和pET30a-/^r7質(zhì)粒的Β121菌株的單克隆,用LB培養(yǎng)液在37°C 200rpm震蕩培養(yǎng)16小時。取Iml培養(yǎng)物,以200倍體積擴(kuò)大培養(yǎng),LB培養(yǎng)液中加O. ImM IPTG,用來誘導(dǎo)和基因表達(dá)。37°C 200rpm震蕩培養(yǎng)4小時后(菌株培養(yǎng)0D600達(dá)到O. 6時),向含不同濃度methyl violengen等體積的LB培養(yǎng)液中投加等量的菌液,37°C 200rpm震蕩培養(yǎng)16小時后,觀察菌液濃度(圖3)并測定統(tǒng)計OD值(圖4)。如圖3所示,分別帶有pET30a-/7^ (圖3-B)和pET30a-/^r7 (圖3-C)質(zhì)粒的Ecoli. B121菌株最高能耐受25mM MV。其中在5mM濃度下,菌液的濃度分別是對照的16倍和17倍。實(shí)施例5、植物轉(zhuǎn)化、苗期篩選
植物轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AgLtl,用于轉(zhuǎn)化植(作)物擬南芥和水稻。擬南芥是通過農(nóng)桿菌液浸花法轉(zhuǎn)化;水稻是通過農(nóng)桿菌侵染愈傷后分化再生獲得轉(zhuǎn)基因苗。重組載體轉(zhuǎn)化擬南芥各階段篩選如下
T1代轉(zhuǎn)基因植株的篩選將收獲的轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代種子播種在營養(yǎng)缽中,長至4-5葉時,用百草枯(25Mm MV,O. 025% Tween)溶液噴灑葉片,篩選高抗植株,如圖5所示。以單株形式收集具有百草枯特性植株的種子T2代,干燥后直播于營養(yǎng)缽中。當(dāng)植株生長至4片葉時,用百草枯(25Mm MV,O. 025% Tween)溶液噴灑葉片,篩選高抗植株,如圖6所示。以單株形式收集具有百草枯特性植株的種子T3代,干燥后直播于營養(yǎng)缽中。當(dāng)植株生長至4-5片葉時,用百草枯(25Mm MV,O. 025% Tween)溶液噴灑葉片,篩選高抗植株,如圖7所示。轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子檢測取篩選得到的轉(zhuǎn)基因植株T1代葉片,提取基因組DNA,以pqr6和基因自身引物PCR檢測,植物表達(dá)載體質(zhì)粒作陽性對照,空白作陰性對照。圖8為PCR檢測電泳圖。重組載體轉(zhuǎn)化水稻各階段篩選如下
組培苗的篩選用G418 (100mg/L)抗性篩選Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻苗。轉(zhuǎn)基因植株Ttl代葉片耐受實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)基因植株Ttl代葉片長至4-5葉期,每個單株取新葉中段2cm長左右,浸泡于Iml (5Mm百草枯,0. 025% Tween)百草枯溶液72小時觀察葉片,如圖9所不ο轉(zhuǎn)基因植株T1代篩選將T1代種子按每個株系50 — 100粒分別播種,待植株長到
2葉期時,將植株葉片浸泡于100ml (5Mm百草枯,O. 025% Tween)百草枯溶液5分鐘,4天后觀察植株,如圖10所示。 轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測取組培篩選得到的轉(zhuǎn)基因植株Ttl代葉片,提取基因組DNA,以PQR6和基因自身引物PCR檢測,植物表達(dá)載體質(zhì)粒作陽性對照,空白作陰性對照,如圖11所示。
權(quán)利要求
1.一種賦予轉(zhuǎn)基因植物百草枯抗性的方法,其特征是將百草枯抗性相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因插入表達(dá)載體,獲得含有百草枯抗性基因的重組表達(dá)載體,將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物,從表達(dá)所述百草枯抗性基因的植株或所述百草枯抗性增加的植株中篩選得到百草枯抗性增強(qiáng)的植株;其中,所述百草枯抗性相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1或SEQ ID NO 2 所示。
2.權(quán)利要求I所述的增強(qiáng)植物百草枯抗性的方法,其特征在于所述百草枯抗性相關(guān)蛋白的編碼基因,是下述核苷酸序列之一 1)序列表中SEQID NO 3所示的核苷酸序列,或; 2)序列表中SEQID NO 4所示的核苷酸序列,或; 2)與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4序列具有90%以上相似性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
3.權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于將所述百草枯抗性編碼基因?qū)胫参锝M織、細(xì) 胞或器官,再將被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株,得到百草枯抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
4.權(quán)利要求I所述的方法,其中所述表達(dá)載體的特征是用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體是一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體,或者是可在原核生物中復(fù)制的載體。
5.權(quán)利要求3所述的方法,其中所述植物細(xì)胞來自單子葉或雙子葉植物。
6.權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞,其中所述單子葉植物細(xì)胞來自水稻,雙子葉植物細(xì)胞來自擬南芥。
7.權(quán)利要求2所述的方法,其中所述編碼百草枯抗性蛋白的基因核苷酸序列在植物轉(zhuǎn)基因抗性篩選中的應(yīng)用,其特征在于將所述核苷酸序列構(gòu)入植物表達(dá)載體,同時還插入其它可賦予植物對除草劑、鹽、低溫、干旱、氧化脅迫、抗生素、病原體或昆蟲的抗性,或是調(diào)控 植物的生長發(fā)育的表達(dá)盒。
8.權(quán)利要求7所述的方法,其中所述在植物轉(zhuǎn)基因抗性篩選中的應(yīng)用,優(yōu)選為在煙草、苜蓿、玉米、水稻、棉花、油菜或大豆中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種增強(qiáng)植物百草枯抗性的方法,涉及一種具有百草枯抗性的轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白及其編碼基因在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用,其中編碼百草枯抗性基因的蛋白序列如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示,其基因核苷酸序列如SEQIDNO3和SEQIDNO4所示。
文檔編號C12N15/82GK102718845SQ20121014299
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者喬琳, 夏勉, 張蕾, 徐海英, 李毅 申請人:北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司