專利名稱：水稻miR399d 及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻MT 淑從/ m寫為0smiR399d)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是世界上主要的糧食作物之一。我國(guó)水稻土壤地域主要集中在長(zhǎng)江中下游平原、四川盆地、珠江三角洲和臺(tái)灣省西部平原地區(qū)。這些地區(qū)多為酸性和微酸性土壤，土壤中磷素形態(tài)主要是磷酸鐵，水稻土的磷酸鐵含量一般可達(dá)非閉蓄態(tài)部分的50-80% (中國(guó)土壤，1978)，此種形態(tài)的磷難于被作物吸收。水稻土磷肥短缺的現(xiàn)狀，大大限制了水稻產(chǎn)量，因而改善水稻磷營(yíng)養(yǎng)特性，對(duì)于提高水稻產(chǎn)量意義重大。MicroRNA是由19-25個(gè)核苷酸組成的一類內(nèi)源性編碼單鏈小RNA(Dreyfuss等， 2002 ；Gebauer和Hentze, 2004 ；Ambros, 2004)。這類內(nèi)源性小分子RNA通過(guò)喊基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合于靶基因mRNA的側(cè)翼區(qū)域或編碼區(qū)域，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)(Dreyfuss等，2002 ；Gebauer等，2004 ；Ambros等，2004)。低磷養(yǎng)分下，miR399在擬南芥和水稻中都被證實(shí)大量誘導(dǎo)表達(dá)(Chiou等，2006 ；Bari等，2004)。此家族在擬南芥和水稻中分別有6個(gè)(Sunkar等，2004; Jones等，2004)和11個(gè)拷貝(Lopez等，2004)。報(bào)道表明在擬南芥中miR399參與了磷素短缺反應(yīng)。miR399作用于泛素結(jié)合酶(UBC24)，進(jìn)而調(diào)控磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在磷素動(dòng)態(tài)平衡中起著重要作用(Fujii等，2005; Chiou等，2006; Bari等，2006)。目前關(guān)于miRNA399與磷素脅迫的研究多集中于擬南芥中，對(duì)于水稻，單子葉模式作物的研究知之甚少，因此有進(jìn)一步深入研究的必要性。 miR399不僅和低磷響應(yīng)相關(guān)，還受到鹽脅迫的誘導(dǎo)。芯片數(shù)據(jù)表明，白楊和玉米經(jīng)過(guò)鹽處理后，心沒(méi)的表達(dá)上調(diào)(Ding等，2009 ；Jia等，2009)。而擬南芥中的心的表達(dá)在鹽處理前后沒(méi)有明顯變化(Fujii等，2005)，說(shuō)明不同物種中，microRNA的調(diào)控存在差異。水稻的是否受鹽脅迫調(diào)控，還沒(méi)有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)設(shè)計(jì)引物成功從日本晴全基因組序列中首次獲得水稻miR399d (以后簡(jiǎn)寫為從/)的前體基因，并將其轉(zhuǎn)入日本晴，獲得了過(guò)表達(dá)植株，過(guò)表達(dá)植株中磷含量過(guò)高，表現(xiàn)出磷中毒，說(shuō)明AsmTP1/在水稻磷動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控中有一定作用。本實(shí)驗(yàn)室還通過(guò)半定量和定量PCR研究了缺磷和鹽脅迫對(duì)flsfiuTPJP從/表達(dá)的影響，二者都能誘導(dǎo)
從/前體的表達(dá)，說(shuō)明0smiR399d可能不僅參與磷動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控，還與鹽脅迫反應(yīng)有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從水稻種克隆出的GsmTPl/前體基因及其應(yīng)用。具體包括在水稻中表達(dá)的microRNA，從/基因的克隆，克隆及檢測(cè)表達(dá)模式所需的引物序列，表達(dá)載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)基因植株的獲得，基因水稻中磷含量的測(cè)定，對(duì)fiwTPJP從/基因在缺磷脅迫和鹽脅迫處理后表達(dá)模式變化進(jìn)行分析鑒定所用的方法，及其作用的靶基因的驗(yàn)證。本發(fā)明首先提供一種分離出的DNA分子，該DNA分子為首次從水稻中克隆出的從/前體基因，全長(zhǎng)428bp，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明研究水稻miR399d對(duì)非生物脅迫例如缺磷脅迫、鹽脅迫的響應(yīng)，表明水稻miR399d對(duì)非生物脅迫例如缺磷脅迫、鹽脅迫的響應(yīng)，誘導(dǎo)效果明顯。本發(fā)明通過(guò)將水稻GsmTP1/前體基因在水稻中過(guò)表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植株，并驗(yàn)證水稻miR399d的功能。本發(fā)明提供用于從日本晴全基因組序列中，根據(jù)miR399d前體莖環(huán)兩端特異性區(qū)域設(shè)計(jì)的擴(kuò)增0smiR399d基因的引物對(duì)
miR399d 正向GCAGATCTGTAGGAAGACAAGAGGCAAGT (SEQ ID NO. 2)miR399d 反向GCGGTGACCGGGGCTAAACTCCTAAACA (SEQ ID NO. 3)
本發(fā)明提供用于RealtimePCR定量檢測(cè)0smiR399d表達(dá)的根據(jù)0smiR399d前體莖環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)的引物對(duì)
miR3"d 正向ATCGGTTGGTTATGTGC (SEQ ID NO. 4)miR3"d 反向CAGGCCGTTTTGGTGAA (SEQ ID NO. 5)
本發(fā)明提供一種檢測(cè)水稻基因從/響應(yīng)缺磷脅迫的方法，利用引物SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3，對(duì)缺磷處理的水稻cDNA樣品進(jìn)行半定量PCR，檢測(cè)該基因在莖葉中的表達(dá)；樣品為水稻的RNA經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄后所得cDNA ;其步驟如下
Ca)提取缺磷處理和正常培養(yǎng)水稻的地上部分的總RNA ；
(b)利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；
(c)利用引物對(duì)SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 3進(jìn)行半定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示從/基因的前體受到缺磷脅迫的誘導(dǎo)。本發(fā)明提供一種檢測(cè)水稻基因0smiR399d響應(yīng)鹽脅迫的方法，其步驟如下
Ca)提取鹽處理和正常培養(yǎng)水稻的的地上部分和根的總RNA ；
(b)利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；
(c)利用引物對(duì)SEQID NO. 4和SEQ ID NO. 5進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示從/基因的前體受到鹽脅迫的誘導(dǎo)。本發(fā)明提供一種驗(yàn)證miRNA靶基因的方法，5’ RACE，其步驟如下
Ca)提取淑從/過(guò)表達(dá)株系葉片的總RNA ；
(b)在mRNA5’端加上接頭；
(c)反轉(zhuǎn)錄成cDNA；
(d)用基因特異引物和接頭引物，擴(kuò)增目的基因，獲得目的基因的5’端序列。結(jié)果顯不-.OsPHO2的5’端與0smiR399d成熟序列互補(bǔ)，是0smiR399d的祀基因。本發(fā)明還提供一種測(cè)定水稻葉片中磷含量的方法，其步驟如下
(a)水稻新鮮葉片和根液氮研磨，加入含IOmM Tris> ImM EDTA> IOOmM NaCl、lmMP-巰基乙醇、ImM PMSF, pH8. 0的提取液。(b) IOOu I 樣品加入 900 ii I l%HAc，42°C 保溫 30min。(c) 13000g 離心 5min。(d)取 300 u I 上清加入 700 ill 含 0. 35% NH4M004、0. 86N H2SO4' I. 4% 抗壞血酸的檢測(cè)液，42°C保溫30min。(e ) 820nm處測(cè)吸光度。本發(fā)明還包括具有ttsfiuTPJP從/前體基因的水稻轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株表型明顯，主要為葉邊緣發(fā)黃，萎蔫，表現(xiàn)為磷中毒(圖8)。


圖I為半定量PCR檢測(cè)日本晴在磷充足和磷缺乏處理14d的情況下莖、葉中
的前體、( / 和為憐饑餓誘導(dǎo)基因 phosphorus starvation inducedgenes的簡(jiǎn)寫)的表達(dá)。 圖2為Real t ime PCR檢測(cè)不同濃度NaCl處理的日本晴中tniR399d前體的表達(dá)。其中，a為shoot中從/前體的表達(dá)。CK為對(duì)照，數(shù)字代表處理的NaCl的濃度?；虮磉_(dá)量計(jì)算方式40-A Ct，ACt是從/前體基因與內(nèi)參基因act in的Ct值之差，單位是cycle ；b為root中則從/前體的表達(dá)。CK為對(duì)照，數(shù)字代表處理的NaCl的濃度。基因表達(dá)量計(jì)算方式40-A Ct，ACt是從/前體基因與內(nèi)參基因act in的Ct值之差，單位是cycle。圖3為Real t ime PCR檢測(cè)200mM NaCl處理不同時(shí)間的日本晴中miR399d前體的表達(dá)。其中，a為shoot中從/前體的表達(dá)。CK為對(duì)照，數(shù)字代表處理時(shí)間?；虮磉_(dá)量計(jì)算方式40-A Ct，ACt是從/前體基因與內(nèi)參基因act in的Ct值之差，單位是cycle。b為root中心從/前體的表達(dá)。CK為對(duì)照，數(shù)字代表處理時(shí)間?；虮磉_(dá)量計(jì)算方式40- A Ct，A Ct是從/前體基因與內(nèi)參基因act in的Ct值之差，單位是cycle。圖4為轉(zhuǎn)0smiR399d的植株的HYG鑒定。其中，WT是野生型，1-8是轉(zhuǎn)基因植株。圖5為提取轉(zhuǎn)0smiR399d的Ttl代植株的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行定量PCR，檢測(cè)0smiR399d前體的表達(dá)。399d_l 399d_5是0smiR399d過(guò)表達(dá)的5個(gè)株系。圖6為5’ RACE驗(yàn)證0sPH02是否是0smiR399的靶基因。其中，箭頭所指的位置即5’ RACE擴(kuò)增出的0sPH02的5’端。圖7為WT和轉(zhuǎn)0smiR399d的植株中磷含量的測(cè)定。其中，WT是野生型，L7、L9、L12是0smiR399d過(guò)表達(dá)的3個(gè)株系，CK是對(duì)照，P是缺磷處理，s代表地上部分，r代表根。圖8為轉(zhuǎn)的磷中毒表型。其中，左邊為野生型，右邊為淑從/過(guò)表達(dá)株系。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅以用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行。如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述條件，或按照制造生產(chǎn)廠商的使用說(shuō)明。實(shí)施例I水稻MT 淑從/的克隆
I.水稻品種 Nipponbare (Oryza sativa Japonica)在培養(yǎng)箱(SPX-250-GB, Shanghai, China)中培養(yǎng)生長(zhǎng)條件為光周期 16h /8h (L/D)，28°C。2.基因組DNA提取。取0.05§嫩葉片，加入500111 65°C預(yù)熱的提取緩沖液，快速混勻；65°C水浴20min (期間倒置混勻1_2次)，冷卻至室溫；加入500 氯仿異戊醇(24:1),輕柔混勻，靜置l-2min ;12000rpm、室溫離心IOmin,上清轉(zhuǎn)移至新管；加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，輕柔混勻，靜置l-2min ;同上離心，上清轉(zhuǎn)移至新管；加入1/10體積3M NaAC(pH5. 2)、2倍體積冰冷的無(wú)水乙醇(_20°C )，輕柔混勻，_20°C靜置40min ;同上離心，棄上清，沉淀用70%乙醇(4°C預(yù)冷)洗滌2次；室溫涼干，25 UlTE (含1% (V/V) RNA酶)充分溶解沉淀；65°C水浴消化RNA Ih ;取5 ill用于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。3.基因的克隆。根據(jù)已知0smiR399d如體基因莖樸兩端的序列，設(shè)計(jì)水稻引物如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3。對(duì)水稻基因組序列進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，獲得基因全長(zhǎng)，具體序列信息參見(jiàn)SEQ ID NO. I。實(shí)施例2 miR399d的表達(dá)與缺磷處理的關(guān)系
20d的日本晴苗，缺磷處理14d后，分別提取水稻植株的莖、葉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄。以特異引物對(duì)(SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3)，進(jìn)行半定量PCR。淑從/的前體受缺磷誘導(dǎo)，而0smiR399d的高表達(dá)導(dǎo)致Osm)2 mRNA水平的下降(圖I)。實(shí)施例3 0smiR399的表達(dá)與鹽處理的關(guān)系
(I)不同鹽處理濃度下的\>Ye-0smiR399d的表達(dá)
日本晴培養(yǎng)20d的苗，分別用50、100、150、200mM NaCl處理24h, shoot、root分別提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以特異引物序列如SEQ ID NO. 4和和SEQ ID NO. 5，進(jìn)行real-timeRT-PCR檢測(cè)miR399d前體的表達(dá)。結(jié)果顯示，Shoot中，miR399d的表達(dá)開(kāi)始隨NaCl濃度的增加而升高，在150mM達(dá)到最高，200mM時(shí)，略有降低(圖2a)。Root中，則7 淑從/前體的表達(dá)隨濃度的增加而上升(圖2b)。(2)同一鹽處理濃度下，不同處理時(shí)間pre-miR399d的表達(dá)
日本晴培養(yǎng)20d 的苗，200mM NaCl 處理0h、2h、4h、8h、16h、24h后，shoot、root 分別提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用特異引物序列如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5，進(jìn)行realtimePCR檢測(cè)shoot、root中》27 淑從/前體的表達(dá)。結(jié)果顯示，Shoot中，miR399d的表達(dá)先上升4h后基本不變(圖3a) ；root中，miR399d在表達(dá)最高，隨后表達(dá)量下降(圖3b)。實(shí)施例4沒(méi)從/表達(dá)載體構(gòu)建，轉(zhuǎn)基因
I、將ttsfiuTPJP從/序列的5’端和3’端分別加上Bglll限制酶切位點(diǎn)和勿I酶切位點(diǎn)。然后以正義連入植物表達(dá)載體PCAMBIA1304。2、將重組載體以凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，侵染日本晴愈傷組織，經(jīng)過(guò)篩選、分化、生根后得到轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)施例5 轉(zhuǎn)基因植物0smiR399d的鑒定
取野生型和Ttl代轉(zhuǎn)基因植株的新鮮葉片為樣品，抽提基因組DNA，用潮霉素引物進(jìn)行特異性PCR，檢測(cè)到潮霉素基因的存在，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因成功(圖4)。取野生型和Ttl代轉(zhuǎn)基因植株的鮮葉片為樣品，進(jìn)行RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以SEQ ID NO. 4和和SEQ ID NO. 5為引物對(duì)GswiTPJ劃￠/進(jìn)行定量PCR，驗(yàn)證轉(zhuǎn)GswiTPJ劃￠/植株中0smiR399d的表達(dá)量。結(jié)果顯示，這5個(gè)株系中miR399d前體的表達(dá)都大大增加(圖5 )。 實(shí)施例6 驗(yàn)證0SH102和0smiR399d的關(guān)系
取Ttl代轉(zhuǎn)基因植株的鮮葉片為樣品，進(jìn)行RNA抽提，用RNA連接酶在mRNA 5’端加上接頭，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以基因特異反向引物和接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的序列測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其5’端斷裂位置的序列恰好與0smiR399d的成熟序列互補(bǔ)(圖6)，說(shuō)明0sH102是從/的靶基因。實(shí)施例7 培養(yǎng)20d的野生型日本晴和/過(guò)表達(dá)株系，缺磷處理14d，取新鮮的地上部分和根，液氮研磨，提取磷，檢測(cè)磷的含量(圖7)。轉(zhuǎn)基因植株中，地上部分磷含量明顯高于野生型，根中則略低于野生型。實(shí)施例8表型觀察(圖8)。《57^7 ^過(guò)表達(dá)株系表現(xiàn)出磷中毒的現(xiàn)象，葉片邊緣發(fā)黃，萎蔫。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，為從水稻中克隆出的從/前體基因，全長(zhǎng)428bp，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I。
2.一種基因組中含有如權(quán)利要求I所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因水稻植株。
3.一對(duì)用于調(diào)取水稻基因組中mTPJP從/前體基因的引物，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求I所述基因莖環(huán)兩端區(qū)域設(shè)計(jì)，序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
4.一對(duì)RealtimePCR定量檢測(cè)水稻mTPJP從/前體基因表達(dá)的引物，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求I所述基因莖環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)，序列如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示。
5.一種檢測(cè)水稻基因0smiR399d響應(yīng)缺磷脅迫的方法，其特征是利用引物SEQ IDNO. 2和SEQ ID NO. 3，對(duì)缺磷處理的水稻cDNA樣品進(jìn)行半定量PCR，檢測(cè)該基因在莖葉中的表達(dá)；樣品為水稻的RNA經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄后所得cDNA ;其步驟如下 Ca)提取缺磷處理和正常培養(yǎng)水稻的總RNA ； (b)利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA； (c)利用引物對(duì)SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 3，進(jìn)行半定量PCR檢測(cè)。
6.一種檢測(cè)水稻基因0smiR399d響應(yīng)鹽脅迫的方法，其特征在于鹽處理的水稻分別提取根和莖葉的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物對(duì)SEQ IDNO. 4和SEQ ID NO. 5對(duì)cDNA樣品進(jìn)行定量PCR，檢測(cè)該基因在根和莖葉中的表達(dá)，結(jié)果顯示基因的前體受到鹽脅迫的誘導(dǎo)。
7.一種驗(yàn)證miRNA靶基因的方法，5’RACE，其特征在于在mRNA 5’端加上接頭，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用基因特異引物和接頭引物，擴(kuò)增目的基因，獲得目的基因的5’端序列，結(jié)果顯示-.0sPH02的5’端與GswiTP淑從/成熟序列互補(bǔ)，是0smiR399d的靶基因。
8.一種測(cè)定水稻葉片中磷含量的方法，其特征在于提取根和莖葉中的可溶性磷，利用磷與鑰酸銨形成絡(luò)合物，然后被抗壞血酸還原成鑰藍(lán)，根據(jù)在820nm有吸收峰的原理，測(cè)定根和莖葉中的磷含量。
9.如權(quán)利要求I所述的基因0smiR399d在植物品種改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為水稻miR399d及其應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)過(guò)表達(dá)水稻miR399d(簡(jiǎn)寫為OsmiR399d)的轉(zhuǎn)基因水稻植株驗(yàn)證水稻miR399d基因的功能。本發(fā)明包含水稻miR399d前體基因的克隆、含有該基因的表達(dá)載體構(gòu)建、引物序列、OsmiR399d過(guò)表達(dá)植株、基因OsmiR399d對(duì)缺磷脅迫和鹽脅迫的響應(yīng)及其靶基因的驗(yàn)證。半定量和定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，缺磷處理以及鹽處理均能提高其在根和莖葉中的表達(dá)。通過(guò)5’RACE證明OsmiR399d的靶基因是OsPHO2。本發(fā)明還公開(kāi)基因OsmiR399d在水稻中過(guò)表達(dá)后，明顯提高了轉(zhuǎn)基因植株莖葉中磷的含量，使植株表現(xiàn)出磷中毒。該基因OsmiR399d可用于植物品種改良。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102676525SQ20121015329
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月17日
發(fā)明者呂波, 張璇, 張睿, 明鳳, 金津 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)