專利名稱：HLA-A^*3303限制性WT1肽和包含此肽的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及HLA_A*3303限制性肽，具體地說所述肽包含由來自WTl蛋白的9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的氨基酸序列，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸選自Ala、He、Leu、Val、Phe、Tyr> Ser和Asp,并且在氨基酸序列中第9位的氨基酸是Arg。此外,本發(fā)明還涉及編碼此肽的多核苷酸和包含此肽的用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物等等。發(fā)明背景
WTl基因(Wilms腫瘤I基因(Wilms' tumor Igene))被認(rèn)為是導(dǎo)致Wilms腫瘤即兒童腎癌的基因(非專利文獻(xiàn)I和2)。WTl是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。WTl基因起初被認(rèn)為是腫瘤阻抑基因。然而隨后的研究(非專利文獻(xiàn)3、4、5和6)表明WTl基因在造血腫瘤和實(shí)體癌中起癌基因的作用。WTl基因在許多類型的惡性腫瘤中高水平表達(dá)。對(duì)作為自體蛋白的未突變WTl基因產(chǎn)物在活體中是否具有免疫原性已做了驗(yàn)證。這些結(jié)果表明了在腫瘤細(xì)胞中高水平表達(dá)的WTl基因所表達(dá)的蛋白經(jīng)過在細(xì)胞內(nèi)的加工而被片段化。產(chǎn)生的肽和MHC I類分子形成復(fù)合體，該復(fù)合體被呈遞到細(xì)胞表面，通過肽的接種可以誘導(dǎo)識(shí)別該復(fù)合體的CTL(非專利文獻(xiàn)7、8和9)。同樣表明用WTl肽或WTl的cDNA免疫小鼠，被移植的表達(dá)WTl基因的腫瘤細(xì)胞被高幾率地排斥(非專利文獻(xiàn)7和10);而生理性地表達(dá)WTl基因的正常組織沒有受到被誘導(dǎo)的CTL的破壞(非專利文獻(xiàn)7)。體外人類細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)具有結(jié)合HLA-A*0201分子(人類MHC I類分子之一)的高能力的Dbl26肽或WH187肽(SEQ ID No I的第187-195位的氨基酸，SLGEQQYSV)用于刺激具有HLA_A*0201的人類外周血單核細(xì)胞時(shí)，WTl-特異性CTL被誘導(dǎo)。被誘導(dǎo)的CTL具有對(duì)高水平地內(nèi)源表達(dá)WTl基因的腫瘤細(xì)胞特異的細(xì)胞毒活性，該CTL的細(xì)胞毒活性是HLA-A2限制性的(非專利文獻(xiàn)11)。人類細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)表明使用匹配HLA-A*2402 (其是HLA-A等位基因之中最頻繁地出現(xiàn)在日本人中的)的WTl肽(WTl235 ；SEQ ID No 1的第235-243位的氨基酸，CMTWNQMNL)，可以誘導(dǎo)WTl特異性CTL(TAK-I)(非專利文獻(xiàn)12)。被誘導(dǎo)的CTL并不阻抑部分地生理表達(dá)WTl基因的正常造血干細(xì)胞形成集落的活性。這些報(bào)道強(qiáng)烈地表明WTl特異性CTL不止可以在小鼠中誘導(dǎo)而且可以在人類中誘導(dǎo)。此CTL具有抗高水平表達(dá)WTl基因的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，但不具有抗生理地表達(dá)WTl基因的正常細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。(非專利文獻(xiàn)7、10、11、12、13 和 14)。WTl基因產(chǎn)物作為核內(nèi)蛋白被呈遞并在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)蛋白酶體加工而片段化成肽。片段化的肽被TAP (與抗原加工有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，與MHC I類分子形成復(fù)合體并呈遞到細(xì)胞表面。出于CTL前體細(xì)胞經(jīng)由TCR而識(shí)別WTl肽-MHC I類分子復(fù)合體的結(jié)果，WTl特異性CTL被誘導(dǎo)，從而施加細(xì)胞毒的作用于通過MHC I類分子呈遞WTl基因產(chǎn)物的腫瘤細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)7、8和9)。那么，定靶WTl基因產(chǎn)物的癌癥免疫療法中所使用的WTl肽至少需要是在活體中結(jié)合MHC I類分子的形式。然而MHC I類分子是多種多樣的而且結(jié)合各自的MHC I類分子的WTl肽的氨基酸序列也是互不相同的。因此，需要提供與各自的MHC I類亞型匹配的肽。然而，迄今僅知道HLA-A*2402分子限制性肽、HLA_A*0201分子限制性肽和HLA-A*2601分子限制性肽是HLA分子限制性的WTl肽(分別見專利文獻(xiàn)
I、非專利文獻(xiàn)11和專利文獻(xiàn)2)。HLA-A*3303以緊隨HLA_A*2402之后的最高百分比出現(xiàn)在日本人中。因此，有必要找出HLA-A*3303限制性的WTl肽。專利文獻(xiàn)I :W0 2003/106682專利文獻(xiàn)2 W0 2005/095598非專利文獻(xiàn)I =Daniel A. Haber 等 ，Cell. 1990Jun 29 ；61 (7) :1257-69. 非專利文獻(xiàn)2 Call KM 等 ，Cell. 1990Feb 9 ；60 (3) :509-20.非專利文獻(xiàn)3 =Menke AL 等 ，Int Rev Cytol. 1998 ；181 :151-212.綜述.非專利文獻(xiàn)4 :Yamagami T 等 ，Blood. 1996Apr I ；87(7) :2878-84.非專利文獻(xiàn)5 :Inoue K 等 ，Blood. 1998Aprl5 ；91 (8) :2969-76.非專利文獻(xiàn)6 =Tsuboi A 等 ，Leuk Res. 1999May ；23(5) :499-505.非專利文獻(xiàn)7 0ka Y 等 ，J Immunol. 2000Feb 15 ；164(4) :1873-80.非專利文獻(xiàn)8 =Melief CJ 等 ，Immunol Rev. 1995Jun ；145 :167-77.非專利文獻(xiàn)9 Ritz J, J Clin Oncol. 1994Feb ；12(2) :237-8.非專利文獻(xiàn)10 =Tsuboi A 等 ，J Clin Immunol. 2000May ；20(3) :195-202.非專利文獻(xiàn)11 0ka Y 等 ，Immunogenetics. 2000Feb ；51 (2) :99-107.非專利文獻(xiàn)12 0hminami H 等 ，Blood. 2000Jan I ；95(1) :286-93.非專利文獻(xiàn)13 Gao L 等 ，Blood. 2000Apr I ；95(7) :2198-203.非專利文獻(xiàn)14 0hminami H 等 ，Blood. 2000Jan I ；95(1) :286-93.發(fā)明公開本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明要解決的問題是提供HLA_A*3303限制性的WTl肽和編碼此肽的多核苷酸以及包含此肽和此多核苷酸的用于治療/預(yù)防癌癥的藥物組合物等等。解決問題的方法本發(fā)明人針對(duì)以上描述的情況做了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具以下特征的肽能夠高效誘導(dǎo)WTl特異性CTL :包含由來自WTl蛋白的9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的氨基酸序列，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸選自Ala、lie、Leu、Val、Phe、Tyr> Ser和Asp并且在氨基酸序列中第9位的氨基酸是Arg。因此，本發(fā)明已被完成。本發(fā)明提供(I)包含由來自WTl蛋白的9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的氨基酸序列的肽，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸選自Ala、He, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser和Asp并且在氨基酸序列中第9位氨基酸的是Arg;(2) (I)中的肽，其中氨基酸序列選自Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg (SEQ ID No :3)、
Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg(SEQ ID No :4)和Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg(SEQ ID No :5)；(3) (2)中的妝，其中氨基酸序列是 Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg(SEQID No 4)；
(4)用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含(I)中的肽；(5)用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括對(duì)HLA_A*3303陽性受試者施用有效量的(4)中的藥物組合物；(6)⑴中的肽在制備⑷中的藥物組合物中的應(yīng)用；(7)編碼⑴中的肽的多核苷酸；(8)包含(7)中的多核苷酸的表達(dá)載體；(9)用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含(7)中的多核苷酸或者⑶中的載體；(10)治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將有效量的(9)中的藥物組合物給予HLA-A*3303陽性受試者。(11) (7)中的多核苷酸或(8)中的載體在制備(9)中的藥物組合物中的應(yīng)用；(12) WTl特異性CTL，其可通過⑴中的肽誘導(dǎo)；(13)用于誘導(dǎo)WTl特異性CTL的方法，所述方法包括在(I)中的肽存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞以使其從外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)成為WTl特異性CTL ；(14)用于誘導(dǎo)WTl特異性CTL的試劑盒，所述試劑盒包含作為必需組分的⑴中的肽；(15)呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞，其可通過⑴中的肽誘導(dǎo)；(16)誘導(dǎo)呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法包括在(I)中的肽存在下培養(yǎng)未成熟的抗原呈遞細(xì)胞使之從未成熟的抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)成為呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞；(17)誘導(dǎo)呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包含作為必需組分的
(I)中的肽;(18)用于診斷癌癥的方法，所述方法包括使用(12)中的CTL或者(15)中的抗原呈遞細(xì)胞；(19)用于測(cè)定WTl特異性CTL在HLA-A*3303陽性受試者中存在或量的方法，所述方法包括(a)使WTl肽和HLA_A*3303分子的復(fù)合體與來自受試者的樣品反應(yīng)；(b)測(cè)定識(shí)別樣品中含有的復(fù)合體的CTL的存在或量；(20) (19)中的方法，其中所述復(fù)合體是四聚體的形式。發(fā)明效果本發(fā)明提供了 HLA_A*3303限制性WTl肽、編碼此肽的多核苷酸以及包含此肽和此多核苷酸的用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物等等。因此有可能在具有HLA-A*3303的受試者的體內(nèi)或體外誘導(dǎo)WTl特異性CTL。因?yàn)榧s24%的日本人具有至少一個(gè)HLA-A*3303分子，所以可以在非常廣范圍的受試者中誘導(dǎo)WTl特異性CTL。附圖
簡述
圖I代表用WTl337誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖2代表用WTl364誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖3代表用WTl367誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖4代表用WTl4tl9誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖5代表用WTl364誘導(dǎo)CTL的抗內(nèi)源表達(dá)WTl基因的細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。圖6代表用WTl367誘導(dǎo)CTL的抗內(nèi)源表達(dá)WTl基因的細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。圖7代表用WTl4tl9誘導(dǎo)CTL的抗內(nèi)源表達(dá)WTl基因的細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。圖8代表用WTl367誘導(dǎo)CTL的抗表達(dá)WTl基因的細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。實(shí)施本發(fā)明的最佳模式人類WTl蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID No :1。WTl基因以其天然的形式高水平地表達(dá)于例如，諸如白血病、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome)、多發(fā)性骨髓瘤或惡性淋巴瘤的造血腫瘤中以及諸如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌的實(shí)體癌中。此外對(duì)HLA-A*3303的錨定基序的特征為第2位的氨基酸是Ala、lie、Leu、Val、Phe、Tyr> Ser和Asp中的任意一個(gè)并且第9位的氨基酸是Arg。因此另一方面，本發(fā)明涉及HLA-A*3303限制性WTl肽，所述肽包含由來自WTl蛋白的9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的氨基酸序列，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸優(yōu)選選自Ala、lie、Leu、Val、Phe、Tyr、Ser和Asp,并且在氨基酸序列中第9位的氨基酸優(yōu)選Arg (下文稱為肽)。本發(fā)明的肽所包含的由9個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列優(yōu)選是Leu Ser His LeuGln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg(SEQ IDNo :3)、Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg(SEQ ID No :4)或者Thr Ser Glu Lys ProPhe Ser Cys Arg (SEQ ID No :5)。最優(yōu)選是 Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQID No :4)。此外，在SEQ ID No :2_5中任一個(gè)的9個(gè)氨基酸中，可以用其他氨基酸代替一個(gè)至多個(gè)，優(yōu)選一個(gè)至五個(gè)氨基酸?？梢赃m當(dāng)?shù)匦揎?個(gè)氨基酸的任意一個(gè)或者其他代替的氨基酸。在任何情況下本發(fā)明的肽保持結(jié)合HLA-A*3303分子的能力。如前文所述，本發(fā)明的目的是要獲得HLA_A*3303限制性WTl肽。因此，本發(fā)明的肽可以是任何一種，只要此肽包含來自WTl蛋白的氨基酸序列并且是由9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成。因此，本發(fā)明的肽可以是例如僅由在SEQ ID No :2-5的任意一個(gè)中所表示的氨基酸序列的肽、包含在SEQ ID No :2-5的任意一個(gè)中所表示的氨基酸序列的WTl蛋白或其部分。可以在本發(fā)明的肽中由9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的氨基酸序列的N-末端和/或C-末端連接各種物質(zhì)。例如可以連接氨基酸、肽或者所述的氨基酸或肽類似物。倘若使這些物質(zhì)連接到本發(fā)明的肽，則它們可以被加工，例如通過活體中的酶或者通過諸如細(xì)胞內(nèi)加工的加工過程，最后可以產(chǎn)生此由9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的氨基酸序列并與HLA-A*3303分子作為復(fù)合體被呈遞到細(xì)胞表面，從而達(dá)到誘導(dǎo)CTL的效果。這些物質(zhì)可以是調(diào)節(jié)本發(fā)明的肽的溶解性的物質(zhì)或者是增加所述肽的穩(wěn)定性(對(duì)蛋白酶的抗性等等)的物質(zhì)?；蛘哌@些物質(zhì)可以是特異性地傳遞本發(fā)明的肽的物質(zhì)，例如傳遞到特定的組織或者器官；或者它們可以具有提高被抗原呈遞細(xì)胞攝取效率的作用等等。這些物質(zhì)可以是諸如輔助肽等能提高誘導(dǎo)CTL能力的物質(zhì)。本發(fā)明的肽可以通過在本領(lǐng)域中所使用的一般的方法或其修改形式合成。所述方、法描述于例如 Peptide Synthesis (肽合成)，Interscience, New Y 或 k (紐約)，1966、TheProteins (蛋白)，Vol 2 (第 2卷)，Academic Press Inc.(學(xué)術(shù)出版社公司)，New York(M約)，1976、Peptide-Gosei, Maruzen Co. , Ltd. (Maruzen 有限公司)，1975、Peptide-GoseiNo Kiso To Jikken, Maruzen Co. , Ltd. (Maruzen 有限公司)，1985 和 Iyakuhin NoKaihatsu(Zoku), Vol.14(第 14 卷)，Peptide-Gosei, Hirokawa-Book store(Hirokawa 書店)，1991。本發(fā)明的肽同樣可以根據(jù)編碼本發(fā)明的肽的核苷酸序列信息使用基因工程技術(shù)制備。所述基因工程技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。 另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含HLA-A*3303限制性WTl肽。WTl基因高水平地表達(dá)于例如白血病、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤或惡性淋巴瘤的造血腫瘤中以及諸如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌的實(shí)體癌中。因此本發(fā)明的藥物組合物可以應(yīng)用于治療或預(yù)防癌癥。當(dāng)將本發(fā)明的藥物組合物給予HLA-A*3303陽性受試者時(shí)，WTl特異性CTL被包含在藥物組合物中的HLA-A*3303限制性WTl肽所誘導(dǎo)，并由這種CTL破壞受試者的癌細(xì)胞。除作為有效成分的HLA_A*3303限制性WTl肽以外，本發(fā)明的藥物組合物還可以包含例如載體、賦形劑等。包含在本發(fā)明的藥物組合物中的HLA-A*3303限制性WTl肽誘導(dǎo)WTl特異性CTL。因此本發(fā)明的藥物組合物可以包含合適的佐劑或者可以與合適的佐劑一起給藥以增強(qiáng)誘導(dǎo)效果。優(yōu)選佐劑的實(shí)例包括但不限于完全的或不完全的弗氏佐劑和氫氧化招。本發(fā)明的藥物組合物的給藥方法可以根據(jù)以下條件適當(dāng)?shù)刈鞒鲞x擇例如疾病類另IJ、受試者的狀態(tài)或靶位點(diǎn)。所述方法的實(shí)例包括但不限于皮內(nèi)給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、靜脈給藥、鼻內(nèi)給藥以及口腔給藥。包含在本發(fā)明的藥物組合物中肽的含量，以及本發(fā)明的藥物組合物的劑型、給藥次數(shù)等等可以根據(jù)以下條件適當(dāng)?shù)刈鞒鲞x擇例如疾病類別、受試者的狀態(tài)或靶位點(diǎn)。肽的單次劑量通常是0. OOOlmg-lOOOmg，優(yōu)選0. OOlmg-lOOOOmg。另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將有效量的藥物組合物給予HLA-A*3303陽性受試者。待治療或預(yù)防的癌癥可以是任何一種，其實(shí)例包括諸如白血病、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤或惡性淋巴瘤的造血腫瘤以及諸如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌的實(shí)體癌。另一方面，本發(fā)明涉及HLA_A*3303限制性WTl肽在制備藥物組合物中的應(yīng)用。再一方面，本發(fā)明涉及用于測(cè)定WTl特異性CTL在HLA_A*3303陽性受試者中的存在或量的方法，所述方法包括(a)使WTl肽和HLA_A*3303分子的復(fù)合體與來自受試者的樣品反應(yīng)；(b)測(cè)定識(shí)別樣品中含有的復(fù)合體的CTL的存在或量。取自受試者的樣品可以是任何一種，只要樣品中有可能含有淋巴細(xì)胞。樣品的實(shí)例包括諸如血液或淋巴的體液和組織。WTl肽和HLA-A*3303分子的復(fù)合體可以按以下方式制備例如使用諸如生物素_鏈霉親和素法的本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法制備為四聚體或者五聚體。識(shí)別此復(fù)合體的CTL的存在或量可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法檢測(cè)。本發(fā)明的此方面中，此復(fù)合體可以被標(biāo)記。諸如突光標(biāo)記或者放射性標(biāo)記的眾所周知的標(biāo)記可以用作標(biāo)記。通過標(biāo)記使CTL存在或量的測(cè)定簡易快速。本發(fā)明的此方面的方法可以用于診斷癌癥、預(yù)測(cè)癌癥等等。因此本發(fā)明同樣提供了用于測(cè)定WTl特異性CTL在HLA_A*3303的陽性受試者中的存在或量的組合物，所述組合物包含WT1肽與HLA-A*3303分子的復(fù)合體。此外本發(fā)明提供了用于測(cè)定WTl特異性CTL在HLA-A*3303的陽性受試者中的存在或量的試劑盒，所述試劑盒包含=WTl肽與HLA-A*3303分子的復(fù)合體。再一方面，本發(fā)明涉及用于使用WTl肽與HLA_A*3303分子的復(fù)合體產(chǎn)生WTl特異性CTL的方法，所述方法包括(a)使復(fù)合體與樣品反應(yīng)；(b)獲得識(shí)別樣品中含有的復(fù)合體的CTL。WTl肽與HLA_A*3303分子的復(fù)合體在 上文已做描述。樣品可以是任何一種，只要樣品中有可能含有淋巴細(xì)胞。樣品的實(shí)例包括諸如血液的來自受試者的樣品和細(xì)胞培養(yǎng)物。識(shí)別復(fù)合體的CTL可以通過使用諸如FACS或者M(jìn)ACS的本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法獲得。本發(fā)明使得能夠培養(yǎng)獲得的WTl特異性CTL并用其治療或預(yù)防各種癌癥。因此本發(fā)明同樣涉及WTl特異性CTL，其可通過使用WTl肽與HLA_A*3303分子的復(fù)合體產(chǎn)生WTl特異性CTL的方法獲得。此外本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生WTl特異性CTL的試劑盒，所述試劑盒包含WTl肽與HLA-A*3303分子的復(fù)合體。另一方面，本發(fā)明涉及編碼HLA_A*3303限制性WTl肽的多核苷酸(下文稱為WTl多核苷酸)。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA或RNA。本發(fā)明的多核苷酸的堿基序列可以基于HLA-A*3303限制性WTl肽的氨基酸序列而確定。所述多核苷酸可以通過例如合成DNA或RNA的方法、PCR法等方法制備。另一方面，本發(fā)明涉及包含此多核苷酸的表達(dá)載體(下文稱為WTl表達(dá)載體)。表達(dá)載體的類別、所包含的除此多核苷酸序列以外的序列等可以根據(jù)引入本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主類型、使用意圖等而適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行選擇。有可能通過將本發(fā)明的表達(dá)載體給予HLA-A*3303陽性受試者以在活體中產(chǎn)生WTl肽并誘導(dǎo)WTl特異性CTL，隨后通過破壞受試者中的造血腫瘤細(xì)胞或?qū)嶓w癌細(xì)胞，從而治療或預(yù)防造血腫瘤或?qū)嶓w癌。另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含WTl多核苷酸或WTl表達(dá)載體。這個(gè)方面中的本發(fā)明的藥物組合物的組成、施用方法等均已在上文描述。另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將有效量的包含WTl肽或WTl表達(dá)載體的藥物組合物給予HLA-A*3303陽性受試者。待治療或預(yù)防的癌癥的實(shí)例包括諸如白血病、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤或惡性淋巴瘤的造血腫瘤以及諸如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌的實(shí)體癌。另一方面，本發(fā)明涉及WTl多核苷酸或WTl表達(dá)載體在制造包含WTl多核苷酸或WTl表達(dá)載體的藥物組合物中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明涉及含有表達(dá)載體的細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞可以通過以下方式制備例如通過用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化諸如大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞的宿主細(xì)胞。用于將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法可以適當(dāng)?shù)剡x自各種方法。通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞、回收并純化產(chǎn)生的WTl肽，本 發(fā)明的肽得以制備。再一方面，本發(fā)明涉及WTl特異性CTL，其通過HLA_A*3303限制性WTl肽誘導(dǎo)。本發(fā)明的CTL識(shí)別WTl肽和HLA-A*3303分子的復(fù)合體。因此本發(fā)明的CTL可以應(yīng)用于特異性地破壞HLA-A*3303陽性并高水平表達(dá)WTl的腫瘤細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將WTl特異性CTL給予HLA-A*3303陽性受試者。給予WTl特異性CTL的方法可以根據(jù)以下條件適當(dāng)?shù)剡x擇例如疾病的類型、受試者的狀態(tài)或祀位點(diǎn)。此方法的實(shí)例包括但不限于靜脈給藥、皮內(nèi)給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥和口腔給藥。另一方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)WTl特異性CTL的方法，所述方法包括在HLA-A*3303限制性WTl肽存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞以從外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)WTl特異性CTL0外周血單核細(xì)胞所得自的受試者可以是任何一個(gè)，只要是HLA-A*3303陽性受試者。通過在HLA-A*3303限制性WTl肽存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，WTl特異性CTL從包括于外周血單核細(xì)胞內(nèi)的CTL前體細(xì)胞誘導(dǎo)得到。有可能通過將本發(fā)明的WTl特異性CTL給予受試者以治療或預(yù)防在HLA-A*3303陽性受試者中的造血腫瘤或?qū)嶓w癌。另一方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)WTl特異性CTL的試劑盒，所述試劑盒包含作為必需組分的HLA-A*3303限制性WTl肽。優(yōu)選試劑盒在誘導(dǎo)WTl特異性CTL的方法中使用。本發(fā)明的試劑盒可以除包含HLA-A*3303限制性WTl肽以外，還包含例如獲得外周血單核細(xì)胞的工具、佐劑和反應(yīng)容器等等。一般來說，說明手冊(cè)附于試劑盒中。通過使用本發(fā)明的試劑盒，可高效地誘導(dǎo)WTl特異性CTL。又一方面，本發(fā)明涉及通過HLA_A*3303分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞)，所述抗原呈遞細(xì)胞通過HLA-A*3303限制性WTl肽誘導(dǎo)。通過使用本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞，可高效地誘導(dǎo)WTl特異性CTL4。另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將通過HLA-A*3303分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞給予HLA_A*3303陽性受試者。給予抗原呈遞細(xì)胞的方法可以根據(jù)以下條件適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行選擇例如疾病的類型、受試者的狀態(tài)或靶位點(diǎn)。所述方法的實(shí)例包括但不限于靜脈給藥、皮內(nèi)給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥和口腔給藥。另一方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)通過HLA_A*3303分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法包括在HLA-A*3303限制性WTl肽存在下培養(yǎng)未成熟的抗原呈遞細(xì)胞，使未成熟的抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)成為通過HLA-A*3303分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞。未成熟的抗原呈遞細(xì)胞是指可以成熟變?yōu)榭乖蔬f細(xì)胞的細(xì)胞，例如未成熟的樹突細(xì)胞。未成熟的抗原呈遞細(xì)胞所得自受試者可以是任何一個(gè)，只要是HLA-A*3303陽性受試者。因?yàn)槲闯墒斓目乖蔬f細(xì)胞包括于例如外周血單核細(xì)胞中，所以所述的未成熟的抗原呈遞細(xì)胞可以在WTl肽的存在下培養(yǎng)。另一方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)通過HLA-A*3303分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包含作為必需組分的HLA-A*3303限制性WTl肽。優(yōu)選該試劑盒應(yīng)用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的方法。本發(fā)明的試劑盒中所包含的其他組分等已在上文描述過。本發(fā)明的試劑盒可以用于高效地誘導(dǎo)通過HLA-A*330分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及抗HLA-A*3303限制性WTl肽的抗體或抗編碼此肽的多核苷酸的抗體。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。又一方面，本發(fā)明涉及用于診斷癌癥方法，所述方法包括使用WTl特異性CTL ;使用通過HLA-A*3303分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞或者使用抗HLA_A*3303限制性WTl肽的抗體或抗編碼此肽的多核苷酸的抗體。優(yōu)選WTl特異性CTL應(yīng)用于本發(fā)明用于診斷的方法。例如有可能通過以下方式診斷癌癥將CTL、抗原呈遞細(xì)胞或抗體與來自HLA-A*3303陽性受試者的樣品一起溫育；或者將其給予HLA-A*3303陽性受試者，然后測(cè)定例如其位置、位點(diǎn)或含量。CTL、抗原呈遞細(xì)胞或抗體可以被標(biāo)記。通過標(biāo)記的附著，可以高效地實(shí)施本發(fā)明用于診斷的方法。另一方面，本發(fā)明涉及用于診斷癌癥的試劑盒，所述試劑盒包含作為必需組分的WTl特異性CTL、通過HLA-A*3303分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞或抗HLA_A*3303限制性 WTl肽的抗體或抗編碼此肽的多核苷酸的抗體。以下實(shí)施例更詳細(xì)地說明了本發(fā)明，但不能將其解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例實(shí)施例I選擇WTl肽用NetMHC2. 0 程序(Technical University of Denmark (丹麥技術(shù)大學(xué)))從來自 WTl 蛋白(SFQ ID No 1)的 WTl 肽中選擇出 WT1337、WT1364、WTl367 和 WTl4tl9，這些肽是由 9個(gè)氨基酸組成的具有適合HLA-A*3303的錨定基序的親水肽(N-末端起的第二個(gè)氨基酸是Ala、lie、Leu、Val、Phe、Tyr> Ser和Asp中的任意一個(gè)并且C-末端的氨基酸是Arg),并預(yù)期其具有與HLA-A*3303分子高度的結(jié)合親和力。這些肽的氨基酸序列以及與HLA_A*3303分子結(jié)合親和力示于表I中。[表 I]
權(quán)利要求
1.一種肽，其由其中1-5個(gè)氨基酸被其他氨基酸代替的Ser AspGln Leu Lys Arg HisGln Arg (SEQ ID No :4)的氨基酸序列組成，其中所述肽能結(jié)合HLA_A*3303分子并能誘導(dǎo)CTL。
2.用于治療或預(yù)防HLA-A*3303陽性受試者的癌癥的藥物組合物，其包含權(quán)利要求I的肽。
3.權(quán)利要求I的肽在制備治療或預(yù)防HLA-A*3303陽性受試者的癌癥的藥物中的應(yīng)用。
4.編碼權(quán)利要求I的肽的多核苷酸。
5.包含權(quán)利要求4的多核苷酸的表達(dá)載體。
6.用于治療或預(yù)防HLA-A*3303陽性受試者的癌癥的藥物組合物，其包含權(quán)利要求4的多核苷酸或包含所述多核苷酸的表達(dá)載體。
7.權(quán)利要求4的多核苷酸或包含所述多核苷酸的表達(dá)載體在制備治療或預(yù)防HLA-A*3303陽性受試者的癌癥的藥物中的應(yīng)用。
8.WTl特異性CTL，其通過權(quán)利要求I的肽誘導(dǎo)得到。
9.誘導(dǎo)WTl特異性CTL的方法，所述方法包括在權(quán)利要求I的肽存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，以從外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)WTl特異性CTL。
10.用于誘導(dǎo)WTl特異性CTL或用于誘導(dǎo)呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包含作為必需組分的權(quán)利要求I的肽。
11.呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞，其通過權(quán)利要求I的肽誘導(dǎo)得到。
12.用于誘導(dǎo)呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法包括在權(quán)利要求I的肽存在下培養(yǎng)未成熟的抗原呈遞細(xì)胞，以從未成熟的抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞。
13.WTl肽和HLA-A*3303分子的復(fù)合體，其中所述WTl肽是權(quán)利要求I的肽。
14.權(quán)利要求13的復(fù)合體，其中所述復(fù)合體是四聚體的形式。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含由來自WT1蛋白的連續(xù)九個(gè)氨基酸殘基組成的氨基酸序列的肽，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸殘基選自Ala、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、Ser和Asp，并且在氨基酸序列中第9位的氨基酸殘基是Arg；編碼此肽的多核苷酸；包含此肽的藥物組合物；以及其它。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102702319SQ20121015826
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2007年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月22日
發(fā)明者杉山治夫 申請(qǐng)人:株式會(huì)社癌免疫研究所