專利名稱：一種新的hla-a2限制性表位多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及一種HLA-A2限制性表位多肽，以及該表位及其相關(guān)的重組蛋白、編碼核苷酸序列、抗原遞呈細胞、組合物在表達人磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(hPEBP4蛋白)腫瘤治療及預(yù)防中的用途。
背景技術(shù)：
人磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白 4 (human phosphatidylethanolamine (PE) -bindingpro tein 4，hPEBP4)，其核苷酸序列和氨基酸可參見中國專利CN02136556. 3。它是通過從正常成人骨髓細胞體外原代培養(yǎng)獲得骨髓基質(zhì)細胞(Bone marrowstromal cell, BMSC)并構(gòu)建 BMSC cDNA文庫，利用cDNA文庫大規(guī)模測序的手段，從BMSC cDNA文庫中分離到的一種全長基因，屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)家族，在GenBank/EMBL數(shù)據(jù)庫中登錄(序列號為 AY037148)。hPEBP4蛋白包含227個氨基酸，其氨基酸序列在75-195位為典型的磷脂酰乙醇胺結(jié)合保守區(qū)域(PBP)。功能研究發(fā)現(xiàn)，hPEBP4能通過抑制Ras/Raf/MEK/ERK途徑、JNK活化和PE外翻來抑制TNFa誘導(dǎo)的細胞凋亡，這些功能均由其PE結(jié)合保守區(qū)域(PBP)介導(dǎo)。hPEBP4表達下調(diào)后能夠促進TNF-α誘導(dǎo)的乳腺癌細胞、前列腺癌細胞和卵巢癌細胞凋亡，提示hPEBP4很可能是治療hPEBP4高表達腫瘤的一個新的作用靶點。研究者通過組織芯片和免疫組化證實，在臨床腫瘤標本中，hPEBP4蛋白高表達于 50%以上的乳腺癌腫瘤組織中，而僅表達于4%的正常乳腺組織中。在人前列腺癌組織和卵巢癌組織中也發(fā)現(xiàn)hPEBP4蛋白的優(yōu)勢表達模式，提示hPEBP4很可能是一個相對特異性表達于腫瘤組織的腫瘤特異性/腫瘤相關(guān)抗原。因此，如果以hPEBP4為靶標，對機體進行免疫，將會使機體產(chǎn)生針對hPEBP4蛋白的特異性免疫應(yīng)答，從而使機體能有效地抑制、清除腫瘤細胞，為相關(guān)腫瘤的預(yù)防及治療提供措施。據(jù)此，本發(fā)明人前期已鑒定出來自hPEBP4的腫瘤抗原表位肽p40-48 (TLFCQGLEV) (SEQ ID N0:1)，其氨基酸序列見中國專利申請CN200510030532. 0。該表位肽在HLA-A2. 1/ Kb轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)和HLA-A2. 1陽性乳腺癌病人外周血中有較強的免疫原性，其誘導(dǎo)出的效應(yīng)細胞能特異性殺傷表達hPEBP4+/HLA-A2. I+的腫瘤細胞。細胞免疫在抗腫瘤和抗病毒免疫中起關(guān)鍵作用。T細胞識別的抗原是與細胞表面的MHC-I類或II類分子結(jié)合的肽，其長度約為8-12個氨基酸。而作為殺傷腫瘤細胞的主要效應(yīng)細胞CTL(細胞毒T淋巴細胞，Cytotoxic TLymphocytes)則識別與MHC-I類分子結(jié)合的內(nèi)源性肽。但是，許多能被CTL識別的天然腫瘤抗原肽的免疫原性都相對較弱。免疫原性的強弱與肽和MHC-I類分子親和力的高低有關(guān)。在一定程度上，親和力越高，其免疫原性越強。為了增強肽的免疫原性，可對肽序列中的某些位點的氨基酸進行置換以改善、優(yōu)化其與MHC-I類分子的親和力。經(jīng)過氨基酸置換后，應(yīng)保持表位肽的抗原特異性(即對野生型肽的特異性識別能力)不改變，但增強其免疫原性(即誘導(dǎo)體內(nèi)特異性CTL的殺傷能力)。氨基酸置換后的抗原肽已經(jīng)被用于癌癥病人，以改善了病人的抗腫瘤免疫應(yīng)答。然而，由于多肽氨基酸內(nèi)部的微小變化就會對其結(jié)構(gòu)和功能造成巨大的影響，甚至于使得多肽失去原有的活性(例如結(jié)合親和力)，并且對多肽序列中氨基酸的修飾和改變方式和組合紛繁蕪雜，要從眾多修飾中篩選獲得具有增強的活性(例如免疫活性)的修飾多肽并非易事。因此，本領(lǐng)域中仍然迫切需要在已知表位多肽的序列的基礎(chǔ)上開發(fā)出具有增強的免疫原性的修飾表位多肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種具有高免疫原性的合成肽及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種HLA-A2限制性表位多肽，所述多肽具有誘導(dǎo)細胞毒T細胞殺傷活性，且所述的多肽具有YLWCQLLEV(SEQ IDNO 2)的序列。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述多肽的序列為YLWCQLLEV(SEQ IDNO 2)。在本發(fā)明的第二方面中，提供一種重組蛋白，所述的重組蛋白含有如前所述的 HLA-A2限制性表位多肽。在一個優(yōu)選例中，所述重組蛋白的序列如SEQ ID NO 2所示。在本發(fā)明的第三方面中，涉及一種敏化的抗原遞呈細胞，所述的抗原遞呈細胞是被如前所述的HLA-A2限制性表位多肽致敏的。在一個優(yōu)選例中，所述抗原遞呈細胞選自下組樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞、成纖維細胞或內(nèi)皮細胞。在本發(fā)明的第四方面中，提供了一種制備敏化的抗原遞呈細胞的方法，所述方法包括用本發(fā)明的HLA-A2限制性表位多肽致敏抗原遞呈細胞。在一個優(yōu)選例中，所述抗原遞呈細胞選自下組樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞、成纖維細胞或內(nèi)皮細胞。在本發(fā)明的第五方面中，提供了一種組合物，所述的組合物含有(a)0. 001-99. 99wt%如前所述的HLA-A2限制性表位多肽或如前所述的敏化的抗原遞呈細胞；和(b)免疫學(xué)或藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述的組合物是藥物組合物，并且所述的載體、稀釋劑或賦形劑是藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在一個優(yōu)選例中，所述組分(a)的含量為0. 001-99. 99wt%，優(yōu)選0. 1-99. Owt %, 更優(yōu)選l_90wt%。在另一個優(yōu)選例中，所述組合物還包含一種或多種治療腫瘤的其它藥物，優(yōu)選所述藥物選自烷化劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、植物類抗癌藥、激素、或免疫制劑，更優(yōu)選 抗腫瘤抗生素，如阿霉素。在本發(fā)明的第六方面中，提供了一種用本發(fā)明的HLA-A2限制性表位多肽或敏化的抗原遞呈細胞的用途，其用于制備預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述腫瘤選自下組前列腺癌、乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、或膀胱癌、或卵巢癌。在本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明所述的HLA-A2限制性表位多肽的用途，它被用于制備包含該限制性表位多肽的重組蛋白(如融合蛋白)，或用于制備致敏的抗原提呈細胞。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明進行進一步闡述。

圖1 :H3W6L肽致敏的樹突狀細胞(DC)體內(nèi)誘導(dǎo)HLA-A2. 1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠細胞毒 T淋巴細胞的殺傷活性。圖2 1Y3W6L肽致敏的樹突狀細胞(DC)體內(nèi)誘導(dǎo)HLA-A2. 1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠細胞毒 T淋巴細胞IFN- γ分泌細胞情況。
具體實施例方式本發(fā)明人在對hPEBP4來源的表位肽P40-48進行分析(例如計算機模擬分析等) 的基礎(chǔ)上，通過對表位肽P40-48的氨基酸進行置換，選擇性地合成了眾多候選抗原肽，以期從中篩選出與HLA-A*0201高親和力結(jié)合并能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生更強的特異性CTL應(yīng)答的抗原肽。具體而言，發(fā)明人最初通過計算機模擬分析獲得了可能的候選序列。然而，通過計算機模擬預(yù)測所獲得的候選多肽的數(shù)量少則數(shù)百條，多則上千條。并且，發(fā)明人通過試驗證明了 在已知序列的不同位置、甚至包含部分相同位置進行置換的計算機模擬分析候選表位肽，其免疫原性與野生型相比可能并未得到有效的提高，甚至反而明顯降低，這就提示了在復(fù)雜的生物體系中計算機模擬預(yù)測的較高不確定性。因此，要從數(shù)量如此眾多、且生物效應(yīng)具有較高不確定性的候選多肽中篩選獲得高親和力、高免疫原性、能夠誘導(dǎo)更強的hPEBP4特異性細胞免疫應(yīng)答的多肽序列并非易事。發(fā)明人進一步通過T2肽結(jié)合實驗，從眾多序列中篩選出與HLA_A*0201具有強親合力的表位肽，并對其免疫原性進行評價，終于發(fā)現(xiàn)置換優(yōu)化后的表位肽1Y3W6L是 HLA-A0201限制性的hPEBP4抗原特異性的T細胞表位，其在體內(nèi)、外均可誘導(dǎo)出明顯強于野生肽(P40-48)的細胞毒性T效應(yīng)細胞。作為免疫原性提高而抗原特異性不變的氨基酸修飾的肽，表位肽1Y3W6L在乳腺癌或其他高表達hPEBP4的腫瘤的免疫治療中有著潛在的應(yīng)用價值。同時也為制備更高效力的腫瘤疫苗提供了新的實驗依據(jù)，對其腫瘤疫苗以及治療制劑的研制有重要的意義。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。HLA-A2限制性表位多肽如本文所用，“本發(fā)明多肽”、“ 1Y3W6L肽”、“置換的特異性多肽”等可互換使用，指將已鑒別的HLA-A2限制性表位多肽的氨基酸序列P40-48(SEQ ID NO 1)的第1位氨基酸殘基置換為“Y”、第3位氨基酸殘基置換為“W”且第6位氨基酸殘基置換為“L”所得的特異性多肽，該多肽序列入SEQ ID NO 2所示，即YLWCQLLEV。 此外，該術(shù)語還包括在其C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)， 較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸所形成的序列。例如，在本領(lǐng)域中，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。一種優(yōu)選的衍生多肽是在1TOW6L肽的上游添加對應(yīng)于hPEBP4中第36_39位的1 個或2個或3個或4個氨基酸(如D、ED、DED或LDED)，和/或在其下游添加對應(yīng)于hPEBP4 中第49-52位的1個或2個或3個或4個氨基酸(如F、FY、FYP或FYPE)。本發(fā)明多肽可用常規(guī)方法人工合成，也可用重組方法生產(chǎn)。本發(fā)明多肽也可用于與BSA等分子量的蛋白偶聯(lián)，從而形成多肽偶聯(lián)物。通常，所述的偶聯(lián)物由多肽、交聯(lián)劑、和BSA構(gòu)成，其中所述的交聯(lián)劑優(yōu)選戊二醛、EDAC。組合物本發(fā)明的多肽和偶聯(lián)物還可用于制備治療性的藥物組合物或預(yù)防性及治療性的疫苗組合物。因此，另一方面，本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有(a)安全有效量的本發(fā)明多肽、偶聯(lián)物或其組合物；以及(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明多肽的數(shù)量通常為 10微克-100毫克/劑，較佳地為100-1000微克/劑。本文所用的術(shù)語“有效量”指治療劑治療、緩解或預(yù)防目標疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測的治療或預(yù)防效果的量。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的性質(zhì)和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預(yù)先指定準確的有效量是沒用的。然而，對于某給定的狀況而言，可以用常規(guī)實驗來確定該有效量，臨床醫(yī)師是能夠判斷出來的。為了本發(fā)明的目的，有效的劑量為給予個體約0. 01毫克/千克至50毫克/千克， 較佳地0. 05毫克/千克至10毫克/千克體重的本發(fā)明多肽。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. , N. J. 1991) 43 ]" 到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑、及其組合。治療性組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外， 這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。此外，免疫組合物中還可以含有免疫佐劑。通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其直接給予對象。待預(yù)防或治療的對象可以是動物；尤其是人。本發(fā)明的含本發(fā)明多肽的治療或預(yù)防性藥物組合物(包括疫苗)，可以經(jīng)口服、皮下、皮內(nèi)、靜脈注射等方式應(yīng)用。治療劑量方案可以是單劑方案或多劑方案。
本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明的主要優(yōu)點在于本發(fā)明的表位肽是在已知HLA-A2限制性的細胞毒T淋巴細胞表位肽的基礎(chǔ)上經(jīng)氨基酸置換而得的，其與已知的表位肽相比，可更為有效地引起針對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答，這不僅對進一步深入研究腫瘤發(fā)病機制具有重要意義，而且對更強有效的腫瘤治療性疫苗以及治療制劑的研制均有重要的意義。實施例下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1. HLA-A * 0201高親和力肽的篩選本實施例通過肽結(jié)合實驗篩選出與HLA_A*0201具有高親和力的表位肽。試驗步驟首先，收集T2細胞(一種缺失抗原加工能力的細胞，購買自ATCC :CRL_1991)，用無血清1640培養(yǎng)基(購自^witrogen公司)洗三次后，調(diào)細胞濃度至2 X IO5個/ml，鋪于對孔板中，0. 5ml/孔。然后，加入50 μ M的候選多肽，2.5 μ g/ml的β 2微球蛋白(購自R&D 公司)于37°C，5% CO2孵箱中共孵育18h。孵育后的細胞用冰PBS (pH7. 2，PBS為緩沖液， 自配)洗三遍,加入 FITC 標記的 HLA-A2 特異性的 mAb BB7. 2 (Sterotec Ltd, Oxford,UK), 冰浴45分鐘，PBS洗后用流式細胞儀(Beckton Dickinson公司FACSCalibur)檢測平均熒光強度。以陽性已知肽CEA HLA-A2限制性表位多肽CAP-I (SEQ ID NO :9，序列為 YLSGANLNL)作為陽性對照，未加肽刺激的單純T2細胞作為背景對照。檢測方法免疫熒光法檢測肽與HLA_A*0201分子的結(jié)合情況，該方法基于外源性多肽與T2 細胞表面MHC-I類分子的結(jié)合可使其表面的MHC-I類分子的表達量增加的，兩者結(jié)合越穩(wěn)固，則可檢測到的MHC-I類分子的表達量越多，以平均熒光強度為檢測指標。結(jié)果以熒光系數(shù)(FI)作為衡量指標。
焚光碰(驢
背景平均熒光強度其中，多肽的FI > 1被認為是高親和力的表位。試驗結(jié)果免疫熒光法測得的hPEBP4蛋白來源多肽的T2-HLA_A*0201結(jié)合的親和力結(jié)果如表1所示。表中所示多肽為通過計算機軟件模擬分析(通過美國國立衛(wèi)生研究院生物信息及分子分析部(BIMAS)HLA 肽結(jié)合預(yù)測網(wǎng)站 http://bimas. dcrt. nih. gov/molbio/hla_ bind/index, html)獲得的部分候選序列，由上海吉爾生化有限公司人工合成。
本發(fā)明人從數(shù)條基于表位p40-48置換得到的優(yōu)化肽中篩選出HLA-A2高親和力的表位1Y3W6L，其序列為YLWCQLLEV(SEQ ID NO :2)。該表位肽與HLA_A*0201分子的親和力比野生型表位肽P40-48 (SEQ ID NO 1)顯著提高。表lhPEBP4蛋白來源多肽的T2_HLA_A * 0201結(jié)合的親和力
名稱序列FI值SEQ ID NOp40-48-WTTLFCQGLEV0.48±0.2211Y3W6LYLWCQLLEV1.48 士 0.6821F3W6IYLWCQILEV0.77±0.8531Y3W7FYLWCQGFEV0.65±0.3241Y6L7FYLFCQLFEV0.34±0.625IYYLFCQGLEV0.32±0.861Y7YYLFCQGYEV0.17±0.2271Y7FYLFCQGFEV0.15±0.238實施例2. HLA-A2. 1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)針對hPEBP4來源的HLA-A2限制性多肽特異性細胞毒T淋巴細胞的誘導(dǎo)效應(yīng)細胞的制備按常規(guī)方法(參照haba實驗室方法，Hnaba，K.等，J Exp Med. 1992 ；176 1693-1702])制備HLA-A2. 1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(DC)。收集培養(yǎng)(參照 Inaba實驗室方法，同上)至第7天的DC，調(diào)細胞濃度至1 X IO6個細胞/ml，加入表位肽(實施例1表1中的各表位肽，終濃度10 μ M/ml)及β 2微球蛋白(終濃度3 μ g/ml) ,37°C,5% CO2孵箱中孵育池。收集肽致敏的DC，用PBS(pH7.2，PBS為緩沖液，自配)洗三遍，調(diào)細胞濃度至 IX IO6個/0. 2ml(免疫用量即為0. 2ml)免疫轉(zhuǎn)基因小鼠(HLA-A2. 1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠，購自美國JaxMice，4-6周齡，雌性，每組5只)。每只小鼠腹腔注射0. ^il,共免疫三次，間隔一周。末次免疫后7天，無菌操作摘取小鼠脾臟，溶解紅細胞，制成單細胞懸液。將脾細胞懸液(5X IO6個/ml)與肽致敏的經(jīng)kiCo υ射線照射(總劑量為30Gy)的自體(即同一小鼠)樹突狀細胞以10 1比例(數(shù)量比)置于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 天后，收集效應(yīng)細胞。檢測方法(1)特異性殺傷活性的檢測本實施例采用了標準的4小時51Cr釋放試驗檢測特異性殺傷活性。分別用負載P40-48WT表位肽的T2細胞、負載了無關(guān)肽SSp-I (無關(guān)對照，SEQ ID NO 10)的T2細胞及未加任何多肽負載的T2細胞作為靶細胞(即作為實施例2制備的效應(yīng)細胞的靶細胞)，加入51Cr (Na251CrO4,100 μ Ci/106個細胞)，置37°C水浴中標記90分鐘，每間隔15分鐘輕混勻一次。PBS洗3遍，徹底洗去殘余Na251CrO4,將標記好的靶細胞用完全 1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1 X IO5個細胞/ml，加入96孔圓底板，每孔100 μ 1。按50 1、25 1和12. 5 1 (數(shù)量比)三個不同效靶比加入效應(yīng)細胞，37°C孵育 4小時，收集各孔上清各100μ 1，用Y計數(shù)儀(Wallac公司1470)檢測cpm值(countsper minute每分鐘計數(shù))。按下式計算特異性裂解率或殺傷率
特異性裂解率(％)= ^gSr^fSSSr xl00%
最大釋放組cpm -自發(fā)釋放組cpm其中，最大釋放組各孔為單獨的靶細胞加100 μ 1 1% SDS ；自發(fā)釋放孔為單獨的靶細胞加100 μ 1完全培養(yǎng)基。(2)肽特異性CTL IFN-Y釋放的檢測用商業(yè)化的試劑盒進行ELISP0T檢測(購自R&D公司)。將1 X IO5個效應(yīng)細胞加入包被有特異性抗小鼠IFN- γ單克隆抗體的96孔平底硝酸纖維素板中，同時加入Ρ40-48 野生型表位肽刺激的Τ2細胞(1 X IO4個)、無關(guān)肽SSp-I刺激的Τ2細胞或未刺激的Τ2細胞，37°C 5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)M小時。移去細胞，洗板4次甩干，加入生物素化的抗小鼠IFN-γ特異性抗體，4°C孵育過夜；洗板4次甩干，再加入堿性磷酸酶標記的鏈親和素，室溫作用2小時；洗板4次甩干，加入底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍四唑(BCIP/NBT)， 室溫避光作用lh，棄去顯色液，雙蒸水清洗，終止反應(yīng)。參照試劑盒說明書的方法檢測分泌 IFN-Y的T細胞集落。以上每一檢測均設(shè)3個復(fù)孔，計數(shù)時取3復(fù)孔的均值。該數(shù)值顯示檢測到的可釋放IFN-γ的特異性CTL數(shù)量。試驗結(jié)果結(jié)果顯示，優(yōu)化表位肽H3W6L致敏的樹突狀細胞免疫小鼠后，產(chǎn)生的CTL能有效殺傷負載野生型表位肽的T2細胞，而且優(yōu)化表位肽1TOW6L的殺傷靶細胞的效果明顯高于野生型表位肽(見圖1，*，P < 0. 01)。優(yōu)化表位肽1TOW6L刺激后檢測到有明顯的IFN- γ釋放的效應(yīng)細胞(CTL)數(shù)量也明顯高于野生型表位肽(見圖2，*，P < 0. 01)。以上結(jié)果表明優(yōu)化表位肽1Y3W6L在體內(nèi)誘導(dǎo)出特異性識別野生型表位肽CTL的能力(即免疫原性)要明顯高于野生型表位肽。該試驗是用效應(yīng)細胞來殺傷靶細胞，靶細胞是負載野生型表位肽的Τ2細胞，效應(yīng)細胞是實施例1中制備的多肽致敏的轉(zhuǎn)基因小鼠來源樹突狀細胞體內(nèi)刺激得到的殺傷性T 細胞(存在于脾細胞中)。優(yōu)化表位肽1TOW6L致敏的樹突狀細胞刺激得到T細胞能夠特異性殺傷負載有野生型表位肽的Τ2細胞，這表示優(yōu)化表位肽1TOW6L比野生型表位肽能夠更有效地誘導(dǎo)出 hPEBP4野生型表位肽特異性的殺傷性T細胞，從而證明了優(yōu)化表位肽1Y3W6L在保持了抗原特異性不變的基礎(chǔ)上具有更高的免疫原性，能夠誘導(dǎo)更強的hPEBP4特異性細胞免疫應(yīng)答。此外，上述結(jié)果也顯示不同位置(如SEQ ID NOs :3_8)、甚至包含部分相同位置置換(如SEQ ID N0:3的多肽)的其它優(yōu)化表位肽，其免疫原性與野生型相比并未得到有效的提高，甚至反而明顯降低，這就提示了在復(fù)雜的生物體系中計算機模擬預(yù)測具有較高的不確定性。并且，通過計算機模擬預(yù)測可獲得候選多肽的數(shù)量少則數(shù)百條，多則上千條，要從數(shù)量如此眾多、且生物效應(yīng)具有較高不確定性的候選多肽中篩選獲得高親和力、高免疫原性、能夠誘導(dǎo)更強的hPEBP4特異性細胞免疫應(yīng)答的多肽序列并非易事。實施例3.優(yōu)化表位肽1TOW6L致敏的人外周血單核細胞來源DC的培養(yǎng)HLA-A2. l+/hPEBP4+乳腺癌病人抗凝外周全血通過淋巴細胞分離液 (Ficoll-Histopaque 1.077，購自Sigma公司)密度梯度離心(室溫，400 X g，30分鐘)， 取界面細胞，置入50ml離心管中，用無鈣鎂PBS (pH7. 2) -EDTA QmM)懸浮細胞，之后離心 (300 X g，10分鐘)洗細胞一次，棄上清，無鈣鎂PBS重懸細胞，再次離心QOO X g，5分鐘) 洗細胞2次，獲得人外周血單個核細胞(PBMC)。用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的RPMI1640)懸浮PBMC，按1 X IO7細胞/孔鋪于 6孔板，37°C、5% CO2孵育2小時后，輕輕吸出懸浮細胞，用預(yù)溫的培養(yǎng)基小心洗6孔板三遍 (此部分細胞連同吸出的懸浮細胞凍存?zhèn)溆?，剩下的細胞即為貼壁的單核細胞。貼壁細胞在含人重組rhGM-CSF(500U/ml)和人重組rhIL_4 (10ng/ml)(購自R&D公司)的完全培養(yǎng)基中37°C、5% CO2進行培養(yǎng)。第3天補充完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。收集上述培養(yǎng)至第6天的hPEBP4+/HLA_A*0201+乳腺癌患者外周血單核細胞來源的 DC，用人 DC 完全培養(yǎng)基(RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，500U/mlrhGM-CSF、10ng/ml rhIL-4)調(diào)整細胞濃度為2 X IO5個細胞/ml濃度，Iml/孔分入M孔板，加入20 μ M優(yōu)化表位肽1TOW6L， 4小時后收集細胞，棄培養(yǎng)基上清，用RPMI1640培養(yǎng)基離心洗滌細胞兩次以除去原培養(yǎng)基中存在的刺激物，最后將2 X IO5個細胞懸浮在0. 5ml人DC完全培養(yǎng)基中，即為優(yōu)化表位肽 1Y3W6L致敏的人外周血單核細胞來源DC。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種HLA-A2限制性表位多肽，其特征在于，所述多肽具有誘導(dǎo)細胞毒T細胞殺傷活性，且所述的多肽的序列如SEQ ID NO 2所示，為YLWCQLLEV。
2.一種重組蛋白，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的HLA-A2限制性表位多肽。
3.一種敏化的抗原遞呈細胞，其特征在于，所述抗原遞呈細胞是被權(quán)利要求1所述的 HLA-A2限制性表位多肽致敏的。
4.如權(quán)利要求3所述的抗原遞呈細胞，其特征在于，所述的抗原遞呈細胞選自下組樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞、成纖維細胞或內(nèi)皮細胞。
5.一種制備敏化的抗原遞呈細胞的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1所述的HLA-A2 限制性表位多肽致敏抗原遞呈細胞。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的抗原遞呈細胞選自下組樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞、成纖維細胞或內(nèi)皮細胞。
7.一種組合物，其特征在于，它含有(a)0.001-99. 99襯％權(quán)利要求1所述的HLA-A2限制性表位多肽或權(quán)利要求3所述的敏化的抗原遞呈細胞；和(b)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述的組合物是藥物組合物，并且所述的載體、稀釋劑或賦形劑是藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
9.一種權(quán)利要求1所述的HLA-A2限制性表位多肽或權(quán)利要求3所述的敏化的抗原遞呈細胞的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述腫瘤選自下組前列腺癌、乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、或膀胱癌。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的HLA-A2限制性表位多肽及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及序列為YLWCQLLEV的HLA-A2限制性表位多肽(即1Y3W6L肽)，以及該表位及其相關(guān)的重組蛋白、編碼核苷酸序列、抗原遞呈細胞、組合物在表達人磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白4(hPEBP4)的腫瘤治療及預(yù)防中的用途。
文檔編號A61P35/00GK102250208SQ20101017702
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者孫偉紅, 曹雪濤, 李楠 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)