專利名稱：一種全細(xì)胞高效催化木糖轉(zhuǎn)化制取木糖酸(鹽)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及木糖酸(鹽)的制備方法，特別涉及一種全細(xì)胞高效催化木糖轉(zhuǎn)化制取木糖酸(鹽)的方法。
背景技術(shù)：
木糖的高效轉(zhuǎn)化與利用是木質(zhì)纖維類原料加工與利用，尤其是其生物煉制的關(guān)鍵性技術(shù)瓶頸。目前，木糖生物轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn) 品形式有燃料こ醇、木糖醇、木糖酸(鹽)、乳酸、丁ニ酸和飼料酵母等。除木糖酸(鹽)以外，受市場容量、環(huán)境污染和現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)水平的局限，目前其它產(chǎn)品的發(fā)展空間都十分有限。木糖酸(鹽)與葡萄糖酸(鹽)的性能相近，可用作檸檬酸和葡萄糖酸等產(chǎn)品的替代品，它作為一種新興的生物基化學(xué)品近年來它的用途被不斷地發(fā)掘和拓展，主要的應(yīng)用市場有水泥減水劑、分散劑和緩釋劑、混凝土黏接劑、增塑劑、玻璃清洗劑、冶金除銹劑、金屬離子螯合劑和紡織助漂劑等，還被用于粘膠纖維混紡以生產(chǎn)夏季冰爽纖維面料。其中，尤其是木糖酸(鹽)在水泥減水劑和混凝土黏結(jié)劑領(lǐng)域的應(yīng)用具有巨大的市場容量和廣闊的發(fā)展前景。理論上可通過化學(xué)法、酶法和微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化木糖生成木糖酸(鹽)(鹽)?；瘜W(xué)法主要是碘或鈀催化法，反應(yīng)條件苛刻，環(huán)境污染大，且催化劑易失活，生產(chǎn)成本高。酶法主要是指葡萄糖氧化酶(EC I. I. 3. 4)和木糖脫氫酶(EC I. I. I. 175和EC I. I. I. 179)，都存在著酶的底物專ー性限制、酶用量大、反應(yīng)速率低和生產(chǎn)成本昂貴的嚴(yán)重不足。當(dāng)前已經(jīng)報道的木糖微生物發(fā)酵產(chǎn)木糖酸(鹽)的木糖濃度最高值不超過13% (質(zhì)量濃度，g/mL)，木糖利用率和木糖酸(鹽)轉(zhuǎn)化率最高值分別為90%和95%。因此，現(xiàn)有化學(xué)合成法和酶法轉(zhuǎn)化木糖產(chǎn)木糖酸(鹽)都不具備エ業(yè)化生產(chǎn)的條件，而微生物發(fā)酵法仍需要進(jìn)ー步提高反應(yīng)體系的底物和產(chǎn)物濃度、原料利用率和轉(zhuǎn)化率，才能保證木糖乃至木質(zhì)纖維原料生物煉制的エ業(yè)化生產(chǎn)的整體經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種全細(xì)胞高效催化木糖轉(zhuǎn)化制取木糖酸(鹽)的方法，以實現(xiàn)提高底物木糖和產(chǎn)物木糖酸(鹽)的濃度，提高設(shè)備的生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本，提高整體經(jīng)濟(jì)效益。技術(shù)方案為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種全細(xì)胞高效催化木糖轉(zhuǎn)化制取木糖酸(鹽)的方法，包括以下步驟
(1)在液體深層通風(fēng)反應(yīng)體系中加入初始反應(yīng)基質(zhì)，接入氧化葡萄糖酸桿菌iGluconabacter ァt/a/75·),攪拌通風(fēng)連續(xù)發(fā)酵,保持反應(yīng)體系的溶氧濃度不低于10% ;其中，在初始反應(yīng)基質(zhì)中含有木糖和必要的無機(jī)鹽，木糖的質(zhì)量濃度大于13%，不高于15% ;初始發(fā)酵體系的PH值不低于3. O;
(2)采用半連續(xù)或連續(xù)分批添料方式，向發(fā)酵體系中添加木糖或木糖溶液，控制反應(yīng)體系中的木糖質(zhì)量濃度不高于25%，并同步調(diào)控pH值；
(3)添加至反應(yīng)體系木糖累積加入質(zhì)量濃度達(dá)到30%，停止添加，繼續(xù)催化反應(yīng)直至木糖利用率達(dá)到98%以上，木糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%以上。所述的氧化葡萄糖酸桿菌為ATCC 621-H菌株，或以ATCC 621-H菌株為宿主菌的基因重組菌株，或以ATCC 621-H菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行馴化改良后的菌株，接入量為使發(fā)酵體系的 OD6tltlnm= 1.0。所述分批添加木糖是指固體木糖或高濃度木糖液，同步調(diào)控所使用的堿性中和劑是指含有鈣、鈉、鉀、鎂、銨等離子的堿性固體或濃溶液，尤其是以粉狀固體碳酸鈣和碳酸鈉為最優(yōu)。采用同步操作可簡化工藝，降低勞動強(qiáng)度。該全細(xì)胞高效催化木糖轉(zhuǎn)化制取木糖酸(鹽)的方法，針對木糖酸(鹽)微生物發(fā)酵過程中存在的底物、產(chǎn)物和低PH值的抑制作用，充分利用氧化葡萄糖酸桿菌類微生物細(xì)胞所具有的木糖轉(zhuǎn)運、糖氧化酶及輔酶等復(fù)合酶系，以全細(xì)胞作為催化體系，在液體深層通風(fēng) 反應(yīng)體系中通過半連續(xù)或連續(xù)式操作方式，分批同步添加木糖和堿性中和剤，一方面消除上述的抑制作用，另ー方面利用全細(xì)胞催化體系實現(xiàn)定向高效催化木糖生成木糖酸(鹽)，進(jìn)而極顯著地提高底物木糖和產(chǎn)物木糖酸(鹽)的濃度，顯著提高設(shè)備的生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用全細(xì)胞催化木糖轉(zhuǎn)化制取木糖酸(鹽)的方法，通過連續(xù)或半連續(xù)分批同步添料的操作方式實現(xiàn)對反應(yīng)體系的控制和定向催化，極顯著地提高了底物木糖和產(chǎn)物木糖酸(鹽)的反應(yīng)濃度，顯著提高了設(shè)備的生產(chǎn)效率和大幅度降低了木糖酸(鹽)的生產(chǎn)成本，其中，底物木糖的累積濃度最高值可達(dá)到30%，木糖的最聞利用率超過99% ;廣物木糖酸(鹽)的最聞濃度值可達(dá)到29. 8%,木糖酸的轉(zhuǎn)化率最聞值可達(dá)到100%ο


圖I是全細(xì)胞催化木糖轉(zhuǎn)化制取木糖酸(鹽)的反應(yīng)歷程圖；圖中，橫座標(biāo)為反應(yīng)時間(h)，縱座標(biāo)為木糖和木糖酸(鹽)的質(zhì)量濃度。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)ー步的說明。以下實施例所使用的氧化葡萄糖酸桿菌為ATCC621-H菌株，來源于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American type culture collection, ATCC)。其中，氧化葡萄糖酸桿菌NL71以ATCC 621-H菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行長期馴化選育的菌株；馴化方法采用真實木質(zhì)纖維稀酸水解液逐級增濃、平板篩選和搖瓶振蕩發(fā)酵的測定方法；所得到的氧化葡萄糖酸桿菌NL71可直接發(fā)酵含有5(Tl00g/L木糖的玉米秸桿、楊木原料的稀酸水解液。稀酸水解液的制備方法全玉米稻桿剪切至3 5cm或楊木切片至長X寬X厚為3cmXl. 5cmX0. 5cm,按固液比I 3. 8 10 (質(zhì)量比)加入1.0%硫酸(w/w)，于15(Tl80°C反應(yīng)O. 2 2. 0h，過濾并洗滌得稀酸水解液，再經(jīng)常規(guī)減壓蒸發(fā)濃縮可得濃縮液。以下實施例中，木糖和木糖酸(鹽)的測定方法采用高效液相離子色譜測定法，參照中國專利申請201210012963. 4，包括在美國Dionex ICS-3000離子色譜系統(tǒng)上采用CarboPacTM PAlO色譜柱帶保護(hù)柱進(jìn)行測定。柱溫30°C，自動上樣，進(jìn)樣體積10. O μ L ;以18 mmol/L、200 mmol/L氫氧化鈉和500 mmol/L醋酸鈉為淋洗液進(jìn)行ニ元梯度淋洗,流速為
O.3 mL/min,在O 10 min內(nèi)以18 mmol/L氫氧化鈉溶液進(jìn)行等度洗脫；10 20 min內(nèi)醋酸鈉溶液淋洗的濃度梯度為50 200 mmol/L，氫氧化鈉溶液淋洗的濃度梯度為65. 4 70. 8 mmol/L ;采用20 40 min內(nèi)氫氧化鈉溶液淋洗的濃度為200 mmol/L對交換柱進(jìn)行再生；采用40 50 min內(nèi)氫氧化鈉溶液淋洗的濃度為18 mmol/L對交換柱進(jìn)行平衡；電化學(xué)檢測器檢測模式為金工作電極和pH-Ag/AgCl復(fù)合型參比電扱。采用外標(biāo)法以積分和脈沖安培檢測法和色譜峰面積積分法測定和計算各物質(zhì)的濃度含量。實施例I 在3. OL全自動機(jī)械攪拌通風(fēng)式發(fā)酵罐中，加入初始木糖質(zhì)量濃度為9. 5%的木糖溶液1500mL，加入0. 4 8/1硫酸鎂，1.5 g/L磷酸氫ニ鉀和I. O g/L硫酸銨，控制攪拌速率為300r/min，通入無菌壓縮空氣至溶解氧濃度為10% 50%，接入活化后的氧化葡萄糖酸桿菌NL71至細(xì)胞濃度為OD6tltol = I. 0，加入粉狀碳酸鈣調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH6. 5左右，進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)。實時監(jiān)測反應(yīng)體系的pH值和木糖濃度，每隔2(T24h分3批同步加入約IOOg粉狀固體木糖和碳酸鈣，控制PH值為3. (Γ6. 5和木糖質(zhì)量濃度不高于18% (g/mL)。如圖1，反應(yīng)至192h，反應(yīng)體系的木糖質(zhì)量濃度低于0. 12%，木糖酸(鹽)的質(zhì)量濃度為28. 4%。向反應(yīng)體系累計添加底物木糖的質(zhì)量濃度達(dá)到28. 6%。木糖利用率達(dá)到99%，木糖酸(鹽)和轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%。實施例2
在10. OL全自動機(jī)械通風(fēng)攪拌式發(fā)酵罐中，加入初始木糖質(zhì)量濃度為15%的木糖溶液4L，加入0. 4 g/L硫酸鎂，I. 5 g/L磷酸氫ニ鉀和1.0 g/L硫酸銨，控制攪拌速率為280r/min，通入無菌壓縮空氣至溶解氧濃度為10°/Γ50%，接入活化后的ATCC 621-Η菌株至細(xì)胞濃度為OD6tltlnm = I. I，加入粉狀碳酸鈣調(diào)節(jié)反應(yīng)體系ρΗ6. 5左右，進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)。實時監(jiān)測反應(yīng)體系的pH值和木糖濃度，連續(xù)加入固體木糖，并實時控制pH值為
3.(Γ6. 5和木糖質(zhì)量濃度不高于25%。添加至反應(yīng)體系木糖累積加入質(zhì)量濃度達(dá)到30%，停止添加，反應(yīng)至木糖質(zhì)量濃度低于0. 2%，測定木糖酸(鹽)的質(zhì)量濃度為29. 7%。木糖利用率達(dá)到99%，木糖酸(鹽)和轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%。實施例3
在100 L全自動機(jī)械通風(fēng)攪拌式發(fā)酵罐中，加入初始木糖質(zhì)量濃度為14%的木糖溶液70L，加入0. 4 g/L硫酸鎂，I. 5 g/L磷酸氫ニ鉀和I. O g/L硫酸銨，控制攪拌速率為220r/min，通入無菌壓縮空氣至溶解氧濃度為15°/Γ40%，接入活化后的ATCC 621-Η菌株至細(xì)胞濃度為OD6tltlnm = I. I，加入粉狀碳酸鈣調(diào)節(jié)反應(yīng)體系ρΗ6. 5左右，進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)。實時監(jiān)測反應(yīng)體系的pH值和木糖濃度，分批加入高濃度木糖溶液，并實時控制pH值為3. (Γ6. 5和木糖質(zhì)量濃度不高于20%。添加至反應(yīng)體系木糖累積加入質(zhì)量濃度達(dá)到29. 2%,停止添加，反應(yīng)至木糖質(zhì)量濃度低于0. 2%，測定木糖酸的質(zhì)量濃度為29. 0%。木糖利用率達(dá)到99%，木糖酸(鹽)和轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%ο
權(quán)利要求
1.一種全細(xì)胞高效催化木糖轉(zhuǎn)化制取木糖酸(鹽)的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)在液體深層通風(fēng)反應(yīng)體系中加入初始反應(yīng)基質(zhì)，接入氧化葡萄糖酸桿菌，攪拌通風(fēng)連續(xù)發(fā)酵，保持反應(yīng)體系的溶氧濃度不低于10%;其中，在初始反應(yīng)基質(zhì)中含有木糖和必要的無機(jī)鹽，木糖的質(zhì)量濃度大于13%，不高于15% ;初始反應(yīng)體系的pH值不低于3. 0 ； (2)采用半連續(xù)或連續(xù)分批添料方式，向發(fā)酵體系中添加木糖或木糖溶液，控制反應(yīng)體系中的木糖質(zhì)量濃度不高于25%，并同步調(diào)控pH值； (3)添加至反應(yīng)體系木糖累積加入質(zhì)量濃度達(dá)到30%，停止添加，繼續(xù)催化反應(yīng)直至木糖利用率達(dá)到98%以上，木糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的全細(xì)胞高效催化木糖轉(zhuǎn)化制取木糖酸(鹽)的方法，其特征在于所述的氧化葡萄糖酸桿菌接入量為使反應(yīng)體系的OD6tltlnm = I. (Tl. I?！?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的全細(xì)胞高效催化木糖轉(zhuǎn)化制取木糖酸(鹽)的方法，其特征在于采用含有鈣、鈉、鉀、鎂或銨離子的堿性固體或濃溶液同步調(diào)控反應(yīng)體系的PH值。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的全細(xì)胞高效催化木糖轉(zhuǎn)化制取木糖酸(鹽)的方法，其特征在于所述的氧化葡萄糖酸桿菌為ATCC 621-H菌株，或以ATCC 621-H菌株為宿主菌的基因重組菌株，或以ATCC 621-H菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行馴化改良后的菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種全細(xì)胞高效催化木糖轉(zhuǎn)化制取木糖酸(鹽)的方法，在液體深層通風(fēng)反應(yīng)體系中加入初始反應(yīng)基質(zhì)，接入氧化葡萄糖酸桿菌，攪拌通風(fēng)連續(xù)反應(yīng)，保持反應(yīng)體系的溶氧濃度不低于10%；采用半連續(xù)或連續(xù)分批添料方式，向反應(yīng)體系中添加木糖或木糖溶液，控制反應(yīng)體系中的木糖質(zhì)量濃度不高于25%，并同步調(diào)控pH值不低于2.8；添加至反應(yīng)體系木糖累積加入質(zhì)量濃度達(dá)到30%，停止添加，繼續(xù)催化反應(yīng)完全可得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物木糖酸(鹽)產(chǎn)品。該方法的底物木糖的累積濃度最高值可達(dá)到30%，木糖的最高利用率超過99%；發(fā)酵產(chǎn)物木糖酸(鹽)的最高濃度值可達(dá)到29.8%，木糖酸(鹽)的轉(zhuǎn)化率最高值可達(dá)到100%。
文檔編號C12R1/01GK102676608SQ201210191920
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者余世袁, 勇強(qiáng), 徐勇, 王滎 申請人:南京林業(yè)大學(xué)