專利名稱：大規(guī)模生產(chǎn)二(尿苷5'－四磷酸)及其鹽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)治療性二核苷酸(包括其新的鹽)的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及合成P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)(即二尿苷四磷酸U2P4)的比現(xiàn)有生產(chǎn)方法更好的方法。
背景技術(shù)：
P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)是一種具有以下結(jié)構(gòu)的二核苷酸式I

其中X是Na，NH4或H，條件是所有X基團均不是H。
P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的游離酸(當(dāng)X為氫時)以前已經(jīng)被描述成尿苷5′-(五氫四磷酸)、P→尿苷5′酯(CAS登記號59985-21-6；C.Vallejo等人，Biochimica etBiophysica Acta 438，305(1976)和H.Coste等人，J.Biol.Chem.262，12096(1987))。
現(xiàn)已描述了不同方法來合成嘌呤二核苷酸如二腺苷四磷酸(A2P4)(E.Rappaport等人，Proc.Natl.Acad.Sci.78，838，(1981)；A.Guranowski等人，Biochemistry，27，2959，(1988)；C.Lobaton等人，Eur.J.Biochem.，50，495，1975；K.Ng和L.Orgel，Nucl.AcidRes.，15，，3573，(1987))。然而，作為嘧啶核苷酸的U2P4并非如此。盡管嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸看上去是類似的，但是用于合成嘌呤核苷酸的方法不一定能用于嘧啶(如尿苷)。
二尿苷四磷酸已經(jīng)在治療各種疾病(如慢性阻塞性肺病(COPD))中表現(xiàn)出有利的性質(zhì)。例如，已經(jīng)證明，它們有助于清除對象肺部的粘液分泌，這些對象例如是如出于各種原因(包括囊性纖維化、慢性支氣管炎、哮喘、支氣管擴張、手術(shù)后粘液滯留、肺炎、原發(fā)性睫狀運動障礙)(M.J.Stutts，III等人，美國專利No.5,635,160；PCT國際公開WO 96/40059)需要治療的哺乳動物(包括人)，并且還有助于預(yù)防和治療臥床患者的肺炎(K.M.Jacobus和H.J.Leighton，美國專利No.5,763,447)。其它治療用途包括治療竇炎(PCT國際公開WO 98/03177)、中耳炎(PCT國際公開WO 97/29756)、干眼病、視網(wǎng)膜脫落、鼻管阻塞，通過增加粘膜分泌和上皮表面的水合作用治療女性不育和由于陰道干燥引起的刺激，以及提高運動員的成績。
U2P4還可用作哺乳動物諸如(但不局限于)狗、貓和馬的獸用產(chǎn)品。
現(xiàn)有技術(shù)中只描述了一種生產(chǎn)二尿苷四磷酸的方法。該方法非常耗時，持續(xù)5天，并且只產(chǎn)生了少量的二尿苷四磷酸(C.Vallejo等人，Biochimica et Biophysica Acta438，305(1976)，Sillero等人，Eur J Biochem 76，332(1972))。根據(jù)該技術(shù)，二尿苷四磷酸是通過尿苷5′-單磷酸嗎啉酯(monophosphomorpholidate)(0.54毫摩爾)和焦磷酸三乙胺鹽(0.35毫摩爾)在無水吡啶介質(zhì)(10毫升)中反應(yīng)合成的。30℃下5天后，用蒸餾法從反應(yīng)混合物中除去吡啶，將殘余物重懸于玻璃蒸餾水(glass-destilled water)(8毫升)中，將懸浮液施加到DEAE-纖維素柱(37.5×2.6cm)中，用3.2升線性梯度(0.06-0.25M，pH8.6)的碳酸氫銨分級。按照下列標準鑒定出0.17-0.19M碳酸氫銨之間洗脫出的峰部分是U2P4對堿性磷酸酶不敏感，磷與堿的比例，以及在用磷酸二酯酶I處理后在檸檬酸緩沖液(pH5.0)中電泳分析水解產(chǎn)物(UTP+UMP)。沒有給出得率或光譜數(shù)據(jù)。因此，現(xiàn)有二尿苷四磷酸的合成方法是耗時的，并且只產(chǎn)生了少量僅部分經(jīng)鑒定的二尿苷四磷酸。本發(fā)明側(cè)重于這一醫(yī)學(xué)上有用的化合物的生產(chǎn)方法，該方法更有效，操作更方便，并且可用于大規(guī)模生產(chǎn)二尿苷四磷酸及其鹽。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種合成治療性二核苷酸P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)(式I)的新方法，并且證明該方法可適用于大量生產(chǎn)。本發(fā)明的方法大大減少了合成二尿苷四磷酸所需的時間，較佳的為3天或更少。用這些方法制得的新的P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的銨鹽和鈉鹽穩(wěn)定、易溶、無毒，且生產(chǎn)時容易處理。四銨鹽是較佳的；四鈉鹽是最佳的。
式I

其中X是Na，NH4或H，條件是并非所有的X基團均為H。
合成式I化合物以及其藥學(xué)上可接受的鹽的方法通常按照下列步驟進行1)將式IIa-d的尿苷或尿苷核苷酸化合物溶解在極性、質(zhì)子惰性的有機溶劑和疏水性胺中；2)用式IVa-b的磷酸化試劑磷酸化和/或用式IIIa-c的活化試劑活化；和3)用離子交換層析純化。
本發(fā)明的另一方面是治療各種疾病癥狀的方法，這些癥狀包括，但不局限于慢性阻塞性肺病、竇炎、中耳炎、鼻管阻塞、干眼病、視網(wǎng)膜脫落、肺炎和由于陰道干燥引起的女性不育或刺激。
本發(fā)明另一方面是一種藥物組合物，該組合物包含式I的化合物以及藥學(xué)上可接受的載體。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種合成治療性二核苷酸P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的新方法，并且證明該方法可適用于大量生產(chǎn)。本發(fā)明的方法大大減少了合成二尿苷四磷酸所需的時間，較佳的為3天或更少。用這些方法制得的P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的銨鹽和鈉鹽穩(wěn)定、易溶、無毒，且生產(chǎn)時容易處理。
本發(fā)明還提供了式I化合物式I

其中
X是Na，NH4或H，條件是并非所有的X基團均為H。
P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的鈉鹽和銨鹽有許多優(yōu)點。與催化磷酸酯水解的二價陽離子(例如Ca2+，Mg2+，Mn2+)的鹽相比，鈉鹽和銨鹽提供了優(yōu)良的長期穩(wěn)定曲線。P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的四鈉鹽對肺和眼睛沒有刺激性。其它陽離子對肺和眼睛以及其它粘膜上皮可能有刺激性，或不能被人體很好地耐受。與疏水性胺鹽(如三和四丁基銨)和類似的鹽相比，這些無機鈉鹽和銨鹽提供了優(yōu)秀的水溶性。高的水溶解度對配制不同濃度的藥劑的靈活性來說是一個重要的優(yōu)點。P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的四銨鹽和四鈉鹽的優(yōu)點還在于它們易用不采用有機溶劑的水性離子層析來純化。另外，與一些油狀或膠狀胺鹽相比，這些鹽易處理成絨毛、白色固體。
四鈉鹽是較佳的。
式I化合物可有助于清除對象肺部的粘液分泌，這些對象例如是如出于各種原因(包括囊性纖維化、慢性支氣管炎、哮喘、支氣管擴張、手術(shù)后粘液滯留、肺炎、原發(fā)性睫狀運動障礙)(M.J.Stutts，III等人，美國專利No.5,635,160；PCT國際公開WO 96/40059)需要治療的哺乳動物(包括人)，并且還有助于預(yù)防和治療臥床患者的肺炎(K.M.Jacobus和H.J.Leighton，美國專利No.5,763,447)。其它治療用途包括治療竇炎(PCT國際公開WO 98/03177)、中耳炎(PCT國際公開WO 97/29756)、干眼病、視網(wǎng)膜脫落、鼻管阻塞，通過增加粘膜分泌和上皮表面的水合作用治療由于陰道干燥引起的女性不育和刺激，以及提高運動員的成績。
式I化合物可以含有常規(guī)無毒、藥學(xué)上可接受的載體、佐劑和賦形劑的劑量單位配方口服、外用、腸胃外、吸入或噴霧、手術(shù)內(nèi)、直腸內(nèi)或鞘內(nèi)給藥。本文所用的術(shù)語“外用”包括藥膏、凝膠、乳膏、油膏、栓劑、陰道栓劑或滴鼻、滴耳或滴眼。本文所用的術(shù)語“腸胃外”包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或灌輸。另外，還提供了一種包含通式I化合物以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物配方。一種或多種通式I化合物可以與一種或多種無毒的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑或佐劑組合，如果需要，還可以有其它活性組分組合。一種這樣的載體是糖，在用于肺或氣管輸遞時，化合物可通過玻璃化(glassification)直接摻入基質(zhì)中或簡單地與載體(如乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖)或其它可接受的賦形劑混合。
通式I的一種或多種化合物可以分開或一起給藥，或是和粘液溶解物如DNA酶(Pulmozyme)或乙酰半胱氨酸、抗生素(包括但不局限于吸入用Tobramycin)、非類固醇抗炎劑、抗病毒劑、疫苗、減充血劑和皮質(zhì)類固醇分開或一起給藥。
含有通式I的化合物的藥物組合物可以是適用于口服的形式，例如是片劑、膠囊劑、錠劑、水性或油性懸液、可分散的粉末或顆粒、乳劑、硬或軟的膠囊、或糖漿或酏劑。打算口服使用的組合物可以按照生產(chǎn)藥物組合物領(lǐng)域的任何已知方法來制備，這些組合物可含有一種或多種選自增甜劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑的試劑，以便提供藥學(xué)上美觀適口的制劑。片劑含有活性組分，該活性組分與適用于生產(chǎn)片劑的無毒的藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。這些賦形劑例如可以是惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；?；头鬯閯┤缬衩椎矸刍蚝Ｔ逅?；粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；和潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可以沒有包層的，或可按已知技術(shù)包層以延遲在腸胃道中的分解和吸收，從而在更長的時間內(nèi)提供緩釋的作用。例如，可采用延長時間的材料如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服用配方還可以為硬的明膠膠囊，其中活性組分與惰性固體稀釋劑(例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合；或是軟的明膠膠囊，其中活性組分與水或油介質(zhì)(例如花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。
水性懸浮液含有的活性物質(zhì)與適用于生產(chǎn)水性懸浮液的賦形劑相混合。這些賦形劑是懸浮劑，例如是羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素和海藻酸鈉。分散劑或潤濕劑可以是天然存在的磷脂或丙炔化氧和脂肪酸的縮合產(chǎn)物、或環(huán)氧乙烷和長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物、或環(huán)氧乙烷和由脂肪酸與己糖醇衍生的偏酯縮合產(chǎn)物、或環(huán)氧乙烷和由脂肪酸與己糖醇脫水物衍生的偏酯的縮合產(chǎn)物。該領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，上文的總體描述包括了許多具體的賦形劑和潤濕劑。水性懸浮液還可含有一種或多種防腐劑(例如對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸正丙酯)、一種或多種著色劑、一種或多種調(diào)味劑、以及一種或多種增甜劑(例如蔗糖或糖精)。
適用于通過加入水來制備水性懸浮液的可分散粉末和顆粒提供可與分散劑、潤濕劑、懸浮劑以及一種或多種防腐劑混合的活性組分。上文已經(jīng)列舉了合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑。其中還可存在其它賦形劑，例如增甜劑、調(diào)味劑和著色劑。
式I化合物可在無菌介質(zhì)中通過腸胃外給藥。根據(jù)所用的載體和濃度，藥物可以懸浮或溶解在載體中。有利的是，諸如局部麻醉藥、防腐劑和緩沖劑的佐劑可以溶解在該載體中。無菌的可注射制劑可以是在無毒性、腸胃外用可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌的可注射溶液或懸浮液?？刹捎玫目山邮艿妮d體和溶劑有無菌水、鹽溶液或Ringer溶液。通式I的化合物還可以適用于耳、直腸或陰道給藥的栓劑形式給藥。這些組合物可通過混合藥物與合適的無刺激性賦形劑來制得，這種賦形劑在常溫下呈固態(tài)，但在體溫下呈液態(tài)，因此融化并釋放出藥物。這些材料是可可豆油和聚乙二醇。
式I化合物的溶液通過手術(shù)內(nèi)裝置在身體任何部位給藥。
約為1至400毫克(較佳的在10-300毫克范圍內(nèi)，最佳的在25-250毫克范圍內(nèi))的單劑水平可用來治療上述呼吸道疾病。約為0.0005至5毫克(較佳的在0.001-3毫克范圍內(nèi)，最佳的在0.025-1毫克范圍內(nèi))的單劑水平可用來治療上述眼科疾病。根據(jù)受治療的宿主和特定的給藥方式，可與載體材料混合產(chǎn)生單劑的活性組分的量將有所不同。然而，應(yīng)當(dāng)理解，對于任何特定患者來說，具體的劑量水平將取決于各種因素，這些因素包括采用的具體化合物的活性、患者體重、總體健康狀況、性別、飲食、給藥時間、給藥途徑、和排泌率、藥物的組合以及受治療特定疾病的嚴重程度。
下述合成方法包括幾種合成策略來生產(chǎn)P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)?？偟膩碚f，所有方法都用式IIa-d的尿苷或尿苷核苷酸化合物作為原料，溶解在極性、質(zhì)子惰性有機溶劑(如二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、二噁烷、N-甲基吡咯烷酮、磷酸三甲酯)和疏水性胺(例如三乙胺、三丁基胺、三辛基胺、2，4，6-可力丁、四丁基銨、三烷基胺和四烷基胺、雜環(huán)胺)中。產(chǎn)物這樣來獲得分別用式IV的磷酸化試劑(例如磷酰氯、焦磷酸、焦磷酰氯)磷酸化或用式III的活化劑(如羰基二咪唑、烷基或芳基碳化二亞胺、氯化磷酸烷基或芳基酯(phosphochloridate))激活磷酸基團，然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法進行純化，這些方法包括但不局限于離子層析(如DEAE Sephadex，DEAE纖維素、Dowex 50，陰離子和陽離子交換樹脂)。
下式IIa-d分別示出了嘧啶β-D-呋喃核糖原料尿苷、尿苷5′-單磷酸(UMP)、尿苷5′-二磷酸(UDP)和尿苷5′-三磷酸(UTP)的游離酸。這些材料可以各種鹽形式從商業(yè)上大量購得。
式IIa尿苷

式IIbUMP

及其鹽；式IIcUDP

及其鹽；式IIdUTP

及其鹽。
下列通式IIIa-c分別示出了活化劑碳化二亞胺、激活的羰基、和激活的磷。
式IIIa碳化二亞胺

其中R1和R2是C1-C8烷基或環(huán)烷基、被任意取代(如羥基和氨基)的C1-C8烷基或環(huán)烷基；芳基或被任意取代(如羥基和氨基)的芳基。較佳的式IIIa化合物是二環(huán)己基碳化二亞胺或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽。
式IIIb激活的羰基

其中X是咪唑、四唑和/或鹵素。較佳的式IIIb化合物是羰基二咪唑或羰基二三唑。
式IIIc激活的磷

其中R1和R2是C1-C8烷基或環(huán)烷基、任意取代(如羥基和氨基)的C1-C8烷基、烷氧基或環(huán)烷基；芳基、烷氧基或任意取代(如羥基和氨基)的芳基或烷氧基和/或鹵素；和X是鹵素。較佳的式IIIc化合物是氯化磷酸二苯酯(diphenylphosphorochloridate)、二氯磷酸苯酯(phenyl phosphorodichloridate)、苯基膦酰二氯和二苯基次膦酰氯。
下面的通式IVa-b示出了單磷酸化和二磷酸化試劑。
式IVa一磷酸化試劑

其中X是鹵素。較佳的式IVa化合物是磷酰氯。
式IVb二磷酸化試劑

其中X是氧、羥基、或鹵素，及其鹽。較佳的式IVb化合物是焦磷酰氯和焦磷酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明并不局限于下列實施例，下列實施例中的步驟可以變化。
實施例1用尿苷5′-二磷酸生產(chǎn)二尿苷四磷酸四鈉鹽的方法將尿苷5′-二磷酸二鈉鹽(Yamasa，Choshi，Japan；600克)溶解在5.4升去離子水中。使溶液通過Dowex 50Wx4 H+(Dow Chemical)柱。合并含有尿苷5′二磷酸的級分，用三丁胺(Aldrich，St.Louis；300毫升)中和。在55-60℃的浴溫下用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器將中和的級分濃縮成油。將油溶解在干的二甲基甲酰胺(Aldrich，3升)中，然后用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器(55-60℃浴溫)濃縮成油干燥。重復(fù)該步驟兩次。將油再次溶解在3升二甲基甲酰胺中，加入1，1-羰基二咪唑(Aldrich；100克)。溶液于50℃加熱2.5小時。加入附加量的活化劑(33克)，再繼續(xù)加熱2.5小時。在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器(55-60℃的浴溫)上再次將溶液濃縮成油。將所得油溶解在去離子水中至電導(dǎo)率與0.2M碳酸氫銨相等。然后將溶液上樣到Sephadex DEAE-A25(Pharmacia，Upsala，Sweden；預(yù)先在1.0M碳酸氫銨中溶脹，并用2倍柱體積的去離子水洗滌)柱中。用下列次序的溶液洗脫柱60升0.25M碳酸氫銨，120升0.275M碳酸氫銨，40升0.30M碳酸氫銨和40升0.35M碳酸氫銨。合并具有足量純二尿苷四磷酸(經(jīng)HPLC分析確定)的級分并在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器(55-60℃的浴溫)上濃縮。將所得殘余物溶解在1.5升去離子水中，在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器上濃縮。重復(fù)該步驟15次或直至除去過量碳酸氫鹽緩沖液。將所得油溶解在足量去離子水中形成約10％的溶液，將溶液加入Dowex 50Wx4 Na+(Dow)柱中用去離子水洗脫。合并含有U2P4的級分并濃縮成約10-15％的溶液，凍干獲得白色固體狀U2P4四鈉鹽(150克，得率以尿苷5′-二磷酸計約為25％)。
P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽的結(jié)構(gòu)闡述由于文獻中缺乏足夠的非腺苷酸二核苷酸的光譜數(shù)據(jù)，用現(xiàn)代分析技術(shù)對P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽進行全面的結(jié)構(gòu)描述。用質(zhì)譜法測得分子量為878[m/z 855，(M-Na+)-]，證實分子式為C18H22N4O23P4·4Na。測得C18H22N4O23P4·3Na[(M-Na+)-計算值854.9318]的確切質(zhì)量為854.9268。測得的質(zhì)量與理論質(zhì)量差別5.0毫質(zhì)量(milimass)單位(5.9ppm)，置信水平為99.7％。Karl Fisher濕度分析的值為1.73％水，從元素分析進一步確認分子式Na計算值為10.50，測定值為10.81％；C∶P比例計算值為1.74，測定值為1.80(根據(jù)分子式C18H22N4O23P4·4.2Na·1.1H2O(FW＝902.4克/摩爾))。紅外光譜顯示在3422cm-1有寬的信號，在1702cm-1有信號，表明存在羥基(O-H段)和羰基(O＝H段)官能團。另外，在1265cm-1處發(fā)現(xiàn)磷酸P＝O段。水中的UV光譜顯示λmax為262nm，摩爾吸收率(ε)為17,004。用偏振法測得25℃時的比旋(c＝1，H2O)為-9.56°。
NMR光譜是1H NMR(D2O，TMS)δ4.11(m，2H)，4.14(m，1H)，4.25(m，1H)，4.27(m，1H)，5.84(d，J＝8.1Hz，1H)，5.86(d，J＝5.4Hz，1H)，7.81(d，J＝8.1Hz)；13C NMR(D2O，TMS)δ65.1(d，J＝5.5Hz)，69.7，73.5，83.4(d，J＝9.4Hz)，88.1，102.8，141.5，152.9，167.5；31PNMR(D2O，H3PO4std)δ-22，32(m)，-10.75(m)。1H偶合31P光譜顯示由于1H偶合誘導(dǎo)δ-10.75處有多重峰增寬。因此確認該多重峰是Pα。在-22.23ppm處的多重峰上沒有1H偶合效果，默認為Pβ。觀察到H6對H2·和H3·糖質(zhì)子有核極化效應(yīng)(NOE)。由于H5不可能表現(xiàn)出對糖質(zhì)子有核極化效應(yīng)，因此確認是H6。另外確認了N1取代，因為對于N3取代結(jié)構(gòu)不可能有嘧啶-糖核極化效應(yīng)。
另外進行2維NMR試驗以確認連通性。HMQC顯示H5對C5和H6對C6有連通性，從而確認了C5和C6。觀察到H5對H6有COSY和NOE連通性，確認了H5。觀察到H6對C1′、C6對H1′、H1′對C2、H6對C2有HMBC 3-鍵連通性。因此這些數(shù)據(jù)確認了H1、C2和N1取代。H1′與H2′的COSY連通性確認了H2′，H1′與C1′以及H2′與C2′的HMQC連通性確認了C1′和C2′。另外，HMBC顯示了從H5到C4的2-鍵J連通性，確認了C4。峰裂數(shù)(mult)＝1.5的13C DEPT譜顯示δ65.1處的碳相對于所有其它碳是倒置的。這一發(fā)現(xiàn)確認C5′是亞甲基。31P與δ65.1和83.4處的碳偶合確認了C5′和C4′，因為C4′是僅有的偶合的亞甲基。另外，HMQC顯示出C5′到H5′、C4′到H4′的連通性，確認了H4′和H5′。觀察到H1′對H4′、H6對H2′、H6對H3′有核極化效應(yīng)，從而確認了β反構(gòu)體糖構(gòu)型。
總之，從商業(yè)上可獲得的原料出發(fā)用總共5小時的反應(yīng)時間合成了規(guī)模為150克的P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽，得率為25％。用離子交換層析有效地純化粗品，用質(zhì)譜法、NMR和其它分析技術(shù)明確地證實了反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
實施例2用尿苷5′-單磷酸生產(chǎn)二尿苷四磷酸四鈉鹽的方法將尿苷5′-單磷酸(Sigma，Milwaukee，3.0克，9.26毫摩爾)溶解在干的DMF(10毫升)和三丁胺(Aldrich，2毫升)中。40℃真空蒸發(fā)溶液成油。將殘余物溶解在干的DMF(Aldrich，8毫升)中形成溶液。在該溶液中加入羰基二咪唑(Aldrich，1.65克，10.18毫摩爾)。反應(yīng)溶液于50℃加熱1小時。將在5毫升DMF和2毫升三丁胺中制成無水三丁銨鹽(如下文實施例3所述制備)的尿苷5′-三磷酸(Yamasa，5.60克，10.18毫摩爾)加入反應(yīng)溶液中。使混合物于50℃攪拌3天，然后真空蒸發(fā)溶液成油，重新溶解在5毫升水中，用柱層析(300×50mm，Sephadex DEAE-A25，40-120μ，Aldrich，預(yù)先在1.0M碳酸氫銨中溶脹，用2倍柱體積的去離子水洗滌(H2O→0.3M碳酸氫銨梯度))純化。35℃真空濃縮純級分，加入水重新蒸發(fā)5次，獲得白色固體狀二尿苷四磷酸四銨鹽(2.37克，得率30％)用相同的滯留時間作為標準，經(jīng)HPLC測定為純度為92.11％。另外，用FABMS分析四銨鹽，質(zhì)量為788.9875[C18H25N4P23P4(M-H+)-788.9860]，確認游離酸的母式為C18H26N4O23P4。
實施例3A
用尿苷5′-三磷酸(UTP)生產(chǎn)二尿苷四磷酸的方法使尿苷5′-三磷酸(UTP)三鈉鹽(ProBioSint，Varse，Italy；5.86克，0.01摩爾)的5毫升水溶液通過三丁胺形式的BioRad AG-MP 50(Aldrich)強陽離子交換樹脂柱(50毫升床體積)，用約300毫升蒸餾水洗脫。在該溶液中加入三丁胺(Aldrich，5毫升)，振蕩懸浮液至水性級分的pH升高至8。分層，將水溶液蒸發(fā)至較小的體積，然后凍干過夜。將殘余物溶解在干的二甲基甲酰胺(Aldrich；20毫升)中，于0.1mmHg下蒸發(fā)溶劑。用無水丙酮將干燥的三丁胺補加至100毫升，獲得儲液(UTP中0.1M)。在等份前述UTP溶液(10毫升，1.0毫摩爾)中加入二環(huán)己基碳化二亞胺，室溫下攪拌溶液30分鐘。將混合物加入尿苷5′-單磷酸的三乙胺鹽(2.0毫摩爾，通過將0.5毫升三乙胺加入尿苷5′-單磷酸(UMP)(Sigma；0.648克，DMF配)中然后蒸干制得)中。然后將該懸浮液蒸干，殘余物用干的DMF補至5.0毫升，40℃下放置24小時。用微量制備離子交換層析(Hamilton PRP X-100柱)分離反應(yīng)混合物，用0-1.0M碳酸氫銨、5毫升/分鐘、30分鐘的梯度洗脫。在21和23分鐘之間洗脫出二核苷酸四磷酸；比較其在λmax263nm下的紫外吸收與P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)標準溶液的紫外吸收，定量測定產(chǎn)物(以UTP計，得率為76.7％)。
實施例3B用尿苷5′-三磷酸(UTP)和過量活化劑生產(chǎn)二尿苷四磷酸的方法通過用大量過量DCC(0.1克，5毫摩爾)活化三丁胺鹽(0.1毫摩爾)可提高UTP至P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的轉(zhuǎn)化率；在這種情況下，通過過濾除去沉積的二環(huán)己基脲，在用三丁胺UMP(0.2毫摩爾)處理前用10毫升醚萃取反應(yīng)混合物，將殘余物溶解在干的DMF中。在層析分離反應(yīng)混合物并定量測定紫外吸收(如上述實施例3A所述)后，尿苷四磷酸產(chǎn)物占混合物中尿苷酸物質(zhì)的50.7％(對應(yīng)于95.9％的UTP轉(zhuǎn)化)。
實施例4A用羰基二咪唑活化的尿苷5′-單磷酸生產(chǎn)二尿苷四磷酸的方法將尿苷5′-單磷酸(UMP)(0.324克，1.0毫摩爾)溶解在5毫升干的DMF和三丁胺(237μL，1毫摩爾)的混合物中，蒸干溶液，然后用DMF再進行兩次，產(chǎn)生無水三丁胺鹽。將殘余物溶解在5毫升DMF中，加入羰基二咪唑(CDI)(0.81克，5毫摩爾)。靜置溶液3小時，然后加入甲醇(324μL，8毫摩爾)以破壞過量的CDI。靜置該溶液1小時。加入焦磷酸三丁胺(Sigma，0.228克，0.5毫摩爾)，在室溫下氮氣下攪拌該懸浮液。3小時后用水淬滅反應(yīng)，使混合物進行HPLC(如上文實施例3A所述)。定量測定263nm下的吸收值測定P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的得率為9.3％。
實施例4B用經(jīng)氯化磷酸二苯酯活化的尿苷5′-單磷酸生產(chǎn)二尿苷四磷酸的方法將UMP的無水三丁胺鹽(1.0毫摩爾)(基本上如上所述制備)溶解在干的二噁烷(5毫升)和DMF(1毫升)混合物中。加入氯化磷酸二苯酯(0.3毫升)和三丁胺(0.3毫升)，使溶液在室溫下靜置3小時。蒸發(fā)溶劑，用約10毫升的乙醚振搖殘余物，然后4℃靜置30分鐘。傾析除去乙醚，將殘余物溶解在焦磷酸三丁胺(0.228克，0.5毫摩爾)的3毫升DMF溶液中。溶液置于室溫下氮氣下。反應(yīng)3小時后，用水淬滅反應(yīng)，如上文實施例3A所述對混合物進行HPLC。根據(jù)263nm下的吸收值定量測得P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的得率為9.6％。
實施例5用尿苷、磷酰氯和焦磷酸生產(chǎn)二尿苷四磷酸的方法將尿苷(Aldrich，0.244克，1毫摩爾)溶解在磷酸三甲酯(Aldrich，5毫升)中并加入三丁胺(466μL，2毫摩爾)。0℃下邊攪拌溶液邊加入磷酰氯(0.153克(93.2μL)，1毫摩爾)，0℃攪拌所得懸浮液3小時。加入焦磷酸三丁胺(0.288克)，室溫下攪拌懸浮液3小時。用1.0M三乙胺碳酸氫鹽水溶液淬滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取混合物，以除去磷酸三甲酯。如實施例3A所述，對水溶液進行HPLC。通過定量測定后者在263nm下的吸收值測得尿苷到P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的轉(zhuǎn)化率為6.83％。
實施例6用尿苷5′單磷酸和焦磷酰氯生產(chǎn)二尿苷四磷酸的方法將尿苷5′-單磷酸(UMP)(64.8毫克，0.2毫摩爾)溶解在1毫升干的吡啶中，邊加入焦磷酰氯(13.9μL(25毫克)，0.1毫摩爾)邊在冰上攪拌。溶液立即變混濁，然后形成大量半晶狀白色沉淀，沉淀在1-2分鐘內(nèi)變?yōu)槟z狀團塊。將混合物于室溫下保藏過夜，用水淬滅，并如實施例3A所述進行HPLC。通過定量測定263nm下的吸收值測定P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的產(chǎn)量為15.8％。獲得了大量P1，P3-二(尿苷5′-四磷酸)(25.4％)作為主要的副產(chǎn)物。
實施例7P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽在水中的穩(wěn)定性和溶解度通過將部分固體加入已知體積的去離子水中至溶液變混濁，來測定P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽的溶解度。因此測得其在水中的最大溶解度約為900毫克/毫升。固體或水溶液在低溫(5℃)或較高溫度(40℃)下的穩(wěn)定性研究表明在三個月內(nèi)發(fā)生分解量少于1.5％(經(jīng)HPLC分析測得)。因此確定P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽具有優(yōu)異的溶解度和穩(wěn)定曲線，適用于藥物用途。
實施例8P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽在動物體內(nèi)的毒性已經(jīng)在一組遺傳毒理學(xué)試驗中評價了P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽的非臨床性毒理學(xué)曲線，這些試驗包括細菌反突變(reverse mutation)試驗、體內(nèi)哺乳動物細胞遺傳測試、體外哺乳動物細胞基因突變測試以及小鼠體內(nèi)微核細胞遺傳試驗。在家兔體內(nèi)的研究檢查了6周內(nèi)每日給予多劑后的局部眼耐受性和亞慢性眼毒性。另外，還在大鼠和狗體內(nèi)兩次單劑急性吸入毒性研究，以及在狗體內(nèi)一次單劑急性靜脈內(nèi)毒性研究中對P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽進行測試。
這些研究的結(jié)果表明，P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽在這組遺傳毒性試驗中沒有遺傳毒性。在眼毒性研究中沒有發(fā)現(xiàn)相反的結(jié)果。在單劑吸入(大鼠、狗)和靜脈(狗)毒性研究中發(fā)現(xiàn)有較低程度的急性毒性。因此，確定P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽具有優(yōu)異的毒理學(xué)曲線，對于人體給予有很寬的安全限度。
實施例9P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽在正常人志愿者中的安全性和效率在第I期、雙盲、以安慰劑為對照、劑量逐漸增加的安全性和耐受性研究中，在75位正常健康男性志愿者體內(nèi)評價P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽。40位不吸煙者和35位吸煙者分為5個給藥組，每組16位志愿者，其中12位接受P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽(20-400毫克)的單劑氣霧劑，4位接受安慰劑(普通鹽水)。沒有報道有嚴重的不良反應(yīng)。鹽水組或活性藥物組中的FEV1、FVC、MMEF、臨床實驗室、12-導(dǎo)程(lead)ECG、或尿分析結(jié)果沒有顯著改變。在吸煙者中，P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽使給藥5分鐘內(nèi)咳出的痰重量以劑量依賴型方式增加2-7倍，并且在收集痰液的后一小時內(nèi)持續(xù)刺激咳出痰液。還發(fā)現(xiàn)P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽具有誘導(dǎo)不吸煙者咳出痰液的效果?？傊?，與安慰劑相比，P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽在正常男性對象體內(nèi)是安全的，耐受性很好，并能有效地刺激痰液咳出。
權(quán)利要求
1.一種具有式I的化合物式I
其中X選自Na，NH4或H，條件是所有X基團都不是H。
2.P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四鈉鹽。
3.P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四銨鹽。
4.一種合成式I化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽的方法，所述方法包括a)將式IIa-d的尿苷或尿苷核苷酸化合物溶解在極性、質(zhì)子惰性的有機溶劑和疏水性胺中；b)用式IVa-b的磷酸化試劑磷酸化和/或用式IIIa-c的活化試劑活化；和c)層析純化式I化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽；式I
其中X選自Na，NH4或H，條件是所有X基團都不是H；式IIa尿苷
式IIbUMP
及其鹽；式IIcUDP
及其鹽；式IIdUTP
及其鹽；式IIIa碳化二亞胺
其中R1和R2是獨立選自C1-C8烷基、C1-C8環(huán)烷基、被羥基和氨基任意取代的C1-C8烷基和C1-C8環(huán)烷基、芳基或被羥基和氨基任意取代的芳基；式IIIb激活的羰基
其中X獨立選自咪唑、四唑或鹵素；式IIIc活化的磷
其中X是鹵素，R1和R2各自獨立選自C1-C8烷基、C1-C8環(huán)烷基、被羥基和氨基任意取代的C1-C8烷基、被羥基和氨基任意取代的C1-C8烷氧基、被羥基和氨基任意取代的C1-C8環(huán)烷基、芳基、烷氧基、被羥基或氨基任意取代的芳基、被羥基和氨基任意取代的烷氧基、或鹵素；式IVa一磷酸化試劑
其中X是鹵素；式IVb二磷酸化試劑
其中X選自氧、羥基、鹵素，及其鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中式IIIa化合物選自二環(huán)己基碳化二亞胺或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中式IIIb化合物選自羰基二咪唑或羰基二三唑。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中式IIIc化合物選自氯化磷酸二苯酯、二氯磷酸苯酯、苯基膦酰二氯和二苯基次膦酰氯。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中式IVa化合物是磷酰氯。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中式IVb化合物選自焦磷酰氯和焦磷酸。
10.一種制備權(quán)利要求1所述的式I化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽的方法，其特征在于所述方法包括將權(quán)利要求4所述的式IIc化合物溶解在極性、質(zhì)子惰性有機溶劑和疏水性胺中，用權(quán)利要求4所述的式IIIa-c活化劑處理，隨后用層析純化。
11.一種制備權(quán)利要求1所述的式I化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽的方法，其特征在于所述方法包括將權(quán)利要求4所述的式IIb化合物溶解在極性、質(zhì)子惰性有機溶劑和疏水性胺中，用權(quán)利要求4所述的式IIIa-c活化劑處理，然后和權(quán)利要求4所述的式IId化合物反應(yīng)，隨后層析純化。
12.一種制備權(quán)利要求1所述的式I化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽的方法，其特征在于所述方法包括將權(quán)利要求4所述的式IId化合物溶解在極性、質(zhì)子惰性有機溶劑和疏水性胺中，用等摩爾量的權(quán)利要求4所述的式IIIa-c活化劑處理，然后和權(quán)利要求4所述的式IId化合物反應(yīng)，隨后層析純化。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中采用了過量的活化劑。
14.一種制備權(quán)利要求1所述的式I化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽的方法，其特征在于所述方法包括將權(quán)利要求4所述的式IIb化合物溶解在極性、質(zhì)子惰性有機溶劑和疏水性胺中，用權(quán)利要求4所述的式IIIa-c活化劑處理，然后和權(quán)利要求4所述的式IVb化合物反應(yīng)，隨后層析純化。
15.一種制備權(quán)利要求1所述的式I化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽的方法，其特征在于所述方法包括將權(quán)利要求4所述的式IIa化合物溶解在極性、質(zhì)子惰性有機溶劑和疏水性胺中，用權(quán)利要求4所述的式IVa-b磷酸化劑處理，隨后層析純化。
16.一種制備權(quán)利要求1所述的式I化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽的方法，其特征在于所述方法包括將權(quán)利要求4所述的式IIb化合物溶解在極性、質(zhì)子惰性有機溶劑和疏水性胺中，用權(quán)利要求4所述的式IVb磷酸化劑處理，隨后層析純化。
17.一種治療哺乳動物體內(nèi)慢性阻塞性肺疾病的方法，該方法是給予治療慢性阻塞性肺疾病有效量的權(quán)利要求1所述的式I化合物。
18.一種治療哺乳動物體內(nèi)竇炎、中耳炎或鼻管阻塞的方法，該方法是給予清除粘液分泌有效量的權(quán)利要求1所述的式I化合物。
19.一種治療哺乳動物體內(nèi)干眼病的方法，該方法是給予治療干眼病有效量的權(quán)利要求1所述的式I化合物。
20.一種治療哺乳動物體內(nèi)視網(wǎng)膜脫落的方法，該方法是給予治療視網(wǎng)膜脫落有效量的權(quán)利要求1所述的式I化合物。
21.一種治療或預(yù)防哺乳動物體內(nèi)肺炎的方法，該方法是給予預(yù)防治療肺炎有效量的權(quán)利要求1所述的式I化合物。
22.一種促進哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生痰液的方法，該方法是給予促進誘生痰液有效量的權(quán)利要求1所述的式I化合物。
23.一種促進哺乳動物吐痰的方法，該方法是給予促進吐痰有效量的權(quán)利要求1所述的式I化合物。
24.一種治療由于陰道干燥引起的女性不育或陰道刺激的方法，該方法是給予治療陰道干燥有效量的權(quán)利要求1所述的式I化合物。
25.一種藥物組合物，它包含權(quán)利要求1所述的式I化合物以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了合成治療性二核苷酸P
文檔編號A61P27/00GK1265114SQ98806199
公開日2000年8月30日 申請日期1998年7月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月25日
發(fā)明者B·R·耶扎, W·彭德格斯特 申請人:印斯拜爾藥品股份有限公司