專利名稱：結(jié)核分枝桿菌rpoB基因的核酸指紋特征圖譜庫及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種結(jié)核分枝桿菌rpoB基因RRDR的核酸指紋圖譜制備的方法，以及使用該方法，對(duì)待檢結(jié)核分枝桿菌rpoB基因RRDR的突變型進(jìn)行檢測的方法。
背景技術(shù)：
近年來，結(jié)核病耐藥疫情日趨嚴(yán)重，有關(guān)調(diào)查表明，超過50個(gè)國家存在廣泛耐多藥結(jié)核病患者，中國在全球27個(gè)耐多藥結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家中排行第二，僅次于印度。早期耐藥性診斷技術(shù)的突破是當(dāng)前控制結(jié)核病的關(guān)鍵，因此，建立快速、靈敏的結(jié)核病耐藥性檢測技術(shù)迫在眉睫。細(xì)菌學(xué)的耐藥性檢測方法仍然是結(jié)核病耐藥性檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但受制于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢的特性，目前所有的結(jié)核病細(xì)菌學(xué)耐藥性檢測方法都達(dá)不到快速的目的。以耐藥基因檢測為主的各種分子藥敏檢測技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、通量高等優(yōu)勢，越來越 聚合酶亞基β亞單位(RNA polymerase B subunit, rpoB),從而抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄。結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平耐藥是結(jié)核病化療失敗的主要原因，并且利福平耐藥性的檢測是判斷多重耐藥結(jié)核病(MDR-TB)的標(biāo)志。rpoB基因是一單拷貝基因，序列高度保守，全長3543個(gè)堿基。研究證實(shí)，當(dāng)高度保守核心區(qū)域(RRDR)發(fā)生突變時(shí)，利福平不能與RNA聚合酶β亞單位結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄。95%左右的RFP耐藥菌株的基因突變都集中在507 533位的27個(gè)氨基酸(81bp)組成的區(qū)域，其中，以531位Ser — Leu和Trp轉(zhuǎn)換,526位His — Tyr、Asp、Asn和Pro的突變最為常見，且以上兩個(gè)位點(diǎn)的突變是引起高水平耐藥的主要原因。除上述兩位點(diǎn)外，511、516、518、522位點(diǎn)也有突變，相對(duì)531和526較少，且是引起低水平耐藥的原因。已有一些公開文獻(xiàn)對(duì)結(jié)核桿菌的利福平耐藥位點(diǎn)決定區(qū)(RRDR)進(jìn)行鑒定，例如，中國專利申請(qǐng)201110271351、“多重PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法”，公開了一種基于多重PCR的反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，包括了引物的設(shè)計(jì)、探針的設(shè)計(jì)、雜交試驗(yàn)、結(jié)果判定，能夠同時(shí)檢測結(jié)核分枝桿菌對(duì)RIF、INH和EMB的耐藥相關(guān)的rpoB，katG，inhA基因調(diào)節(jié)區(qū)和embB基因突變熱點(diǎn)區(qū)的堿基突變。然而，該方法需要設(shè)計(jì)多重引物，并克服多重PCR中引物相互干擾的缺陷，同時(shí)多重PCR過程繁瑣，且反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)需要昂貴的免疫生化試劑和大量時(shí)間，因此難以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的檢測目的。中國專利申請(qǐng)200910114023、“檢測結(jié)核桿菌耐藥基因膜芯片”公開了一種檢測結(jié)核桿菌耐藥基因膜芯片，是針對(duì)結(jié)核桿菌rpoB、kagG、embB、inhA、ahpC、gyrA、rrs、rpsL、pncA基因的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針并雜交在尼龍膜上進(jìn)行檢測。然而，該方法需要設(shè)計(jì)多達(dá)54種探針，且檢測過程中探針點(diǎn)樣和膜芯片均需要準(zhǔn)確定量和靈敏的洗脫結(jié)合等操作，因此也難以實(shí)現(xiàn)上述目的。陳雙紅等(結(jié)核桿菌實(shí)驗(yàn)診斷的研究進(jìn)展，《海軍醫(yī)學(xué)雜志》第2002年第23卷第2期)綜合報(bào)道了利用細(xì)菌性檢測、免疫學(xué)檢測、PCR診斷、DNA指紋技術(shù)、基因芯片檢測技術(shù)以及質(zhì)譜分析來分型結(jié)核桿菌。其中報(bào)道了各種檢測方法的優(yōu)劣點(diǎn)，并指出目前對(duì)于rpoB基因突變位點(diǎn)的檢測仍然集中于PCR技術(shù)，該文對(duì)于質(zhì)譜檢測和分析突變位點(diǎn)未作進(jìn)一步的分析。質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于核酸檢測領(lǐng)域的理論基礎(chǔ)在于，組成遺傳物質(zhì)DNA的基本單元——四種核苷酸之間存在質(zhì)量差異，如ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP的分子量依次為271. 2Da、247. 2Da、287. 2Da、327. IDa (其中ddTMP是經(jīng)過修飾的)，它們之間的最小分子量差異在16Da，完全可以通過質(zhì)譜進(jìn)行分辨。使用質(zhì)譜能夠?qū)A基突變或多態(tài)位點(diǎn)(SNP)、插入/缺失(InDel)、甲基化位點(diǎn)、基因定量、拷貝數(shù)變化(copy number variation,CNV)等多種DNA變化類型進(jìn)行檢測。然而，由于質(zhì)譜技術(shù)檢測細(xì)菌存在著難以確定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜特征圖譜的問題。也就是說，盡管不同細(xì)菌之間的基因組DNA存在差異，將產(chǎn)生不同的核酸指紋圖譜，但如果沒有建立標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)庫，則因?yàn)槌霈F(xiàn)每次質(zhì)譜檢測細(xì)菌的結(jié)果因待檢的基因組過于龐大而缺乏重復(fù)性，導(dǎo)致準(zhǔn)確度下降。例如，朱健等人(“高效液相色譜-電噴霧多級(jí)質(zhì)譜法對(duì)格爾德霉素粗品中各組分 的初步判別及分類”，《中國抗生素》，2011年03期)報(bào)道了應(yīng)用高效液相色譜-電噴霧多級(jí)質(zhì)譜法(LC-ESI-MSn)對(duì)格爾德霉素(GDM)粗品中各組分進(jìn)行與質(zhì)量數(shù)相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息方面的初步判別及分類。該方法針對(duì)格爾德霉素(GDM)中不同組分的多級(jí)質(zhì)譜碎片進(jìn)行的分析整理，并對(duì)各種化合物進(jìn)行了準(zhǔn)確分類，但并不涉及針對(duì)細(xì)菌特定物質(zhì)進(jìn)行檢測從而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類的方法。劉海洪(“MALDI TOF MS在細(xì)菌檢測和鑒定中的應(yīng)用”，《微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展》，2003年02期)報(bào)道了“細(xì)菌體內(nèi)含有大量的生物標(biāo)志分子能用于細(xì)菌的化學(xué)分類和鑒定，針對(duì)如根據(jù)細(xì)菌的組成成分獲得指紋圖譜檢測和鑒定細(xì)菌”，并對(duì)該方法預(yù)測其理論上的可行性。然而，該研究僅僅是理論上探討了利用MALDI TOF MS對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類的方向，其既沒有指明所針對(duì)細(xì)菌的何種組分進(jìn)行檢測，也沒有說明具體研究方法和過程。由于細(xì)菌中可用于分類的組分(如蛋白、DNA、RNA、多糖等)種類太多，且質(zhì)譜技術(shù)針對(duì)不同待測物也存在各種實(shí)驗(yàn)參數(shù)的組合和選擇，因此在此之后的近10年內(nèi)并沒有利用MALDI TOF MS進(jìn)行細(xì)菌鑒定的新的報(bào)道。中國專利申請(qǐng)201110154723、“MALDI TOF MS輔助鑒定單增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDI TOF MS輔助鑒定霍亂弧菌的方法”公開了一種利用MALDI TOF MS技術(shù)輔助鑒定細(xì)菌的方法，包括預(yù)處理細(xì)菌培養(yǎng)物，采集所有菌株樣品的MALDI TOF MS圖譜，根據(jù)軟件制備細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)圖譜，使用相同的方法檢測并采集待測細(xì)菌的圖譜，以及比較二者圖譜，根據(jù)匹配分?jǐn)?shù)進(jìn)行判定。由于該方法使用常規(guī)的處理(通過無水乙醇、甲酸和乙腈處理，并輔以離心，最后吸取上清液進(jìn)行檢測)，盡管其在一定程度上能表征該細(xì)菌的特征圖譜，但由于其待測物中含有蛋白質(zhì)、脂類、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被離子化的分子，其得到的圖譜實(shí)質(zhì)上是上述各種分子的圖譜集合，因此既需要處理和比對(duì)的圖譜信息量過大，并且因待檢分子過于龐大而導(dǎo)致其圖譜特征性偏低，只適用于某具體細(xì)菌而無法推廣到其他大量的細(xì)菌檢測中。由于質(zhì)譜技術(shù)檢測細(xì)菌存在的上述缺陷，導(dǎo)致目前使用質(zhì)譜技術(shù)檢測細(xì)菌甚至結(jié)核桿菌的耐藥突變基因一直沒有進(jìn)展。作為最接近的現(xiàn)有技術(shù)，中國專利申請(qǐng)201110178412、“結(jié)核桿菌耐藥蛋白的篩選方法”報(bào)道了一種結(jié)合SDS凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)來篩選結(jié)核桿菌耐藥蛋白的方法，該方法主要通過凝膠電泳純化蛋白后，使用液相質(zhì)譜來分離和鑒定耐藥蛋白，并不涉及鑒定耐藥基因和相關(guān)質(zhì)譜特征庫，因此也無法解決上述問題。因此目前需要新的結(jié)核桿菌rpoB基因的耐藥突變基因的檢測方法(如質(zhì)譜法)來實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)、便捷的分類結(jié)果
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明原理在于針對(duì)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因高度保守核心區(qū)域(RRDR)的DNA設(shè)計(jì)合適的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物通過特定內(nèi)切酶進(jìn)行消化，產(chǎn)生一系列長度不一豐度不一的核酸片段，并通過MALDI-TOF MS質(zhì)譜進(jìn)行核酸分析并形成譜圖。由于針對(duì)結(jié)核分枝桿菌野生型和突變型的rpoB基因RRDR的擴(kuò)增后酶切，顯著的縮小了質(zhì)譜檢測的基因組區(qū)域，且通過酶切后的質(zhì)譜具有穩(wěn)定的特征圖譜，因而實(shí)現(xiàn)對(duì)利福平耐藥性的檢測。因此，發(fā)明人經(jīng)過大量摸索和比對(duì)，針對(duì)結(jié)核分枝桿菌野生型及利福平耐藥區(qū)域71種突變類型的研究，發(fā)現(xiàn)選用特定引物對(duì)結(jié)核分枝桿菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用特殊酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物處理后，進(jìn)行質(zhì)譜檢測可以得到各種突變型核酸指紋特征圖譜。因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供能用于結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性檢測用途的試劑盒，包含用于擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌DNA的RRDR區(qū)域特定引物對(duì)，所述引物如下表所示
權(quán)利要求
1.一種基于酶切技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因RRDR的突變型進(jìn)行檢測的方法，其特征在于，它至少包括如下步驟 (I )PCR反應(yīng)使用特定的耐藥決定區(qū)域的PCR引物，擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌核酸模板，得到含利福平耐藥決定區(qū)的PCR產(chǎn)物； (2)SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產(chǎn)物； (3)轉(zhuǎn)錄和核酸酶切反應(yīng)使用特定的轉(zhuǎn)錄和內(nèi)切酶，在一個(gè)反應(yīng)體系中，對(duì)步驟(2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，獲得一系列長度不一、豐度不一的核酸片段； (4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物，以避免鹽離子對(duì)后續(xù)檢測的影響； (5)質(zhì)譜儀檢測將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物上點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，上質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，得到結(jié)核分枝桿菌耐藥決定區(qū)的特征核酸指紋譜圖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的PCR引物，分別為SEQID No 1至SEQ ID No 2所示序列；且用于核酸酶切的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中步驟5的純化包括在轉(zhuǎn)錄和酶切產(chǎn)物中加入超純水，混勻后，再加入樹脂，上下顛倒混勻15分鐘；所述質(zhì)譜儀是MALDI TOF MS質(zhì)譜儀。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述包括結(jié)核分枝桿菌野生型及如表I所列的結(jié)核分枝桿菌耐藥決定區(qū)25個(gè)位點(diǎn)總計(jì)69種突變類型。
5.利用權(quán)利要求I的方法建立結(jié)核分枝桿菌rpoB基因RRDR的核酸指紋特征圖譜庫，至少包括上述步驟1-5，和； (6)將步驟5得到的各種結(jié)核分枝桿菌的核酸指紋特征圖譜，通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行匯總和整理，得到所述的結(jié)核分枝桿菌rpoB基因RRDR的核酸指紋特征圖譜庫。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述軟件是BioExplore軟件，其版權(quán)號(hào)為軟著登字第136879 號(hào)、登記號(hào) 2009SR10700。
7.利用權(quán)利要求5或6的方法所建立的結(jié)核分枝桿菌rpoB基因RRDR的核酸指紋特征圖譜庫，用于檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因RRDR的突變型的方法，包括 (I )PCR反應(yīng)使用特定的PCR引物，擴(kuò)增待測結(jié)核分枝桿菌的核酸模板，得到含擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的PCR產(chǎn)物； (2)SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產(chǎn)物； (3)轉(zhuǎn)錄和核酸酶切使用特定的轉(zhuǎn)錄和內(nèi)切酶，在一個(gè)反應(yīng)體系中，對(duì)步驟(2)得到的結(jié)核分枝桿菌的消化產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和核酸酶切，獲得一系列長度不一、豐度不一的核酸片段； (4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物； (5)質(zhì)譜儀檢測將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物上點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，上質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，得到該結(jié)核分枝桿菌分離株rpoB基因RRDR的核酸指紋特征圖譜； (6)將所得核酸指紋特征圖譜與核酸指紋特征圖譜庫進(jìn)行比較，從而判斷結(jié)核分枝桿菌rpoB基因RRDR的是否發(fā)生突變及其突變類型。
8.權(quán)利要求7的方法,其中步驟6通過BioExplore軟件進(jìn)行比較檢測。
9.提供能用于結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性檢測的試劑盒，至少包括 (1)用于擴(kuò)增細(xì)菌DNA的通用引物對(duì)及其緩沖液； (2)SAP酶及其緩沖液；(3)RNAase及其緩沖液； (4)用于純化酶切產(chǎn)物的樹脂； (5)用于比對(duì)核酸指紋特征圖譜的分析軟件。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其中所述引物是SEQ ID NO: 1-2，所述軟件是BioExplore軟件。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)突變型方法，包括PCR擴(kuò)增、SAP酶消化、轉(zhuǎn)錄、限制性內(nèi)切酶酶切、純化、質(zhì)譜儀檢測等步驟。基于該方法，可建立結(jié)核分枝桿菌野生型及突變型RRDR的特征酶切質(zhì)譜峰圖數(shù)據(jù)庫。根據(jù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的質(zhì)譜峰圖，與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，以檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因RRDR是否突變及突變型，從而判斷結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平的耐藥性。檢測結(jié)果可廣泛運(yùn)用于臨床檢驗(yàn)、疾病預(yù)防、流行病調(diào)查、進(jìn)出口檢驗(yàn)等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102758012SQ20121019693
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月15日
發(fā)明者孔維甲, 張海燕, 張雅博, 趙洪斌, 馬慶偉 申請(qǐng)人:向華