專利名稱：一株特基拉芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株特基拉芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
芽孢桿菌種類繁多，分布廣泛，主要存在于土壤、水、空氣以及動物的腸道等處。且胞外酶種類豐富，具有很好的研究前景。由于生長環(huán)境的復(fù)雜性，芽孢桿菌也會分泌產(chǎn)生纖維素酶，如￠-葡聚糖酶?！?葡聚糖酶在啤酒釀造中有著廣泛的應(yīng)用在糖化過程中使用^ -葡聚糖酶，可以降低麥汁的粘度，使過濾速度加快，從而降低能耗；另外，在麥汁中加入^ -葡聚糖酶還能減少葡聚糖含量，防止啤酒渾濁，從而提高啤酒 的非生物穩(wěn)定性。麥類飼料中由于含有較高的￠-葡聚糖，阻礙了飼料中有效成分在動物腸道中的消化吸收，成為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，并且為致病菌的寄居繁殖提供豐富的營養(yǎng)，會引起畜禽腹瀉等問題，在飼料中添加適量的3 -葡聚糖酶將有效解決上述問題，從而提高飼料的利用率。我國為啤酒生產(chǎn)大國，2011年啤酒產(chǎn)量達(dá)4610萬千升，啤酒產(chǎn)量的不斷攀升意味著葡聚糖酶需求量也逐日增加。目前國內(nèi)使用的酶制劑除少量飼料用酶制劑為國內(nèi)生產(chǎn)，大部分酶制劑都依賴于進(jìn)口產(chǎn)品，由于生產(chǎn)技術(shù)屬于商業(yè)機(jī)密，這在極大程度上限制了啤酒及飼料工業(yè)的發(fā)展，發(fā)展具有獨(dú)立知識產(chǎn)權(quán)的工業(yè)酶制劑技術(shù)具有重大意義。分離篩選高產(chǎn)3 -葡聚糖酶的微生物是酶技術(shù)的基礎(chǔ)，我國地域遼闊，環(huán)境狀況復(fù)雜，造就了豐富的微生物資源，為分離篩選工作的開展提供了多種可能。以分離的一株產(chǎn)￠-葡聚糖酶野生菌為資源，結(jié)合育種技術(shù)，獲得高產(chǎn)3 -葡聚糖酶的工業(yè)生產(chǎn)菌株，最終為工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)提供新的思路與資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis) CGX5-1。本發(fā)明所提供的特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)CGX5-l,已于2012年3月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CGMCCNo. 5935。本發(fā)明提供了一種所述特基拉芽孢桿菌的應(yīng)用，從培養(yǎng)好的特基拉芽孢桿菌中調(diào)取@ -I, 3-1，4-葡聚糖酶基因、酸性、中性及堿性蛋白酶類基因等進(jìn)行外源表達(dá)，構(gòu)建工業(yè)酶制劑的基因工程菌。所述特基拉芽孢桿菌為從馬蜂巢穴殘片中篩選，其保藏條件如下從生長良好的平板上取I環(huán)芽孢桿菌移入LB培養(yǎng)基中，37 °C搖瓶培養(yǎng)15h，取0. 75mL移入盛有0. 25mL無菌40%甘油的甘油管中，放_70°C冰箱保存。所述LB培養(yǎng)基為TryptoneIOg L S Yeast Extract 5g L17Nacl IOg L S pH7. O0發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉40g L—1，豆餅粉61. Ig L—1，大麥粉68.4g L'磷酸氫二鉀IgL'氯化鈣0. Ig L—1，硫酸鎂Ig L—1，高溫淀粉酶16 u L/L。所述特基拉芽孢桿菌培養(yǎng)條件為將甘油管保藏的芽孢桿菌接入LB液體培養(yǎng)基，在37°C 200rpm搖瓶培養(yǎng)15h至對數(shù)中后期，作為種子液。以2%接種量將種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C 200rpm培養(yǎng)，分別于12、24、36、48、60h為取樣點(diǎn)，測定樣品中￠-1,3-1,4-葡聚糖酶的活力。生物材料保藏本發(fā)明所提供的特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequi lensi s)CGX5-l,已于2012年3月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CGMCCNo. 5935。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I特基拉芽孢桿菌篩選及酶活測定方法從馬蜂巢穴的殘片中取一定樣品加入到30mL無菌生理鹽水，玻璃珠打散制成懸濁液，80°C處理lOmin。將懸濁液梯度稀釋，涂布于添加2%剛果紅的MRS平板，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。挑取使剛果紅變色圈明顯的的單菌落。反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離，重復(fù)三次得到純化的單菌落，供下一步鑒定用。 鑒定主要通過1)菌落特征觀察用肉眼直接觀察，挑選菌落直徑在1-1. 5mm之間，圓形，表面光滑稍有褶皺，乳白色等符合芽孢桿菌菌落特征的菌株。2)個(gè)體形態(tài)觀察用光學(xué)顯微鏡革蘭氏染色觀察。挑選革蘭氏陽性、有芽孢的菌株。將滿足鑒定條件的菌株挑出甘油管保藏。以2%接種量取_70°C甘油貯存液接種于LB培養(yǎng)基中，37°C 200rpm搖瓶培養(yǎng)15h。以2%接種量取37°C 200rpm搖瓶培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中37°C 200rpm搖瓶培養(yǎng)36小時(shí)。取發(fā)酵液離心5min (8000rpm，4°C)得到上清液。將上清液用雙蒸水稀釋合適倍數(shù)，取0. ImL稀釋液，加入經(jīng)40°C預(yù)熱的藍(lán)色葡聚糖底物(使用前和0. 2M的pH5. 5的醋酸緩沖液等體積混合)，在40°C反應(yīng)IOmin,每個(gè)反應(yīng)樣品中加入3. OmL反應(yīng)終止液,搖勻后8000rpm離心5min, Icm的比色杯測定清夜在590nm處的吸光值，以0. ImL的雙蒸水代替酶液做空白對照。通過測定發(fā)酵液中￠-1, 3-1，4-葡聚糖酶的活力，篩選到一株具有較強(qiáng)產(chǎn)^ -I, 3-1，4-葡聚糖酶能力的菌株，通過16SrDNA序列分析可知該菌株為特基拉芽孢桿菌，于2012年3月26日保藏于中國普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 5935。實(shí)施例2發(fā)酵生產(chǎn)P -I, 3-1，4-葡聚糖酶的工藝特基拉芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)P -I, 3-1，4-葡聚糖酶所使用的培養(yǎng)基分為種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。其中種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基為Tryptone IOg L-1, Yeast Extract 5gL'Nacl IOg L'pI^.O。發(fā)酵培養(yǎng)基成分主要有玉米粉40g L—1，豆餅粉61. Ig L-1，大麥粉68.4g L—1，磷酸氫二鉀Ig L—1，氯化鈣0. Ig L'硫酸鎂Ig L—1，高溫淀粉酶16UL/L。裝液量均為30mL每250mL三角瓶。培養(yǎng)基滅菌條件為121°C，20min。從平板上挑取特基拉芽孢桿菌的單菌落于斜面上活化8h后，從斜面上挑取一環(huán)菌接至LB培養(yǎng)基中，37°C 200rpm搖瓶培養(yǎng)15h至對數(shù)中后期，作為種子液。以2%接種量將種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C 200rpm培養(yǎng)，分別于12、24、36、48、52、56、60h為取樣點(diǎn)，測定樣品中￠-1, 3-1，4-葡聚糖酶的活力。結(jié)果表明，該菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長52h后其發(fā)酵液中P -I, 3-1，4-葡聚糖酶酶活達(dá)到最高值，為191. 96U/mL。實(shí)施例3應(yīng)用于構(gòu)建基因工程菌根據(jù)NCBI 中 Bacillus amyIoliquefaciens LL3 (NC_017190. I)中 bglS 設(shè)計(jì)引物克隆其中P -I, 3-1，4-葡聚糖酶基因用于構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)在提可以使用大腸桿菌系列或畢氏酵母系列，用于高效發(fā)酵表達(dá)生產(chǎn)P -I, 3-1，4-葡聚糖酶?？梢岳斫獾氖?，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍?！?br> 權(quán)利要求
1.一株特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)CGX5-l，于2012年3月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5935。
2.培養(yǎng)權(quán)利要求I所述特基拉芽孢桿菌的方法，是在LB培養(yǎng)基或者營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)特基拉芽孢桿菌。
3.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于優(yōu)選pH7. 0 ;優(yōu)選培養(yǎng)溫度37°C。
4.權(quán)利要求I所述特基拉芽孢桿菌應(yīng)用于克隆￠-1,3-1，4-葡聚糖酶基因，構(gòu)建工業(yè)酶制劑的基因工程菌。
5.權(quán)利要求I所述特基拉芽孢桿菌應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)￠-1,3-1，4-葡聚糖酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)CGX5-1，已于2012年3月26日保藏于中國普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.5935。該菌株具有較高的產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶能力，將該菌株及其優(yōu)良基因用于工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)領(lǐng)域，具有降低產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶身產(chǎn)成本、提高酶制劑質(zhì)量的良好前景。
文檔編號C12N1/20GK102719379SQ20121019737
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月15日
發(fā)明者劉春鳳, 劉曉玲, 李崎, 李永仙, 王金晶, 鄭飛云 申請人:江南大學(xué)