專利名稱：蛋白質(zhì)純化的方法及系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)純化的方法及系統(tǒng)，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及使用淀粉結(jié)合蛋白的方法及系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
通過(guò)微生物系統(tǒng)表達(dá)以生產(chǎn)蛋白質(zhì)已成為高價(jià)、醫(yī)藥用蛋白質(zhì)的主要來(lái)源。純化及回收重組蛋白是設(shè)計(jì)發(fā)酵過(guò)程中的一個(gè)重要考慮因素。而蛋白質(zhì)純化的傳統(tǒng)方法可用于分離產(chǎn)物，改良方法包含重組蛋白質(zhì)的使用。重組蛋白可以通過(guò)親和管柱層析法純化，重組蛋白的所需成分通過(guò)其共價(jià)性連接至多肽，多肽與親和性基質(zhì)(親和介質(zhì))相連接，從而完成純化。存在某些通過(guò)親和性管柱層析原理用于分離蛋白質(zhì)的系統(tǒng)。美國(guó)專利號(hào)第5，643，758號(hào)的專利描述了包含有麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein, MBP)的系統(tǒng)?？寺』?cloned gene)插入于來(lái)自可編碼出麥芽糖結(jié)合蛋白的malE基因pMAL載體下游(down-stream)。該載體可轉(zhuǎn)化至寄主細(xì)胞(host cell)，然后該重組蛋白可以在該寄主細(xì)胞表達(dá)。該細(xì)胞的溶解產(chǎn)物或培養(yǎng)基部分可裝載于包含親和性基質(zhì)淀粉糖(amylose)的管柱并清洗數(shù)次，然后使用大量的麥芽糖抽提重組蛋白。美國(guó)專利號(hào)第5，202，247號(hào)的專利描述了包含有纖維素結(jié)合區(qū)域(cellulose-binding domain)的系統(tǒng)。纖維素管柱可用于純化包含有纖維素結(jié)合區(qū)域的重組蛋白。該細(xì)胞的溶解產(chǎn)物或培養(yǎng)基部分可裝載于該管柱并清洗。纖維素結(jié)合區(qū)域與纖維素的交互作用似乎是由中性PH值的疏水性相互作用而驅(qū)使。一般抽提方法使用低極性溶劑例如乙二醇，在去除低極性溶劑前使用透析或過(guò)濾。上述的蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)具有某些缺點(diǎn)。(I)其蛋白質(zhì)純化過(guò)程不方便且費(fèi)力。(2)用于純化的管柱昂貴。(3)上述系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)純化時(shí)，有些情況下無(wú)法分離重組蛋白，例如含有EDTA的樣品，以及現(xiàn)在使用的蛋白質(zhì)標(biāo)簽與本發(fā)明的目標(biāo)蛋白相比，相對(duì)較大者。利用酶產(chǎn)物在水中飼養(yǎng)現(xiàn)今還存在某些問(wèn)題，例如(a)飼料加入水中后酶快速流失，以及(b)當(dāng)飼料生產(chǎn)溫度高于100°C時(shí)酶活性將會(huì)被破壞
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的具體說(shuō)明及簡(jiǎn)要描述如下，本發(fā)明的特征在于淀粉結(jié)合蛋白標(biāo)簽化重組蛋白(starch binding protein (SBP) -tagged recombinant protein)、淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)(SBP-binding matrix)及其在蛋白質(zhì)純化的應(yīng)用。在某些實(shí)施例中，提供一種純化重組蛋白的方法，包含
(a)提供包含淀粉結(jié)合蛋白標(biāo)簽化重組蛋白的溶液；
(b)添加該溶液至第一容器，該第一容器包含淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)；
(C)抽提堿性緩沖液至步驟(b)的第一容器以獲得混合物；
(d)將該混合物與溶液混合，該溶液用于在第二容器中切割淀粉結(jié)合蛋白及重組蛋白以生成反應(yīng)混合物；以及
(e)添加該反應(yīng)混合物至第三容器，該第三容器包含淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)以回收重組蛋白。再者，在其它實(shí)施例中，提供一種純化重組蛋白的系統(tǒng)，包含
裝置(a)，用于提供包含淀粉結(jié)合蛋白標(biāo)簽化重組蛋白的溶液；
裝置(b)，用于添加該溶液至第一容器，該第一容器包含淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)；
裝置(C)，用于抽提堿性緩沖液至(b)的第一容器以獲得混合物；
裝置(d)，用于將該混合物與溶液混合，該溶液用于在第二容器中切割淀粉結(jié)合蛋白及重組蛋白以生成反應(yīng)混合物；以及
裝置(e)，用于添加該反應(yīng)混合物至第三容器，該第三容器包含淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)以回收重組蛋白。
在某些方面，該淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)包含淀粉、分枝淀粉(amylopectin)、直鏈淀粉樹脂(amylose resin)、糊精樹脂(dextrin resin)或藻酸鹽微粒(alginatebeads)。在某些方面，(a)的淀粉結(jié)合蛋白標(biāo)簽化重組蛋白來(lái)自于細(xì)胞，且(b)淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)為淀粉。在其它方面，(b)的第一容器、(d)的第二容器或(e)的第三容器為可拋棄式。在其它方面，(d)的混合物進(jìn)一步添加淀粉結(jié)合蛋白-內(nèi)切蛋白酶(SBP-endoprotease )。在特定方面，該淀粉結(jié)合蛋白_內(nèi)切蛋白酶為淀粉結(jié)合蛋白-嚴(yán)重急性呼吸綜合征蛋白酶(SBP-SARS protease)或淀粉結(jié)合蛋白-腸激酶(SBP-enterokinase)。在另一方面，(a)的溶液具有4至6的pH值。在另一方面，(C)的緩沖液具有7至11的pH值。在又一方面，淀粉結(jié)合蛋白標(biāo)簽化重組蛋白于淀粉結(jié)合蛋白及目標(biāo)蛋白間包含有內(nèi)切蛋白酶識(shí)別位置。在又一方面，(b)的溶液具有4至8的pH值。在再一方面，某些實(shí)施例于步驟(e)前進(jìn)一步包含中和步驟用于調(diào)整pH值直到5至7。在再一方面，某些實(shí)施例進(jìn)一步包含中和裝置，用于調(diào)整pH值直到5至7。在某些實(shí)施例中，提供一種具有熱穩(wěn)定性的重組蛋白，其以上述任一實(shí)施例的方法制備，其中該重組蛋白以淀粉結(jié)合蛋白標(biāo)簽及目標(biāo)蛋白而融合。在其它方面，該目標(biāo)蛋白指脂酶(Lipase)、聚木糖酶(Xylanase)或植酸酶(Phytase)0
在其它實(shí)施例中，提供一種用于制備重組蛋白的方法，該重組蛋白包含有淀粉結(jié)合蛋白標(biāo)簽及蛋白質(zhì)A (protein A),其中該重組蛋白通過(guò)酵母菌或細(xì)菌而表達(dá)。在某些方面，該酵母菌為準(zhǔn)赤酵母屬iPichia、。在某些方面，該細(xì)菌為大腸桿菌(疋coli、。本發(fā)明中一或多個(gè)實(shí)施例的細(xì)節(jié)將于下詳細(xì)描述。而本發(fā)明的其它特征及優(yōu)點(diǎn)將由下述的詳細(xì)描述及權(quán)利要求中顯現(xiàn)。上述的一般性描述及后述的詳細(xì)描述可通過(guò)例子而理解，且可提供如本發(fā)明所主張的進(jìn)一步解釋。


圖I表示一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)設(shè)計(jì)用于高度專一性切割地融合蛋白質(zhì)，接著將其快速、親和性為主地獲取并移除所有淀粉結(jié)合蛋白標(biāo)簽化(SBP-tagged)的殘基。(即SBP-標(biāo)簽化內(nèi)切蛋白酶(SBP-tagged endoprotease )、SBP-標(biāo)簽化-目標(biāo)蛋白(SBP-taggedtarget protein)及游離 SBP (free SBP) ) 圖2表示SBP-植酸酶(SBP-Phytase)及植酸酶在水中的示意圖。圖3表示SBP-植酸酶在水中釋放實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖4A-4C表示淀粉結(jié)合蛋白-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(SBP-eGFP)結(jié)合至不同類型樹脂的結(jié)合試驗(yàn)的聚丙烯酰胺膠體電泳(SDS-PAGE)的結(jié)果。圖4A顯示分枝淀粉的結(jié)果。圖4B顯示直鏈淀粉樹脂的結(jié)果。圖4C顯示糊精樹脂的結(jié)果，其中，M:標(biāo)記，In:流入物，P結(jié)合蛋白，S:未結(jié)合蛋白。圖5顯示淀粉結(jié)合蛋白-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白結(jié)合至藻酸鹽微粒的結(jié)合試驗(yàn)的聚丙烯酰胺膠體電泳的結(jié)果，其中，M:標(biāo)記，In:流入物，S:未結(jié)合蛋白，E:抽提物。圖6顯示親和性標(biāo)簽化(affinity-tagged)的純化及”完全切割(Clean-Cut)” 的去標(biāo)簽化(de-tagging)過(guò)程的結(jié)果，其中，I :以第一淀粉管柱純化的目標(biāo)蛋白，2 :SBP-蛋白酶切割的SBP，3 :經(jīng)純化去標(biāo)簽化的目標(biāo)蛋白，4 :結(jié)合于第二淀粉管柱的SBP及SBP-蛋白酶。
圖7A-7B表示以淀粉結(jié)合蛋白-蛋白質(zhì)A直鏈淀粉樹脂(SBP-SpA amylose resin)進(jìn)行免疫球蛋白純化的結(jié)果。圖7A表示純化來(lái)自疋coli.的淀粉結(jié)合蛋白-蛋白質(zhì)A(SBP-SpA)的純化結(jié)果。圖7B表示純化來(lái)自Pichia的淀粉結(jié)合蛋白_蛋白質(zhì)A(SBP-SpA)的純化結(jié)果，其中，M:標(biāo)記,S:血清,FT:流過(guò)物(Flowthrough), W:清洗溶液,E:抽提物。
具體實(shí)施例方式為描述及主張本發(fā)明，將使用依照下列定義的術(shù)語(yǔ)。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“重組蛋白”為源自于重組DNA的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“重組DNA”指一種DNA形式，其非自然存在，通過(guò)結(jié)合不會(huì)正常發(fā)生的DNA序列而創(chuàng)造。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“淀粉結(jié)合蛋白(starch binding protein)”將可縮寫為“SBP”，且其定義為所有對(duì)于結(jié)合至淀粉具有親和性的多肽。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“淀粉結(jié)合蛋白標(biāo)簽(SBP tag (s))”指淀粉結(jié)合蛋白(SBP)的親和性標(biāo)簽，且術(shù)語(yǔ)“親和性標(biāo)簽(affinity tags)”指附于蛋白質(zhì)的標(biāo)簽致使蛋白質(zhì)可由其粗生物來(lái)源，使用親和性技術(shù)而純化。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“淀粉結(jié)合蛋白標(biāo)簽化重組蛋白(SBP-tagged recombinantprotein,以下簡(jiǎn)稱SBP-tagged重組蛋白)”指重組蛋白，其具有以遺傳方式接合的淀粉結(jié)合蛋白勝肽序列作為親和性標(biāo)簽者。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)(SBP-binding matrix,以下簡(jiǎn)稱SBP結(jié)合基質(zhì))”指任何可與淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合的基質(zhì)。SBP結(jié)合基質(zhì)的例子包含但不限于淀粉、分枝淀粉、直鏈淀粉樹脂、糊精樹脂及藻酸鹽微粒。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“淀粉結(jié)合蛋白-內(nèi)切蛋白酶(SBP-endoprotease,以下簡(jiǎn)稱SBP-內(nèi)切蛋白酶)”指任何以淀粉結(jié)合蛋白作為標(biāo)簽并與其結(jié)合的內(nèi)切蛋白酶。內(nèi)切蛋白酶(Endoprotease)為一種可以切割非末端氨基酸(即在分子內(nèi))的肽鍵的酵素。SBP-內(nèi)切蛋白酶的例子包含但不限于淀粉結(jié)合蛋 白-嚴(yán)重急性呼吸綜合征蛋白酶(SBP-SARS protease,以下簡(jiǎn)稱SBP-SARS蛋白酶)或淀粉結(jié)合蛋白-腸激酶(SBP-enterokinase,以下簡(jiǎn)稱SBP-腸激酶)。本發(fā)明的實(shí)施于后述詳細(xì)描述關(guān)于用于純化目標(biāo)蛋白的方法及系統(tǒng)，其使用可再利用、方便及低價(jià)的SBP-tagged重組蛋白及SBP結(jié)合基質(zhì)。在某些實(shí)施例中，提供一種純化重組蛋白的方法，包含
(a)提供包含SBP-tagged重組蛋白的溶液；
(b)添加該溶液至第一容器，該第一容器包含SBP結(jié)合基質(zhì)；
(C)抽提堿性緩沖液至步驟(b)的第一容器以獲得混合物；
(d)混合該混合物與溶液，該溶液是用于在第二容器中切割SBP及重組蛋白以生成反應(yīng)混合物；以及
(e)添加該反應(yīng)混合物至第三容器，該第三容器包含SBP結(jié)合基質(zhì)以回收重組蛋白。在本發(fā)明的某些實(shí)施例，其中該SBP結(jié)合基質(zhì)包含淀粉、分枝淀粉、直鏈淀粉樹月旨、糊精樹脂或藻酸鹽微粒。在某些實(shí)施例中，提供一種純化重組蛋白的方法，包含步驟
(a)提供包含來(lái)自于SBP-tagged重組蛋白的溶液；
(b)添加該溶液至第一容器，該第一容器包含淀粉基質(zhì)；
(c)抽提堿性緩沖液至步驟(b)的第一容器以獲得混合物；
(d)混合該混合物與溶液，該溶液是用于在第二容器中切割SBP及重組蛋白以生成反應(yīng)混合物；以及
(e)添加該反應(yīng)混合物至第三容器，該第三容器包含淀粉基質(zhì)以回收重組蛋白。在較佳實(shí)施例中，(b)的第一容器、(d)的第二容器或(e)的第三容器為可拋棄式。(d)的混合物進(jìn)一步添加SBP-內(nèi)切蛋白酶。在最佳實(shí)施例中，該SBP-內(nèi)切蛋白酶為SBP-SARS蛋白酶或SBP-腸激酶。在較佳實(shí)施例中，步驟(a)的溶液具有4至6的pH值，且步驟(C)的緩沖液具有7至11的pH值。在最佳實(shí)施例中，步驟(a)的溶液具有5至6的pH值，且步驟(c)的緩沖液具有8至9的pH值。盡管當(dāng)pH值為11時(shí)，步驟(c)的緩沖液有最佳中和電荷效果(discharge effect),過(guò)于堿性的環(huán)境可能會(huì)破壞目標(biāo)蛋白。因此,推薦的緩沖液pH值范圍為8至9。當(dāng)pH值范圍為2至4時(shí)，該緩沖液也可中和蛋白質(zhì)電荷，但推薦堿性環(huán)境。
在較佳實(shí)施例中，SBP-tagged重組蛋白于SBP及目標(biāo)蛋白間包含有內(nèi)切蛋白酶識(shí)別位置。在某些實(shí)施例中，該(b)的溶液具有4至8的pH值以回收重組蛋白。在某些較佳實(shí)施例，推薦5至7的pH值。在某些實(shí)施例中，該方法在步驟(e)前進(jìn)一步包含中和步驟，用于調(diào)整pH值直到5至7。本發(fā)明還提供一種用于純化重組蛋白的系統(tǒng)，包含
(a)一裝置，用于提供包含SBP-tagged重組蛋白的溶液；
(b)一裝置，用于添加該溶液至第一容器；
(c)一裝置，用于抽提堿性緩沖液至(b)的第一容器以獲得混合物；
(d)一裝置，用于將該混合物與溶液混合，該溶液是用于在第二容器中切割SBP及重組蛋白以生成反應(yīng)混合物；以及
(e)一裝置，用于添加該反應(yīng)混合物至第三容器，該第三容器包含SBP結(jié)合基質(zhì)以回收重組蛋白。在本發(fā)明的某些實(shí)施例，其中該SBP結(jié)合基質(zhì)包含淀粉、分枝淀粉、直鏈淀粉樹月旨、糊精樹脂或藻酸鹽微粒。在較佳實(shí)施例中，(b)的第一容器、(d)的第二容器或(e)的第三容器為可拋棄式。(d)的混合物進(jìn)一步添加SBP-內(nèi)切蛋白酶。在最佳實(shí)施例中，該SBP-內(nèi)切蛋白酶為SBP-SARS蛋白酶或SBP-腸激酶。在較佳實(shí)施例中，(a)的溶液具有4至6的pH值，且(C)的緩沖液具有7至11的pH值。在最佳實(shí)施例中，(a)的溶液具有5至6的pH值，且(c)的緩沖液具有8至9的pH值。在較佳實(shí)施例中，SBP-tagged重組蛋白在SBP及目標(biāo)蛋白間包含有內(nèi)切蛋白酶識(shí)別位置。在某些實(shí)施例中，該(b)的溶液具有4至8的pH值以回收SBP-tagged重組蛋白。在某些較佳實(shí)施例，推薦5至7的pH值。在某些實(shí)施例中，該系統(tǒng)在裝置(e)前進(jìn)一步包含中和裝置，用于調(diào)整pH值直到5至7。此外，當(dāng)SBP標(biāo)簽、SBP內(nèi)切蛋白酶及未被切割的SBP-tagged重組蛋白在SBP結(jié)合基質(zhì)被捕獲時(shí)，第三容器中的反應(yīng)混合物可回收無(wú)標(biāo)簽的重組蛋白。在某些實(shí)施例中，提供一種具有熱穩(wěn)定性的重組蛋白，其以上述任一實(shí)施例的方法制備，其中該重組蛋白以SBP標(biāo)簽及目標(biāo)蛋白而融合。在特定實(shí)施例中，該目標(biāo)蛋白指脂酶、聚木糖酶或植酸酶。如此一來(lái)，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性可輕易提升并相當(dāng)廣泛地?cái)U(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域。在其它實(shí)施例中，提供一種用于制備重組蛋白的方法，該重組蛋白包含有SBP標(biāo)簽及蛋白質(zhì)A，其中該重組蛋白通過(guò)酵母菌或細(xì)菌而表達(dá)。在某些方面，該酵母菌為畢赤巴斯德酵母)。在其它方面，該細(xì)菌為大腸桿菌。因此，本發(fā)明可適用于任何關(guān)于純化所需蛋白的應(yīng)用，例如診斷、研究或產(chǎn)業(yè)上利用。實(shí)施例下述提供的實(shí)施例用于描述但非限制本發(fā)明。實(shí)施例I蛋白質(zhì)純化 SBP-tagged重組蛋白構(gòu)建及表達(dá)
以PCR擴(kuò)增SBP基因且融合至目標(biāo)蛋白的N端，其于SBP及目標(biāo)蛋白基因間包含有內(nèi)切蛋白酶識(shí)別位置。該融合蛋白在畢赤巴斯德酵母的表達(dá)載體pPICZ a A中復(fù)制，其在AOXl啟動(dòng)子控制下并轉(zhuǎn)化至畢赤巴斯德酵母GS115而表達(dá)。載有SBP-目標(biāo)蛋白基因的畢赤巴斯德酵母轉(zhuǎn)化物在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。該細(xì)胞以在包含0.5%甲醇的BMMY中離心及再懸浮而取得。0. 5%甲醇(0. 5% v/v)每24小時(shí)添加以誘導(dǎo)SBP-tagged重組蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)5天之后，細(xì)胞以離心方式移除且收集不含細(xì)胞的發(fā)酵液供后續(xù)純化。后續(xù)純化方式請(qǐng)參考圖I及下列描述
以第一淀粉管柱純化SBP-tagged重組蛋白
不含細(xì)胞的發(fā)酵液使用于第一淀粉管柱。該SBP-tagged重組蛋白結(jié)合至淀粉且不純物流出。該結(jié)合的SBP-tagged重組蛋白以pHll的甘氨酸緩沖液抽提，其后以pH7. 4的Tris緩沖液透析而儲(chǔ)存。
的內(nèi)切蛋白酶切割
該抽提的SBP-tagged重組蛋白與SBP-內(nèi)切蛋白酶于適當(dāng)緩沖液中混合。SBP標(biāo)簽及目標(biāo)蛋白間的蛋白酶識(shí)別位置可以SBP-蛋白酶而移除SBP標(biāo)簽。以第二淀粉管柱移除SBP標(biāo)簽殘基
經(jīng)SBP-內(nèi)切蛋白酶處理后，該反應(yīng)混合物使用于第二淀粉管柱。該不純物包含SBP標(biāo)簽、SBP內(nèi)切蛋白酶及未切割的SBP-tagged重組蛋白以淀粉管柱捕獲。完全消化切割的天然N端的目標(biāo)蛋白于流過(guò)部分(flow through fraction)重新獲得。實(shí)施例2熱穩(wěn)定性的比較
以PCR擴(kuò)增SBP基因且融合至目標(biāo)酵素的N端。脂酶基因來(lái)自于疋聚木糖酶基因來(lái)自于未純化的瘤胃真菌培養(yǎng)基以及植酸酶基因來(lái)自于疋coli，其均復(fù)制并與SBP融合。該SBP-脂酶、SBP-聚木糖酶及SBP-植酸酶等融合蛋白以上述方法表達(dá)并于本發(fā)明中使用。不同來(lái)源脂酶的熱穩(wěn)定性
脂酶活性單位(U)定義為當(dāng)樣品每分鐘釋出I ii mole的磷硝基酹(p-Nitrophenol )在0. 3mM的4-硝基苯基軟脂酸鹽(4-Nitrophenly palmitate)在30。。、pH值7. 0的條件下。SBP-脂酶(52500 U/g)及 F-AP15 脂酶(32430 U/g, R. oryzae 脂酶購(gòu)買自 AmanoEnzyme Inc.)與含水15%或20%的發(fā)酵黃豆粉混合以達(dá)每克100U。來(lái)自不同來(lái)源的100U/g混合脂酶秤重并挑選12g至IOOml血清瓶。含樣品的血清瓶于此固定并以85°C或90°C高壓滅菌10分鐘。每一脂酶的每一情況均測(cè)試兩次。經(jīng)處理后測(cè)量脂酶的活性。結(jié)果顯示于表I及表2。表I含水15%發(fā)酵黃豆粉
釋高名I處理溫度！ I處理時(shí)間(inin)I百分比％
SBP-脂酶25°C一 0100 %
SBP-脂酶85°C一 1086.78 %
SBP-脂酶90°C一 1086.2 %
F-AP1525°C—0100 %
F-AP1585°C— 1066.82 %
F-AP15丨90。。|l0丨37.02 % —
表2含水2 Q %發(fā)酵黃豆粉
尊高名 I處理溫度！ I處理時(shí)間(inin)I百分比％
SBP-脂酶 |25°C|oIlOO % —
權(quán)利要求
1.一種提高目標(biāo)蛋白熱穩(wěn)定性的方法，其特征在于所述方法是將淀粉結(jié)合蛋白與目標(biāo)蛋白融合形成重組蛋白，所述重組蛋白通過(guò)真核生物表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述真核生物為酵母菌或昆蟲細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述酵母菌為畢赤巴斯德酵母或啤酒酵母。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述目標(biāo)蛋白是酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述酶為植酸酶、脂酶、F-AP15脂酶、聚木醣酶、內(nèi)切蛋白酶、嚴(yán)重急性呼吸綜合征蛋白酶或腸激酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述目標(biāo)蛋白是具有醫(yī)藥用途的蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述目標(biāo)蛋白為L(zhǎng)Z8、綠色熒光蛋白或蛋白 質(zhì)A。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述重組蛋白與淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)相彡口口
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)包含但不限于淀粉和/或藻酸鹽。
10.一種使目標(biāo)蛋白在水中維持活性的方法，其特征在于所述方法是將淀粉結(jié)合蛋白與目標(biāo)蛋白融合形成重組蛋白，所述重組蛋白通過(guò)真核生物表達(dá)，且該重組蛋白與淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)相結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述淀粉結(jié)合蛋白使目標(biāo)蛋白在水中維持80%活性至少16個(gè)小時(shí)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述淀粉結(jié)合蛋白使目標(biāo)蛋白維持活性，是通過(guò)減少該目標(biāo)蛋白從淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)的流失來(lái)完成。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)包含但不限于淀粉和/或藻酸鹽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)為飼料。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述飼料為飼料顆粒、飼料小球或水中飼料。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述真核生物為酵母菌或昆蟲細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于所述酵母菌為畢赤巴斯德酵母或啤酒酵母。
18.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述目標(biāo)蛋白是酶。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于所述酶為植酸酶、脂酶、F-AP15脂酶、聚木醣酶、內(nèi)切蛋白酶、嚴(yán)重急性呼吸綜合征蛋白酶或腸激酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述目標(biāo)蛋白是具有醫(yī)藥用途的蛋白。
21.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述目標(biāo)蛋白為L(zhǎng)Z8、綠色熒光蛋白或蛋白質(zhì)A。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種純化蛋白質(zhì)的方法及其系統(tǒng)，其利用淀粉結(jié)合蛋白標(biāo)簽化重組蛋白而進(jìn)行純化。本發(fā)明還涉及淀粉結(jié)合蛋白結(jié)合基質(zhì)以回收淀粉結(jié)合蛋白標(biāo)簽化重組蛋白。因此，通過(guò)本發(fā)明進(jìn)行純化是可再利用、方便并低廉的。
文檔編號(hào)C12N9/96GK102746371SQ20121020491
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者張大慈, 許嘉欽 申請(qǐng)人:善笙生物科技股份有限公司