專利名稱：一種由枯草芽孢桿菌j18分離純化的抗菌蛋白、蛋白制品、制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種由枯草芽孢桿菌J18分離純化的抗菌蛋白、蛋白制品、制備方法及應用。
背景技術：
目前，我國水果采后腐爛損失嚴重，造成了巨大經(jīng)濟損失。采后病原微生物的侵染是造成采后腐爛損失的最主要原因。但是在水果保鮮中大量使用化學殺菌劑給水果的食用安全造成了很大的影響，如何減少水果保鮮中化學殺菌劑的使用成為公眾十分關注的食品安全問題?？莶菅勘U菌Bacillus subtil is (Ehrenberg) Cohn是自然界中廣泛的一種非致病細菌，能夠分泌多種抗菌物質(zhì)，其中抗菌蛋白或抗菌肽具有抑菌廣譜性和高效性，對環(huán)境無污染、對人畜無毒無害、不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，在研究開發(fā)新型生物農(nóng)藥制劑中有廣闊的利用價值。目前市場上的生物農(nóng)藥主要是以活菌體生物制劑為主，其在使用時常出現(xiàn)見效緩慢、防效也不穩(wěn)定、易受紫外線影響等現(xiàn)象，并且在儲藏過程中有效期較短，對儲藏環(huán)境要求嚴格等。而抗菌蛋白或抗菌肽等生物農(nóng)藥則避免了外界環(huán)境對活菌體保存產(chǎn)生的影響，并且防效穩(wěn)定、見效快。因此，抗菌蛋白或抗菌肽生物生物制劑比活菌體制劑更具有優(yōu)勢和應用前景?？咕鞍谆蚩咕牡难芯窟€能夠為抗菌蛋白基因的克隆、轉基因工程菌的構建，以及培育新的抗病品種打下良好的基礎。

李智洋等利用硫酸銨沉淀法從枯草芽孢桿菌代謝物中沉淀出抗軟腐菌的抗菌蛋白。黃保全等利用硫酸銨沉淀、疏水層析、陰離子交換層析等方法從枯草芽孢桿菌ElR-j發(fā)酵液中分離純化出抗菌蛋白jl。San-Lang Wang等也從枯草芽孢桿菌W-18中提取出幾丁質(zhì)酶，分子量為20. 6kD,能夠強烈抑制Fusariumoxysporum生長的作用。Wiehitra L.等從枯草芽孢桿菌NSRS89-24中分離純化出β -1, 3-葡聚糖酶，β -1, 3-葡聚糖酶可以催化β -1, 3-葡聚糖多聚體水解，而達到抑制真菌生長的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決現(xiàn)在技術中的問題，提供一種由枯草芽孢桿菌J18分離純化的抗菌蛋白、蛋白制品、制備方法及應用，它對果實和農(nóng)作物病害也都有顯著的防治效果，是一種廣譜高效的蛋白制品。本發(fā)明采用以下技術方案予以實現(xiàn)所述枯草芽孢桿菌J18菌種編號為CGMCC No. 3665，菌種名稱枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis) J18。本發(fā)明一種由枯草芽孢桿菌J18分離純化的抗菌蛋白的制備方法，它包括以下步驟；J18抗菌蛋白的制備；
種子活化將枯草芽孢桿菌J18菌株從保存的甘油菌轉接于LB液體培養(yǎng)基中，于30°C、150-250rpm培養(yǎng)18h，得J18菌懸液；取培養(yǎng)好的菌懸液稀釋，均勻涂布到LB固體平板培養(yǎng)基中，于25°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，用牙簽挑單菌落再次接種于LB液體培養(yǎng)基試管中，于30°C、150-250rpm培養(yǎng)過夜，取5mL培養(yǎng)好的菌懸液轉接到裝有150mL LB液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中置搖床30°C振蕩培養(yǎng)，轉速為150_250rpm ;得活化的菌懸液。種子培養(yǎng)將活化的菌懸液接種到LB液體培養(yǎng)基中，150-250r/min，30°c搖床培養(yǎng) 16h。發(fā)酵培養(yǎng)使用30L發(fā)酵罐進行分批發(fā)酵；裝料系數(shù)O. 6(18L)，接種量5%，發(fā)酵溫度30°C，通氣量O. 5m3/h，攪拌轉速150_250r/min，溶氧(DO)保持在75%左右，流加食用豆油消泡，PH 6. 8^7. 2，不流加調(diào)節(jié)pH值的酸堿性物質(zhì)。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為淀粉3g、蔗糖5g、硫酸錳30. 8mg/kg的溶液2mL、磷酸氫二鉀3g、磷酸二氫鉀1. 5g、豆柏30g，水1000mL。發(fā)酵周期34±2h。取菌株J18發(fā)酵上清液經(jīng)O. 22 μ m孔徑的細菌過濾器過濾制成無菌濾液；取無菌濾液，采用(NH4) 2S04沉淀法提取，在硫酸銨梯度40-70%下，4°C下沉淀過夜，8，000r/min離心20min,沉淀用O. 05mol/L磷酸緩沖液(pH 7. O)懸浮，SepherdexG-25層析除鹽,真空冷凍干燥，獲得J18抗菌蛋白。所述LB液體培養(yǎng)基的組分為胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉IOg和水IOOOmLo
所述LB固體平板培養(yǎng)基的組分為胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊月旨15g和水IOOOmL0使用上述制備的J18抗菌蛋白制備的蛋白制品，所述蛋白制品為被膜劑或抗菌保鮮紙。所述被膜劑的制備方法包括以下步驟將J18抗菌蛋白與1%的用醋酸調(diào)至pH6. O的殼聚糖溶液復配成濃度為O. 05mg/mL的被膜劑，即蛋白制品。所述抗菌保鮮紙的制備方法包括以下步驟按照J18抗菌蛋白溶液體積與氧化淀粉溶液體積5:4的比例，取濃度為O. 05mg/mL的J18抗菌蛋白溶液300mL加入240mL氧化淀粉溶液混合均勻，得混合液，然后用毛刷將混合液均勻涂布于保鮮紙或普通包裝紙上，室溫下晾干，得抗菌保鮮紙，即蛋白制品。所述氧化淀粉溶液的配制稱取160g可溶性淀粉，O. 96g高錳酸鉀，Sg氫氧化鈉，加入800mL水，加熱至90-95°C，持續(xù)攪拌20_30min，冷卻即得氧化淀粉溶液。所述的由枯草芽孢桿菌J18分離純化的蛋白制品在防治果實和農(nóng)作物病害中的應用。所述的由枯草芽孢桿菌J18分離純化的蛋白制品在防治梨輪紋病、葡萄灰霉病和黃瓜鐮刀霉中的應用。所述的由枯草芽孢桿菌J18分離純化的蛋白制品在防治梨采后黑斑病的應用。本發(fā)明中使用的殼聚糖具有高效抑制病原微生物繁殖和生長的作用，作為一種病原激發(fā)子可以提高果實自身的抗病性，作為一種生理調(diào)節(jié)劑具有延緩果實衰老等功能特性，對多種果實病害具有良好的防治效果。同時殼聚糖具有良好的自發(fā)成膜性，其所形成的選擇性半透膜可以阻止O2的進入，限制CO2的排出，降低果蔬呼吸強度，同時半透膜允許果實在貯存期間乙烯透過；并且可以阻礙果蔬的蒸騰作用，從而減少果蔬的失重。殼聚糖包膜處理也能夠顯著地抑制果皮色澤的轉變，減少果實腐爛發(fā)生與水分散失，保持果實較高硬度和VC含量，降低果實的失重率，延緩乙烯產(chǎn)生和呼吸代謝，降低果蒂部位病害發(fā)生。因此，殼聚糖包膜處理一方面在果實表面形成一層天然的屏障作用，避免或減少病原菌的浸染；另一方面可以通過調(diào)節(jié)果實生理代謝延遲果實貯藏期間的衰老，降低果實病害的發(fā)生。將J18抗菌蛋白與1%的用醋酸調(diào)至pH6. O的殼聚糖溶液復配成濃度為O. 05mg/mL的被膜劑，浸果使用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有的顯著效果為本發(fā)明對果實和農(nóng)作物病害有顯著的防治效果，是一種廣譜高效的蛋白制品，應用范圍廣等優(yōu)點。，尤其對梨采后黑斑病的防治有顯著效果，同時結合殼聚糖和保鮮紙的應用使防治更加有效。對梨輪紋病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病、黃瓜鐮刀霉、棉花黃萎病、小麥赤霉病、玉米小斑病、辣椒疫霉病等果實和農(nóng)作物病害也都有顯著的防治效果，是一株廣譜高效的拮抗菌株。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。所述枯草芽孢桿菌J18菌種編號為CGMCC No. 3665，菌種名稱枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis) J18。本發(fā)明一種由枯草芽孢桿菌J18分離純化的抗菌蛋白的制備方法，它包括以下步驟； J18抗菌蛋白的制備；種子活化將枯草芽孢桿菌J18菌株從保存的甘油菌轉接于LB液體培養(yǎng)基(其組分為胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉IOgjJc IOOOmL)中，于30°C、150_250rpm培養(yǎng)18h，得J18菌懸液。取培養(yǎng)好的菌懸液稀釋，均勻涂布到LB固體平板培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，水IOOOmL)中，25°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，用牙簽挑單菌落再次接種于LB液體培養(yǎng)基試管中，30°C、150-250rpm培養(yǎng)過夜，取5mL培養(yǎng)好的菌懸液轉接到裝有150mL LB液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中置搖床30°C振蕩培養(yǎng)，轉速為150-250rpm ;得活化的菌懸液。種子培養(yǎng)將活化的菌懸液接種到LB液體培養(yǎng)基中，150-250r/min，30°C搖床培養(yǎng) 16h。發(fā)酵培養(yǎng)使用30L發(fā)酵罐進行分批發(fā)酵；裝料系數(shù)O. 6 (18L)，接種量5%，發(fā)酵溫度30°C，通氣量O. 5m3/h,攪拌轉速150_250r/min，溶氧(DO)保持在75%左右，流加食用豆油消泡，PH 6. 8^7. 2，不流加調(diào)節(jié)pH值的酸堿性物質(zhì)。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為淀粉3g、蔗糖5g、硫酸錳30. 8mg/kg的溶液2mL、磷酸氫二鉀3g、磷酸二氫鉀1. 5g、豆柏30g，水1000mL。發(fā)酵周期34±2h。
取菌株J18發(fā)酵上清液經(jīng)O. 22 μ m孔徑的細菌過濾器過濾制成無菌濾液。取無菌濾液，采用(NH4)2SO4沉淀法提取,在硫酸銨梯度40-70%下，4°C下沉淀過夜,8，000r/min離心20min,沉淀用O. 05mol/L磷酸緩沖液(pH 7. O)懸浮，SepherdexG-25層析除鹽,真空冷凍干燥，獲得J18抗菌蛋白。被膜劑的制備。J18抗菌蛋白與1%的用醋酸調(diào)至pH6. O的殼聚糖溶液復配成濃度為O. 05mg/mL的被膜劑，即蛋白制品。應用時將梨果浸入被膜劑中5min后拿出，室溫下晾干?？咕ｕr紙的制備按照J18抗菌蛋白溶液體積與氧化淀粉溶液體積5:4的比例，取濃度為O. 05mg/mL的J18抗菌蛋白溶液300mL加入240mL氧化淀粉溶液混合均勻，得混合液，然后用毛刷將混合液均勻涂布于保·鮮紙或普通包裝紙上，室溫下晾干，得抗菌保鮮紙，即蛋白制品。所述氧化淀粉溶液的配制稱取160g可溶性淀粉，O. 96g高錳酸鉀，Sg氫氧化鈉，加入800mL水，加熱至90-95°C，持續(xù)攪拌20_30min，冷卻即得氧化淀粉溶液。應用時將抗菌保鮮紙包裝單個梨果或其它果品。J18抗菌蛋白制劑對梨采后黑斑病的防效采收后的梨果在O. 05mg/mL的J18抗菌蛋白與成膜性良好，具有很好保鮮效果的1%殼聚糖復配的溶液中浸果后，對梨黑斑病的防效達到87. 7%，且增加了果實表面的光澤，提高了梨果硬度，減少了果實長時間放置的失水現(xiàn)象，延長了梨果的貨架期。梨果包裝上涂布有O. 05mg/mL的J18抗菌蛋白的保鮮紙后，對梨黑斑病的防效為79. 25%，在一定程度上保證梨果的品質(zhì)，因此抗菌粗蛋白保鮮紙的應用也具有一定使用價值。同時J18抗菌蛋白制劑對梨輪紋病、葡萄灰霉病、黃瓜鐮刀霉等都有顯著的防治效果，其中被膜劑和抗菌保鮮紙對梨輪紋病的防效分別為80. 37%和78. 58%，對葡萄灰霉病的防效分別為78. 94%和77. 41%，對黃瓜鐮刀霉的防效分別為76. 37%和74. 4%。
權利要求
1.一種由枯草芽孢桿菌J18分離純化的抗菌蛋白的制備方法，所述枯草芽孢桿菌J18菌種編號為CGMCC No. 3665，菌種名稱枯草芽孢桿菌(Bacillussubstilis) J18，其特征是它包括以下步驟； J18抗囷蛋白的制備； 種子活化將枯草芽孢桿菌J18菌株從保存的甘油菌轉接于LB液體培養(yǎng)基中，于30°C、150-250rpm培養(yǎng)18h，得J18菌懸液；取培養(yǎng)好的菌懸液稀釋，均勻涂布到LB固體平板培養(yǎng)基中，于25°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，用牙簽挑單菌落再次接種于LB液體培養(yǎng)基試管中，于30°C、150-250rpm培養(yǎng)過夜，取5mL培養(yǎng)好的菌懸液轉接到裝有150mL LB液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中置搖床30°C振蕩培養(yǎng)，轉速為150_250rpm ;得活化的菌懸液； 種子培養(yǎng)將活化的菌懸液接種到LB液體培養(yǎng)基中，150-250r/min，30°C搖床培養(yǎng)16h ； 發(fā)酵培養(yǎng)使用30L發(fā)酵罐進行分批發(fā)酵；裝料系數(shù)O. 6 (18L)，接種量5%，發(fā)酵溫度30°C，通氣量O. 5m3/h，攪拌轉速150_250r/min，溶氧(DO)保持在75%左右，流加食用豆油消泡，pH 6. 8^7. 2，不流加調(diào)節(jié)pH值的酸堿性物質(zhì)； 發(fā)酵培養(yǎng)基配方為淀粉3g、蔗糖5g、硫酸錳30. 8mg/kg的溶液2mL、磷酸氫二鉀3g、磷酸二氫鉀1. 5g、豆柏30g，水IOOOmL ； 發(fā)酵周期34±2h； 取菌株J18發(fā)酵上清液經(jīng)O. 22 μ m孔徑的細菌過濾器過濾制成無菌濾液；取無菌濾液，采用(NH4)2S04沉淀法提取，在硫酸銨梯度40-70%下，4°C下沉淀過夜，8，000r/min離心20min,沉淀用O. 05mol/L磷酸緩沖液(pH 7. O)懸浮，SepherdexG-25層析除鹽,真空冷凍干燥，獲得J18抗菌蛋白； 所述LB液體培養(yǎng)基的組分為胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉IOg和水IOOOmL ； 所述LB固體平板培養(yǎng)基的組分為胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊脂15g和水 IOOOmL。
2.使用權利要求1中J18抗菌蛋白制備的蛋白制品，其特征是所述蛋白制品為被膜劑或抗菌保鮮紙。
3.如權利要求2所述的J18抗菌蛋白制備的蛋白制品的方法，其特征是所述被膜劑的制備方法包括以下步驟 將J18抗菌蛋白與1%的用醋酸調(diào)至pH6. O的殼聚糖溶液復配成濃度為0. 05mg/mL的被膜劑，即蛋白制品。
4.如權利要求2所述的J18抗菌蛋白制備蛋白制品的方法，其特征是所述抗菌保鮮紙的制備方法包括以下步驟 按照J18抗菌蛋白溶液體積與氧化淀粉溶液體積5:4的比例，取濃度為0. 05mg/mL的J18抗菌蛋白溶液300mL加入240mL氧化淀粉溶液混合均勻，得混合液，然后用毛刷將混合液均勻涂布于保鮮紙或普通包裝紙上，室溫下晾干，得抗菌保鮮紙，即蛋白制品； 所述氧化淀粉溶液的配制稱取160g可溶性淀粉，0. 96g高錳酸鉀，Sg氫氧化鈉，加入800mL水，加熱至90-95 °C，持續(xù)攪拌20_30min，冷卻即得氧化淀粉溶液。
5.權利要求1或2所述的由枯草芽孢桿菌J18分離純化的蛋白制品在防治果實和農(nóng)作物病害中的應用。
6.權利要求1所述的由枯草芽孢桿菌J18分離純化的蛋白制品在防治梨輪紋病、葡萄灰霉病和黃瓜鐮刀霉中的應用。
7.權利要求1所述的由枯草芽孢桿菌J18分離純化的蛋白制品在防治梨采后黑斑病的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由枯草芽孢桿菌J18分離純化的抗菌蛋白、蛋白制品、制備方法及應用，所述枯草芽孢桿菌J18菌種編號為CGMCC No.3665，菌種名稱枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)J18，所述蛋白制品的制備方法為將J18抗菌蛋白與1%的用醋酸調(diào)至pH6.0的殼聚糖溶液復配成濃度為0.05mg/mL的被膜劑，用于浸果，也可將J18抗菌蛋白溶液與氧化淀粉溶液混合后涂于保鮮紙，制成抗菌保鮮紙用于包果，本發(fā)明它對果實和農(nóng)作物病害有顯著的防治效果，尤其對梨采后黑斑病的防治有顯著效果，是一株廣譜高效的拮抗菌株。
文檔編號C12P21/02GK103045704SQ20121045483
公開日2013年4月17日 申請日期2012年11月14日 優(yōu)先權日2012年11月14日
發(fā)明者宋水山, 宋聰, 賈振華, 黃亞麗, 馬宏, 李惠榮 申請人:河北省科學院生物研究所